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Articles by Lubov T. Timchenko in JoVE
JoVE General
Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux
Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine
Ce protocole décrit une technique rapide pour quantifier la translocation de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique des cellules par cytométrie en flux.
Other articles by Lubov T. Timchenko on PubMed
La Calréticuline Interagit Avec Les ARNm C/EBPalpha Et C/EBPbeta Et Réprime La Traduction Des Protéines C/EBP
Nous avons déjà identifié une protéine de liaison du RNA, CUGBP1, qui se lie aux répétitions GCN situées dans la région 5' des ARNm C/EBPbeta et régule la traduction des isoformes de la C/EBPbeta. Afin d'étudier le rôle des protéines de liaison ARN dans la régulation post-transcriptionnelle de protéines C/EBP, nous avons purifié supplémentaires protéines de liaison ARN qui interagissent avec l'ARN riche en GC et qui peut réglementer l'ARN. Dans les cellules HeLa, la majorité des protéines liant le RNA riches en GC est associée par endogènes ARN transcrits. La séparation de ces protéines de RNA endogène a identifié plusieurs protéines en plus CUGBP1 qui interagir spécifiquement avec la région riche en GC 5' de l'ARNm de C/EBPbeta. Une de ces protéines a été purifiée jusqu'à homogénéité et a été identifiée comme la calréticuline (CRT). CRT est une protéine multifonctionnelle impliquée dans plusieurs processus biologiques, notamment l'interaction avec et règlement de traitement d'ARN du virus de la rubéole. Nos résultats démontrent que les CUGBP1 et les CRT interagissent avec répétitions GCU dans myotonin protéine kinase et avec GCN répétitions au sein de l'ARNm C/EBPalpha et C/EBPbeta. GCN se répète au sein de ces structures de SL mRNAs forme stables. L'interaction du CRT avec structures SL C/EBPbeta et ARNm C/EBPalpha conduit à l'inhibition de la traduction des protéines C/EBP in vitro et in vivo. Destructions ou mutations abolissant la formation des structures SL C/EBPalpha et ARNm C/EBPbeta causer une défaillance du CRT pour inhiber la traduction des protéines C/EBP. Inhibition de la CRT-dépendante du C/EBPalpha est suffisante pour bloquer l'activité inhibitrice à la croissance de C/EBPalpha. Cela trouver autre définit le mécanisme moléculaire pour régulation post-transcriptionnelle des protéines C/EBPalpha et C/EBPbeta.
La Surexpression De La CUG Triplet Repeat-protéine, CUGBP1, Chez Les Souris Inhibe La Myogenèse
Accumulation d'ARN CUG répète dans la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) patients permet l'induction d'une protéine liant le CUG, CUGBP1, ce qui augmente la traduction de plusieurs protéines qui sont nécessaires pour la myogenèse. Dans cet article, nous examinons le rôle de la surexpression de CUGBP1 en pathologie musculaire de DM1 en utilisant des souris transgéniques qui surexpriment CUGBP1 dans le muscle squelettique. Nos résultats démontrent que l'élévation de CUGBP1 dans le muscle squelettique provoque la surexpression de MEF2A et p21 à des niveaux nettement supérieurs à ceux dans le muscle squelettique des animaux de type sauvage. On observe une induction semblable de ces protéines dans le muscle squelettique des patients DM1 avec des niveaux accrus de CUGBP1. Immunohistologie analyse a montré que le muscle squelettique de souris surexprimant CUGBP1 se caractérise par un retard de développement, la dystrophie musculaire et la régénération-interrupteur : l'augmentation de fibres lente/oxydation et la réduction des fibres rapides. Examen des mécanismes moléculaires par lesquels CUGBP1 up-régule MEF2A montre que CUGBP1 augmente la traduction de MEF2A via une interaction directe avec le réseau d'écocivisme répète situé au sein de l'ARNm MEF2A. Nos résultats suggèrent que la surexpression de CUGBP1 par l'intermédiaire de MEF2A et p21 inhibe la myogenèse et contribue au développement d'une déficience musculaire chez les patients DM1.
