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Articles by Lukas Burger in JoVE
JoVE General
PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN
1Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, 2Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 3Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 4Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 5Genomics Resource Center, Rockefeller University
Transcripciones de ARN están sujetas a numerosas normas posttranscriptional que está mediada por una multitud de trans-acción ARN-proteínas de unión (prácticas comerciales restrictivas). Aquí presentamos un método generalizable para identificar con precisión y en una escala de transcriptoma en todo los sitios de unión a ARN de las prácticas comerciales restrictivas.
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Predicción Precisa De Las Interacciones Proteína-proteína De Alineaciones De La Secuencia Utilizando Un Método Bayesiano
Predicción exacta y a gran escala de las interacciones proteína-proteína directamente en secuencias de aminoácidos es uno de los grandes retos en biología computacional. Aquí presentamos un nuevo método de red bayesiana que predice a partners de interacción usando sólo varias alineaciones de secuencias de aminoácidos de dominios proteicos de interacción, sin parámetros regulables y sin necesidad de ningún ejemplo de formación. Primero aplicamos el método a los sistemas de dos componentes bacterianos y comprensivo reconstruir redes de señalización de dos componentes a través de todas las bacterias secuenciadas. Las comparaciones de nuestras predicciones con interacciones conocidas muestran que nuestro método deduce a socios en todo el genoma de la interacción con alta exactitud. Para demostrar la aplicabilidad general de nuestro método mostramos que predice exactamente también socios de interacción en un conjunto de datos reciente del grupo Sintasas. Análisis de la señalización de dos componentes de todo el genoma predicha redes muestra eso cognados (pares quinasa/regulador interacción, que se encuentran adyacentes en el genoma) y los huérfanos (que se encuentran aislados) forman dos componentes relativamente independientes de la red de señalización en cada genoma. Además, mientras que la mayoría de los genes se prevé que sólo un pequeño número de socios de interacción, encontramos que el 10% de los huérfanos forman una clase aparte de nodos de 'hub' que distribuir e integrar las señales a y de hasta decenas de socios de interacción diferentes.
Desenredante Directo De Coevolución Indirecto De Residuos En Los Alineamientos De Proteína
Predecir la estructura de la proteína de la secuencia primaria es uno de los retos más en biología computacional. Dada la gran cantidad de datos disponibles de la secuencia, el análisis de coevolución, es decir, dependencia estadística, entre columnas en los alineamientos múltiples de secuencias de proteínas dominio sigue siendo una de las avenidas más prometedores para la predicción de residuos que están en contacto con en la estructura. Un obstáculo clave para este enfoque es que también se observan fuertes dependencias estadísticas para muchos pares de residuos que son distales en la estructura. Mediante un análisis exhaustivo de dominios proteicos con estructuras tridimensionales disponibles mostramos que coevolucione contacto muy comúnmente con las cadenas de la forma que filtrarse a través de la estructura de la proteína, induciendo dependencias estadísticas indirectas entre muchos pares distales de residuos. Caracterizamos las distribuciones de longitud y distancia espacial que viajó por estas cadenas de contactos co-evoluciona y mostrar que explican gran parte de las dependencias estadísticas observadas entre pares estructuralmente distales. Nos adaptamos a un modelo de red bayesiana recientemente desarrollado en un procedimiento riguroso para desenmarañar directo de dependencias estadísticas indirectas, y demostramos que este método no sólo logra con éxito esta tarea, sino que también permite contactos con dependencia estadística débil para ser detectado. Para ilustrar cómo adicional información puede ser incorporado en nuestro método, incorporamos una corrección filogenética y desarrollamos un informativo antes de que tenga en cuenta que la probabilidad de que un par de residuos en contacto con depende fuertemente de su distancia de la secuencia primaria y la cantidad de conservación que exhiben las columnas correspondientes en la alineación múltiple. Demostramos que nuestro modelo incluyendo estas extensiones dramáticamente mejora la precisión de contacto predicción de alineaciones múltiples de la secuencia.
