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- El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera
- La identificación y aislamiento de Slow división de las células de glioblastoma humano utilizando carboxi fluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)
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Articles by Loic P. Deleyrolle in JoVE
JoVE Neuroscience
El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences
Este protocolo de vídeo se muestra el aislamiento y la expansión de las células madre como de mutliforme resecado quirúrgicamente de glioblastoma humano (GBM) del tejido tumoral usando el método de ensayo de cultivo neuroesfera.
JoVE Clinical and Translational Medicine
La identificación y aislamiento de Slow división de las células de glioblastoma humano utilizando carboxi fluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)
1Department of Neurosurgery, The University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran
Este protocolo de video demuestra la aplicación de el colorante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para la identificación y separación de los diferentes sub-poblaciones de células de glioblastoma humano en base de la frecuencia de la división celular.
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El Aislamiento, La Expansión Y Diferenciación De La Madre Adultas De Mamífero Y Las Células Progenitoras Neuronales Utilizando El Ensayo De Neuroesfera
Durante el desarrollo y continuar hasta la edad adulta, las células madre funcionan como un reservorio de tipos de células no diferenciadas, cuyo papel es apoyar a la génesis de células en varios tejidos y órganos. En el adulto, que juegan un papel homeostático esencial mediante la sustitución de células diferenciadas que se han perdido debido a la rotación fisiológica, lesión o enfermedad. El descubrimiento de estas células de mamíferos adultos en el sistema nervioso central (SNC), un órgano tradicionalmente se cree que tienen la capacidad regenerativa de poco o nada, ha abierto la puerta a la posibilidad de diseñar innovadoras terapias regenerativas, un concepto inesperado en la neurobiología de hace 15 años. En 1992, para la detección de células precursoras en el cerebro adulto, se empleó un sistema de cultivo libre de suero mediante el cual la mayoría de las células primarias del sistema nervioso central diferenciados, pero no sobrevivió a una pequeña población de células que responden al EGF se mantuvieron en un estado indiferenciado y proliferaron para formar grupos, llamados neuroesferas (Reynolds y Weiss, Ciencia 255:1707-1710, 1992). Estos neuroesferas podría ser (a) para formar numerosos disociado esferas secundarias o (b) inducidas a diferenciarse, generando los tipos tres principales células del SNC. En este capítulo se describe la metodología de los mamíferos adultos la cultura y el Consejo de Seguridad Nacional ofrece detalles técnicos del ensayo neuroesfera para lograr culturas reproducibles.
Identificar Y Enumerar Células Troncales Nerviosas: Aplicación De Envejecimiento Y Cáncer
El descubrimiento de células madre en el sistema nervioso central adulto implicaba la posibilidad de reparación endógena y exógena terapias basadas en células. El desarrollo de protocolos experimentales, como el ensayo neuroesfera y el ensayo de células neuronales formadoras de colonias, permiten la investigación precisa y significativa de las propiedades de células madre neurales y permitir la exploración de los mecanismos relacionados con el papel de las células madre neurales en el envejecimiento y el cáncer.
Determinación De La Somática Y El Cáncer De Células Madre Auto-renovación De Tasa De División Simétrica Mediante Ensayos De Esfera
En representación de una fuente renovable para el reemplazo de células, las células madre neurales han recibido una atención considerable en los últimos años. El ensayo neuroesfera representa un método para detectar la presencia de células madre neuronales, sin embargo debido a una deficiencia de marcadores específicos y definitiva para identificarlos, su cuantificación y la tasa de expansión que todavía es indefinido. Aquí proponemos una interpretación matemática de la prueba neuroesfera permitiendo la medición real de la frecuencia de células madre neurales división simétrica. El algoritmo de la modelización muestra una correlación directa entre la expansión total de la célula veces con el tiempo medido en el ensayo de esfera y las células madre tasa expanda a través de la división simétrica. El modelo ofrece una metodología para evaluar específicamente el efecto de las enfermedades y los tratamientos sobre la actividad de células madre neurales y función. No sólo proporciona nuevos conocimientos en la evaluación de las características cinéticas de las células madre neuronales, nuestro modelo contempla además la biología del cáncer, como cáncer, tales como células madre se han sugerido para mantener el crecimiento del tumor, las células madre somáticas mantener la homeostasis del tejido. En efecto, la resistencia de células madre del tumor a la terapia hace que estas células una meta necesaria para un tratamiento eficaz. El modelo de ensayo de neuroesfera matemática que aquí se presenta permite la evaluación de la tasa malignas como células madre a través de ampliar la división simétrica y la evaluación de los efectos de la terapéutica en la actividad de auto-renovación y proliferación de esta población clínicamente relevantes que impulsan el crecimiento del tumor y la recidiva.