RNA CUG-binding Protein 1 Augmente La Traduction De 20 KDa Isoforme De Bêta Protéine Fef/enhancer-liaison En Interagissant Avec Les Sous-unités Alpha Et Bêta Du Facteur D'initiation Eucaryote Traduction 2
Expression d'une isoforme de 20 kDa négative dominante de fef/enhancer-binding protein (C/EBPbeta), lèvre, augmente dans le foie proliférantes et dans les cellules tumorales. Deux protéines de liaison à l'ARN, CUGBP1 et la calréticuline, ont été impliqués dans la régulation traductionnelle de C/EBPbeta. Dans cet article, nous présentons des preuves montrant plusieurs étapes critiques par laquelle translation du foie augmente de lèvre après hépatectomie partielle. Stades précoces après hépatectomie partielle, foie active CUGBP1 par une hyperphosphorylée. Le CUGBP1 activé se lie à la région 5' de l'ARNm de C/EBPbeta et remplace la calréticuline, qui réprime partiellement traduction de C/EBPbeta dans le foie quiescente. La hyperphosphorylée CUGBP1 interagit aussi avec les sous-unités alpha et bêta d'initiation facteur eIF2. Nos résultats démontrent que l'interaction de CUGBP1 avec l'eIF2alpha améliore l'association des CUGBP1 de ribosomes et est corrélée avec la traduction accrue de lèvre dans le foie après hépatectomie partielle. Nos résultats soutiennent l'hypothèse que CUGBP1 augmente la traduction des lèvres par l'interaction avec la sous-unité eIF2alpha. Cela facilite le recrutement d'un plus grand nombre de ribosomes pour lancer la traduction de la lèvre.
Selon L'âge CUGBP1-eIF2 Complexe Augmente La Traduction De Bêta Protéine Fef/enhancer-reliure Dans Le Foie De Vieux
La protéine de liaison à l'ARN CUGBP1 régule la traduction des protéines dans une variété de processus biologiques. Dans cette étude, nous montrons que vieillissement foie augmente CUGBP1 activités translationnelles par induction d'un complexe de protéines de haut poids moléculaire de CUGBP1. Le complexe contient CUGBP1, sous-unités alpha, bêta et gamma de l'initiation traduction facteur eIF2 et quatre protéines du réticulum endoplasmique, eR90, CRT, eR60 et Grp78. L'induction du complexe CUGBP1-eIF2 dans vieux foie est associé liée l'élévation des niveaux de protéine de CUGBP1 et à l'hyper-phosphorylation de CUGBP1 par une cycline kinase cdk4-D3, activité qui augmente avec l'âge. Nous avons examiné le rôle de l'élévation du CUGBP1 et du rôle de la cycline D3-cdk4-mediated phosphorylation de CUGBP1 dans la formation du complexe CUGBP1-eIF2 en utilisant des souris transgéniques CUGBP1 et jeunes animaux exprimant des niveaux élevés de cycline D3 après injection avec la cycline D3 plasmide. Ces études ont montré que les deux l'augmentation des niveaux de CUGBP1 et cdk4-hyper-phosphorylation médiée par des CUGBP1 sont impliqués dans l'induction lié à l'âge du complexe CUGBP1-eIF2. Le complexe CUGBP1-eIF2 se lie à l'ARNm C/EBPbeta dans le foie des vieux animaux et cette liaison est en corrélation avec les quantités accrues de protéine activatrice enrichi de foie et foie-enrichi de protéine inhibitrice. Conformément à ces observations, le complexe CUGBP1-eIF2 purifié se lie à la région 5' de l'ARNm de C/EBPbeta et augmente considérablement la traduction des trois isoformes de C/EBPbeta dans un système de traduction acellulaire, dans des cellules cultivées et dans le foie. Ainsi, ces études ont montré que l'induction par âge du complexe CUGBP1-eIF2 change traduction de C/EBPbeta dans le vieux foie.