Transcriptoma En Toda La Identificación De La Proteína De Unión Al ARN Y Los Sitios De Destino MicroARN Por PAR-CLIP
Las transcripciones de ARN están sujetos a la regulación de genes postranscripcional que participaron cientos de ARN-proteínas de unión a las prácticas comerciales restrictivas () y que contienen complejos de microARN-ribonucleoproteína (miRNPs) expresados en forma de células de tipo dependiente. Hemos desarrollado un enfoque reticulación a base de células para determinar en alta resolución y en todo el transcriptoma de los sitios de unión de las prácticas comerciales restrictivas y miRNPs celulares. Los sitios reticuladas son reveladas por timidina a las transiciones de citidina en los ADNc preparadas a partir de immunopurified RNPs de 4-tiouridina células tratadas. Se determinaron los sitios de unión y las consecuencias reglamentarias para varias prácticas comerciales restrictivas intensamente estudiados y miRNPs, incluyendo PUM2, QKI, IGF2BP1 3, AGO/EIF2C1-4 y TNRC6A-C. Nuestro estudio reveló que estos factores se unen miles de sitios que contengan la secuencia de motivos definidos y tienen distintas preferencias de exonic contra intrónica o codificación en comparación con las regiones no traducidas de transcripción. La asignación exacta de los sitios de unión de todo el transcriptoma será fundamental para la interpretación de los datos que emergen rápidamente sobre la variación genética entre los individuos y cómo estas variaciones contribuyen a enfermedades genéticas complejas.
Un Análisis Cuantitativo De Los Métodos CLIP Para Identificar Sitios De Unión De Proteínas De Unión De ARN
Cross-linking e inmunoprecipitación (CLIP) se utiliza cada vez más a mapa de sitios de unión de todo el transcriptoma de proteínas de unión de ARN. Hemos desarrollado un método para el análisis de datos CLIP y aplicado para comparar el CLIP con photoactivatable mejorada ribonucleósido CLIP (CLIP PAR) y para descubrir cómo las diferencias en la digestión de cross-linking y ribonucleasa afectan los sitios identificados. Encontramos sólo pequeñas diferencias en la precisión de estos métodos en la identificación de sitios de unión de HuR, que se une a secuencias de baja complejidad, y 2 Argonaute, que tiene una especificidad de Unión compleja. Encontramos que las mutaciones inducidas por Cruz-link llevaron a la resolución de nucleótido para PAR-CLIP y CLIP. Nuestros resultados confirman la expectativa de las publicaciones originales de CLIP que proteínas de unión de ARN no protegen a sus sitios de Unión suficientemente en las condiciones de desnaturalización utilizadas durante el procedimiento CLIP, y mostramos que extensa digestión con secuencia específica RNasas predispone fuertemente los sitios de Unión recuperados. Este sesgo se puede reducir sustancialmente por condiciones más suaves de digestión de Nucleasa.
Factores De Unión Al ADN De La Forma Del Metiloma De Ratón En Regiones Reguladoras Distales
La metilación de cytosines es una modificación epigenética esencial en genomas mamíferos, sin embargo, las normas que rigen los patrones de metilación permanecen en gran parte fuera de alcance. Para obtener información sobre este proceso, hemos generado methylomes base-par-resolución ratón en células madre y trasplante de precursores neuronales. Análisis cuantitativo avanzado había identificado regiones bajo-metilados (LMRs) con una metilación promedio del 30%. Éstos representan las regiones reguladoras distales CpG-pobres según lo evidenciado por ubicación, ADNasa I hipersensibilidad, presencia de marcas de cromatina potenciador y actividad de potenciador en reportero ensayos. LMRs están ocupados por factores de unión al ADN y su unión es necesaria y suficiente para crear los LMRs. Una comparación de neuronal y células madre methylomes confirma esta dependencia, como célula-tipo-específicas LMRs están ocupados por factores de transcripción de la célula-tipo-específicas. Este estudio proporciona metiloma referencias para el ratón y muestra que factores de unión al ADN localmente influyen en la metilación del ADN, lo que permite la identificación de las regiones reguladoras activas.