La Evidencia De Etiquetas De Retención De Las Células Iniciadoras Del Tumor En El Glioblastoma Humano
Las células individuales tumorales muestran diversos comportamientos funcionales en términos de la tasa de proliferación, las interacciones célula-célula, el potencial metastásico y la sensibilidad a la terapia. Además, los estudios de secuenciación han demostrado niveles sorprendentes de diversidad genética entre individuales tumores de los pacientes del mismo tipo. La heterogeneidad del tumor representa un reto terapéutico significativo como diversos tipos de células de un tumor puede responder de manera diferente a las terapias, y entre pacientes heterogeneidad puede prevenir el desarrollo de tratamientos para el cáncer en general. Una estrategia que puede ayudar a superar la heterogeneidad del tumor es la identificación de tumores sub-poblaciones que conducen a patologías específicas de la enfermedad para el desarrollo de terapias dirigidas a estas clínicamente relevantes sub-poblaciones. En este caso, hemos identificado una población del cerebro medio de contraste de retención de tumor que muestra todas las características de un tumor que inicia el sub-población. El uso de un ensayo de dilución limitante del trasplante en ratones inmunodeprimidos, retención de etiqueta las células tumorales del cerebro muestran elevados de la iniciación del tumor, las propiedades en relación con la población mayor. Es importante destacar que los tumores generados a partir de estas células de retención de etiquetas exhiben todas las características patológicas de la enfermedad primaria. En conjunto, estos hallazgos confirman tinte de retención de tumor en el cerebro las células del tumor exposición a la iniciación capacidad y por lo tanto, son objetivos viables para el desarrollo de terapias dirigidas a este subgrupo de población.
Aislamiento Y Caracterización De Células Madre Neurales Adultas
Se ha pensado durante mucho tiempo que el cerebro adulto es incapaz de generar nuevas neuronas, o que las neuronas no se puede añadir a su circuitería compleja. Sin embargo, la tecnología reciente ha dado lugar a una explosión de investigaciones que demuestran que la neurogénesis, o el nacimiento de nuevas neuronas a partir de células madre adultas constitutivamente se produce en dos regiones específicas del cerebro de los mamíferos, a saber la zona subventricular y el giro dentado del hipocampo. Sistema nervioso central adulto las células madre presentan tres características principales: (1) que son "auto-renovación", es decir, poseen una capacidad teóricamente ilimitada para producir una progenie indistinguible de sí mismos, (2) son de proliferación (mitosis) y (3) que son multipotentes para los diferentes linajes neuroectodérmicos del SNC, incluyendo los diferentes subtipos neuronales, y gliales. SNC las células madre y todos los tipos de células progenitoras son en general como "precursores". En este capítulo se describen los métodos para identificar, aislar y manipular experimentalmente las células madre del cerebro adulto. Nos explican como preparar un cultivo de células precursoras de tejido cerebral ingenuo y cómo probar la "troncalidad" potencial de los diferentes tipos de células presentes en esa cultura, que se realiza en un paradigma de tres pasos. A raíz de su aislamiento, células madre / progenitoras se expanden en la cultura neuroesfera. Las células individuales obtenidos a partir de estas neuroesferas se clasifican para la expresión de marcadores de superficie por citometría de flujo. Por último, las células madre putativa de clasificación de células se somete a la llamada ensayo neuronal de células formadoras de colonias, que permite la discriminación entre el vástago y las células progenitoras. Al final de este capítulo también se describe cómo identificar las células madre neurales in vivo.
