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Articles by Lubov T. Timchenko in JoVE
JoVE General
フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定
Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine
このプロトコルは、フローサイトメトリーにより細胞質から細胞の形質膜へのGLUT4のトランスロケーションを定量化するために迅速なテクニックを説明します。
Other articles by Lubov T. Timchenko on PubMed
カルレティキュリンは、C/EBPalpha と C/ebp Mrna と対話し、C/EBP タンパク質の翻訳を抑制します。
我々 は、以前は RNA 結合タンパク質, CUGBP1 は C/ebp Mrna の 5' 領域内にある GCN 繰り返しに結合し、C/ebp アイソ フォームの翻訳を調節する識別。転写後のコントロール C/EBP 蛋白質の RNA 結合タンパク質の役割をさらに調査するには、その GC 豊富な Rna との対話し、は、RNA プロセシングを調節する可能性があります追加の RNA 結合タンパク質を精製しました。HeLa 細胞で GC 豊富な RNA 結合蛋白質の大半は内因性 RNA 転写産物が関連付けられています。これらのタンパク質の分離内因性 RNA から具体的に GC 豊富な 5' 領域 C/ebp mRNA の対話 CUGBP1 に加えていくつかのタンパク質を識別しました。これらの蛋白質の 1 つは、同質性に浄化された、カルレティキュリン (CRT) として識別されました。CRT との相互作用と風疹ウイルス RNA 処理の規制などを含む、いくつかの生物学的過程に関与する多機能タンパク質です。我々 のデータは、CUGBP1 と CRT の両方 GCU 繰り返し myotonin 蛋白質キナーゼ内でおよび GCN 繰り返し C/EBPalpha と C/ebp Mrna 内とやり取りすることを示しています。GCN これら Mrna フォーム安定 SL 構造内で繰り返されます。CRT C/ebp と C/EBPalpha Mrna の SL の構造と相互作用蛋白質 C/EBP in vitro および in vivo での翻訳の抑制に します。削除または廃止 C/EBPalpha と C/ebp Mrna 内 SL 構造の形成変異 C/EBP タンパク質の翻訳を阻害するには、CRT の失敗に します。C/EBPalpha の CRT 依存抑制は C/EBPalpha の成長阻害活性をブロックするのに十分です。このそれ以上を見つけるには、C/EBPalpha と C/ebp タンパク質の転写後調節の分子機構を定義します。
CUG トリプレット反復部結合タンパク質, CUGBP1, マウスでの過剰発現筋形成を阻害します。
RNA CUG の蓄積筋強直性ジストロフィーのタイプで 1 (DM1) 患者リード cug リピートと結合タンパク質, 翻訳筋形成のために必要ないくつかのタンパク質の増加 CUGBP1 の誘導に繰り返されます。本稿では, CUGBP1 の過剰発現 CUGBP1 骨格筋のノザン トランスジェニック マウスを用いた DM1 筋病理の役割を調べる。我々 のデータは、CUGBP1 の標高骨格筋 MEF2A と野生型動物の骨格筋のそれらより有意に高いレベルに p21 の発現を引き起こすことを示しています。これらのタンパク質の類似誘導 DM1 患者の骨格筋 CUGBP1 の増加レベルで観察されます。免疫組織学的解析を示した CUGBP1 の発現によるから骨格筋発育遅延、筋ジストロフィー、筋線維型スイッチによって特徴付けられること： 遅い/酸化繊維と高速繊維の削減の増加します。CUGBP1 アップ - CUGBP1 MEF2A の翻訳 GCN と直接相互作用を介して増加すること MEF2A ショー調節の分子機構の検討 MEF2A mRNA 内にあるを繰り返します。MEF2A の CUGBP1 を介した過剰発現私達のデータ提案して p21 と筋形成を阻害する DM1 患者における筋欠乏症の開発に貢献します。