L'expression Ectopique De Cycline D3 Corrige La Différenciation Des Myoblastes DM1 Grâce à L'activation De La Protéine De Liaison ARN CUG, CUGBP1
Différenciation des myocytes est altérée chez les patients atteints de dystrophie myotonique de type 1, DM1. CUG répéter binding protein, CUGBP1, est un important régulateur de la traduction des protéines qui sont impliqués dans la différenciation et le développement musculaire. Dans cet article, nous présentons des preuves qu'activité de liaison à l'ARN de CUGBP1 et de ses interactions avec initiation traduction complexe eIF2 sont différemment réglementées au cours de la myogenèse par phosphorylation spécifique et que le présent règlement est altéré en DM1. Dans les myoblastes normaux, Akt kinase phosphoryle CUGBP1 à Ser28 et augmente les interactions de CUGBP1 avec la cycline D1 ARNm. Au cours de la différenciation, CUGBP1 est phosphorylé par cyclinD3-cdk4/6 à Ser302, ce qui augmente la CUGBP1 liaison avec p21 et ARNm C/EBPbeta. Cycline D3 et cdk4 sont élevées dans les myotubes normaux ; Cellules de différenciation DM1 n'augmentent pas ces protéines. Dans les myotubes normaux, CUGBP1 interagit avec la cycline D3/cdk4/6 et eIF2 ; Cependant, les interactions de CUGBP1 avec eIF2 sont réduites dans les cellules de différenciation DM1 et corrèlent avec la différenciation musculaire avec facultés affaiblies en DM1. L'expression ectopique de cycline D3 dans les cellules DM1 augmente le complexe CUGBP1-eIF2, corrige l'expression des marqueurs de différenciation, myogénine et desmine et améliore la fusion des myoblastes DM1. Ainsi, la normalisation de la cycline D3 peut être une approche thérapeutique pour corriger la différenciation du muscle squelettique chez les patients DM1.
Expression D'ARN CCUG Reprend La Traduction De Dysregulates Et De La Dégradation Des Protéines Chez Les Patients De La Dystrophie Myotonique 2
La dystrophie myotonique 2 (DM2) est une maladie multisystémique de muscle squelettique causée par une expansion de tétranucléotidiques que GoMC se répète, la transcription qui entraîne l'accumulation d'ARN non traduit de CCUG. Dans cette étude, les auteurs rapportent que CCUG se répète tous les deux se lient aux et misregulate les fonctions biologiques des complexes multiprotéiques cytoplasmiques. Deux complexes interagissant avec CCUG ont été ensuite purifiés et analysés. Une composante majeure de l'un des complexes s'est avérée pour être le cœur catalytique 20 s complexes du protéasome. Le second complexe a été trouvé pour contenir des protéines de liaison à l'ARN répéter CUG triplet 1 (CUGBP1) et l'initiation de la traduction du facteur eIF2. Compatible avec les fonctions biologiques du protéasome 20 s et les complexes CUGBP1-eIF2, la stabilité des protéines de courte durées et les niveaux des cibles translationnelles de CUGBP1 apparaissaient être élevée dans les myoblastes DM2. Nous avons constaté que la surexpression de CCUG se répète dans les myoblastes humains provenant de patients affectés, dans les myoblastes C2C12, et dans une souris DM2 modèle altère traduction des protéines et la dégradation, semblable à des altérations observées chez les patients de DM2. Pris ensemble, ces résultats montrent que RNA CCUG répète misregulate renouvellement des protéines tant au niveau de la traduction et de la dégradation de la protéine induite par le protéasome.
Répétitions CCUG Réduisent Le Taux De Synthèse Protéique Globale Dans La Dystrophie Myotonique De Type 2
Expansion de non-codage CTG et GoMC se répète dans la région 3' UTR du gène myotonin protéine kinase (MDPK) dans la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) et dans l'intron 1 du Zinc Finger Protein 9 (ZNF9) dans la dystrophie myotonique de type 2 (DM2) représentent les mutations non codantes typiques qui causent les maladies principalement par le biais de transdominant effet sur le métabolisme du RNA (épissage, traduction et la stabilité de la RNA). Le mécanisme de gain de fonction de RNA communément reconnu de DM1 et DM2 suggère que le mutant CUG et CCUG RNAs jouent un rôle essentiel dans la dystrophie myotonique (DMs) sans un rôle important de HEPATO et ZNF9. Des études récentes ont montré que la pathogenèse moléculaire de DM2 implique également le produit de la protéine du gène ZNF9. CCUG répétitions réduisent ZNF9 protéine, un régulateur traductionnel des voies (en haut) terminal oligo-pyrimidine mRNAs codant des protéines, des appareils de translational. Ainsi, dans les cellules de DM2, expansion de CCUG répète affecte non seulement plusieurs ARN, mais aussi vers le bas-régule ZNF9 qui à son tour réduit la traduction de l'ARNm contenant du haut et diminue le taux de synthèse protéique globale. Dans cette revue, nous discutons du rôle de l'expansion de CCUG répétitions dans la réduction de la régulation du taux de synthèse des protéines en DM2 et les conséquences de cette réduction dans le phénotype multisystémique de DM2 ZNF9.