Purificación De Células Neuronales Inmaduras De La Progenie De Células Madre Neurales
A gran escala la proliferación y de múltiples linajes capacidades de diferenciación que las células madre neurales (NSC) una prometedora fuente renovable de células para aplicaciones terapéuticas. Sin embargo, la aplicación práctica para la sustitución de las células neuronales se limita por la heterogeneidad de la progenie NSC, rendimiento relativamente bajo de las neuronas, predominio de los astrocitos, pobre supervivencia de las células del donante tras el trasplante y la propensión a la proliferación incontrolada de las células precursoras. Para superar estos obstáculos, hemos desarrollado un método para la generación de altamente enriquecido neuronas inmaduras de murina progenie NSC. Adaptación del procedimiento estándar diferenciación en concierto con la selección de citometría de flujo, utilizando luz dispersada y la selección positiva luz fluorescente basado en unión de los anticuerpos de la superficie celular, proporcionan una cerca puro (97%) población de neuronas inmaduras. Usando las neuronas purificadas, seleccionados de un panel de factores de crecimiento y se encontró que la proteína morfogenética ósea-4 (BMP-4) demostró un efecto de supervivencia fuerte sobre las células in vitro, y mejorado su madurez funcional. Este efecto se mantuvo tras el trasplante en el cuerpo estriado del ratón adulto, donde se observó un aumento de 2 veces en la supervivencia de las células implantadas y un aumento de 3 veces en la expresión NeuN. Adicionalmente, basado en el neural formadoras de colonias ensayo de células (N-ACCP), se observó una reducción de 64 veces de la frecuencia de buena fe NSC en la población de células neuronales y que las células implantadas donantes no mostró signos de proliferación excesiva o incontrolada. La capacidad de proporcionar definidas las poblaciones de células neurales a partir de fuentes renovables como el Consejo de Seguridad Nacional puede encontrar aplicación de terapias de reemplazo celular en el sistema nervioso central.
YB-1 Puentes Células Madre Neurales Del Cerebro Y Que Inician El Tumor Células a Través De Su Papel En La Diferenciación Y Crecimiento Celular
La proteína S-caja de unión 1 (YB-1) está regulada en muchos tumores humanos, incluyendo glioblastoma (GBM). También es esencial para el desarrollo normal del cerebro, lo que sugiere que YB-1 es parte de una célula madre neurales (NSC) de la red. Aquí, mostramos que el YB-1 fue altamente expresado en la zona subventricular (SVZ) de los tejidos fetales de cerebro de ratón pero no en la diferenciación terminal astrocitos primarios. Por el contrario, YB-1 knockout mice había reducido Sox-2, nestina, y Musashi-1 de expresión en la SVZ. A pesar de primaria neuroesferas murinos eran ricos en YB-1, su expresión se había perdido durante la diferenciación glial. A menudo los tumores gliales expresan marcadores de NSC y tienden a perder el control de la diferenciación celular que gobierna, por lo tanto, si nos dirigimos a YB-1 tuvo un papel similar en las células cancerosas. YB-1, Sox-2, Musashi-1, Bmi-1, y de forma coordinada nestina se expresa en las células y SF188 9.9 GBM paciente derivado primario del cerebro que inician un tumor de células (BTIC). Silenciamiento de YB-1 con siRNA atenuó la expresión de estos marcadores, el crecimiento del NSC neuroesfera reducida, y provocó la pérdida de la diferenciación a través de coordenadas de GSK3-β. Además, la diferenciación de BTIC con 1% morfogenética ósea suero o proteína-4 suprimida YB-1 expresión de la proteína. Del mismo modo, YB-1 de expresión se perdió durante la diferenciación de las normales NSCs humanos. De acuerdo con estas observaciones, YB-1 incremento en la expresión con el grado tumoral (n = 49 casos). YB-1 se coexpresó también con Bmi-1 (Spearman 0,80, P> 0,001) y los Medias Rojas 2-(Spearman 0,66, P> 0,001) basado en el análisis de 282 casos de gliomas de alto grado. Estas proteínas fueron altamente expresado en el 10/15 (67%) de los pacientes con GBM que, posteriormente, una recaída. En conclusión, el YB-1 expresa correlativamente con marcadores Consejo de Seguridad Nacional en el que funciona para promover el crecimiento celular e inhiben la diferenciación.