CUG RNA 結合蛋白質 1 20 KDa のアイソ フォームの CCAAT/エンハンサー結合タンパク質のベータ版の翻訳は、真核生物翻訳因子 2 α と β サブユニットとの相互作用によって増加します。
支配の負 20 kDa のアイソ フォーム CCAAT/エンハンサー結合蛋白質 (C/ebp) 唇の発現と腫瘍細胞増殖の肝臓で増加しています。2 つの RNA 結合蛋白質 CUGBP1 とカルレティキュリン、C/ebp の並進運動の調節に関与しています。によってどの唇の肝臓の増加翻訳肝部分切除後のいくつかの重要な手順を示す証拠を提案する.肝切除後の初期の段階で肝臓 CUGBP1 によってタウをアクティブにします。活性化 CUGBP1 C/ebp mRNA の 5' 領域にバインドし、C/ebp の翻訳静止肝における部分的に抑制するカルレティキュリンを置き換えます。過リン酸化 CUGBP1 の開始因子 eIF2 α と β サブユニットとも相互に影響します。我々 のデータ、eIF2alpha と CUGBP1 の相互作用がリボゾームと CUGBP1 の関連付けを高め、リップ肝における肝部分切除後の増加の翻訳と相関することを示しています。我々 のデータは CUGBP1 リップの翻訳 eIF2alpha サブユニットとの相互作用によって増加すること仮説を支持します。これは、唇の翻訳を開始するのにはリボゾームの大きい番号の後続の募集を促進します。
特定の年齢 CUGBP1 EIF2 コンプレックス CCAAT/エンハンサー結合タンパク質ベータ古い肝臓での翻訳が増加します。
RNA 結合タンパク質 CUGBP1 の種々 の生物学的プロセスにおけるタンパク質の翻訳を調節します。本研究では, 肝臓の老化 CUGBP1 並進活動による CUGBP1 の高分子量タンパク質複合体の誘導が増加した. します。複雑なには CUGBP1、サブユニット アルファ、ベータ、および開始翻訳因子 eIF2 ガンマと小胞体、eR90、CRT、eR60、および Grp78 の 4 個の蛋白質が含まれています。CUGBP1-eIF2 コンプレックスの古い肝臓の誘導蛋白質蛋白質 CUGBP1 のレベルの標高とハイパー リン酸 CUGBP1 の活性が年齢とともに増加はサイクリン D3 cdk4 キナーゼによる関連付けです。CUGBP1 トランスジェニック マウスおよびサイクリン D3 の高レベルを表現する D3 プラスミド サイクリンと注射後の若い動物を使用して、CUGBP1 の標高とサイクリン D3 cdk4 を介するのリン酸化 CUGBP1 CUGBP1 eIF2 複合体の形成での役割の役割を調べた。これらの研究は、両方の CUGBP1 の増加されたレベルと cdk4 を介したハイパー-リン酸化 CUGBP1 CUGBP1 eIF2 コンプレックスの加齢に伴う誘導に関与していることを示した。CUGBP1-eIF2 コンプレックス C/ebp mRNA の古い動物とこのバインドと関連づけ肝臓濃縮活性剤蛋白質そして肝臓濃縮阻害蛋白質の増加量と肝臓でバインドされています。これらの所見と整合して、精製 CUGBP1 eIF2 コンプレックス C/ebp mRNA の 5' 領域にバインドして無細胞翻訳システム、培養細胞および肝臓 C/ebp の 3 つのアイソ フォームの翻訳を大幅に向上します。したがって、これらの研究は、年齢を介する誘導 CUGBP1 eIF2 コンプレックスの古い肝臓における C/ebp の翻訳を変更することを示した。
サイクリン D3 の異所性発現 RNA CUG 結合蛋白質 CUGBP1 の活性化を介して DM1 筋芽細胞の分化を修正します。
筋強直性ジストロフィー 1 型 DM1 患者における心筋細胞の分化が障害されます。CUG リピート結合タンパク質、CUGBP1、筋肉と分化に関与しているタンパク質の翻訳の主レギュレータです。証拠 CUGBP1 の RNA 結合活性とその相互作用を開始翻訳複雑 eIF2 は差動の筋形成中に特定のリン酸化によって規制されて、この規制 DM1 で改ざんを提案する.正常筋芽細胞における Akt キナーゼ CUGBP1 Ser28 でし D1 mRNA のサイクリンと CUGBP1 の相互作用を増加します。分化中に CUGBP1 によって cyclinD3-cdk4/6 CUGBP1 バインディング p21 と C/ebp Mrna が増加 Ser302 でリン酸化されます。D3 と cdk4 サイクリンながら普通乏しくの高架です。DM1 差別化細胞では、これらのタンパク質は増加しません。通常の乏しく、CUGBP1 サイクリン D3/cdk4/6 と eIF2 対話;ただし、eIF2 と CUGBP1 の相互作用は DM1 差別化細胞で減らし、DM1 における障害者の筋分化と相関します。DM1 細胞におけるサイクリン D3 の異所性発現 CUGBP1 eIF2 コンプレックスが増加、式の分化マーカー、myogenin とデスミン、修正および DM1 筋芽細胞の融合を高めます。したがって、正規化サイクリン D3 の DM1 患者の骨格筋の分化を修正する治療上のアプローチがあります。
RNA CCUG の発現において翻訳と 2 筋強直性ジストロフィー患者における蛋白質の分解を繰り返します。
筋強直性ジストロフィー 2 （DM2） 配列を繰り返し、tetranucleotide の転写は無変換 CCUG RNA の蓄積の結果の拡大によって引き起こされるマルチ システム ・骨格筋疾患です。本研究では, CCUG 両方をバインドおよび細胞質多蛋白質複合体の生物学的機能を misregulate 繰り返されることを報告します。2 つの CCUG の相互作用の複合体は、その後精製、分析されました。錯体の 1 つの主要なコンポーネントは、20 代の触媒中心をことが判明したプロテアソームの複雑な。2 番目の複合体が発見された CUG トリプレット リピート RNA 結合蛋白質を含む 1 （CUGBP1） と翻訳開始因子 eIF2。生物機能 CUGBP1 eIF2 錯体と 20 s プロテアソームの一貫性のある、短命蛋白質の安定性と CUGBP1 の並進運動目標のレベルことが示された DM2 筋芽細胞で高められます。我々 は人間の筋芽細胞 C2C12 筋芽細胞での影響を受けない患者からの CCUG の過剰発現を繰り返し DM2 マウスのタンパク質翻訳と劣化、DM2 の患者で観測された変化に類似したモデルを変化させる発見しました。一緒に取られて、RNA CCUG 繰り返されるこれらの調査結果を見る misregulate 蛋白質の転換翻訳とプロテアソームを介するタンパク質分解のレベルに。
CCUG 繰り返しグローバル タンパク質合成筋強直性ジストロフィーのタイプ 2 の率を減らします。
非コーディング CTG と配列の拡大を繰り返すの 3' UTR 筋強直性ジストロフィーにおける myotonin 蛋白質キナーゼ (DMPK) 遺伝子のタイプ 1 (DM1) とイントロン 1 亜鉛フィンガー蛋白質 9 (znf9 は帽子) 筋強直性ジストロフィーのタイプので、病気を引き起こす典型的な非コーディングの変異 2 （DM2） を表す transdominant RNA の代謝に及ぼす主にを通じて (スプライシング、翻訳と RNA の安定性)。DM1 と DM2 の一般に認められた RNA 機能獲得機構変異の CUG と CCUG Rna 筋強直性ジストロフィー (DMs) で重要な役割なしの DMPK とは znf9 遺伝子の重要な役割を再生することを示唆しています。最近の研究は、DM2 の分子病因がまたは znf9 遺伝子の遺伝子の蛋白質の製品を含む示されています。CCUG 繰り返しは znf9 遺伝子蛋白質、タンパク質翻訳装置のエンコーディング ターミナル oligo ピリミジン管 (TOP) Mrna の並進レギュレータを減らします。したがって、DM2 のセル CCUG の拡大に影響を与える繰り返されますない複数 Rna だけしかしまたダウンの調節ターンでトップを含む Mrna の翻訳を減らし、グローバル蛋白合成速度の減少は znf9 遺伝子。このレビューでは、CCUG の繰り返しは znf9 遺伝子を介した規制 DM2 の蛋白合成速度と全身の表現型 DM2 のこの減少の結果の削減の拡大の役割を議論します。
