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Articles by Lyle A. Simmons in JoVE
JoVE General
Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis
Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan-Ann Arbor
Un protocolo detallado se describe para la formación de imágenes en tiempo real de los complejos de reparación del ADN en
Other articles by Lyle A. Simmons on PubMed
El Alelo DnaAcos De Escherichia Coli: Iniciación Hiperactivo Es Causado Por La Sustitución De A184V Y Y271H, Lo Que Resulta Defectuoso En El Control De La Replicación Del ADN ATP Binding Y Aberrante
La replicación del ADN cromosómico se regula en el nivel de compromiso con esta vía bioquímica. En E. coli, la proteína DnaA parece regular este proceso. Una forma mutante, DnaAcos, llevando cuatro sustituciones de aminoácidos, es aparentemente defectuoso en la respuesta a las señales de regulación, debido a que induce la iniciación hiperactivo desde el origen de replicación bacteriano (oriC). En este informe, el fenotipo de iniciación hiperactivo se demuestra que es el resultado de dos sustituciones de aminoácidos específicos. Un (A184V) inmediatamente adyacente a un Walker un cuadro (P motivo de bucle) causa un defecto en la unión del ATP (Carr y Kaguni, 1996, Mol Microbiol 20: 1307-1318). La segunda sustitución de aminoácido (Y271H) parece estabilizar la actividad de la proteína mutante llevar a la sustitución A184V. La proteína mutante llevar a ambas sustituciones de aminoácidos (A184V + Y271H) es defectuoso en la modulación de la frecuencia de iniciación de oriC, como se demostró por análisis de frecuencia de marcador oriC y un locus cerca del extremo de replicación. Estos resultados indican que un defecto en los resultados de unión a ATP en el control aberrante de la replicación del ADN.
La Proteína DnaA De Escherichia Coli: Oligomerización En El Origen Cromosómico De E. Coli Se Requiere Para La Iniciación E Implica Específicas N-terminal De Aminoácidos
Iteradas secuencias caja DnaA dentro de los orígenes de replicación de bacterias y plásmidos procarióticos son reconocidos por el iniciador de la replicación, la proteína DnaA. En el origen cromosómico de E. coli, oriC, DnaA se especula que oligomerize para iniciar la replicación del ADN. Hemos desarrollado un ensayo de la formación de oligómeros en oriC que se basa en la complementación entre los dos alelos DnaA que han estado inactivas por sí mismos. Un alelo es dnaA46; su inactividad a la temperatura no permisiva es debido a un defecto específico en unión a ATP. El segundo alelo, T435K, no es compatible con la replicación del ADN, debido a su incapacidad para unirse a secuencias caja DnaA en oriC. Se demuestra que el alelo T435K puede complementar el dnaA46 (Ts) alelo. Los resultados apoyan un modelo de formación de oligómeros en la que las secuencias de DnaA caja de oriC están obligados por DnaA46 que T435K se une a formar un complejo activo. Basándose en este ensayo, leucina 5, 6 triptófano y cisteína 9 en una hélice alfa predice fueron identificados que, cuando se altera, interferir con la formación de oligómeros. La glutamina 8 es adicionalmente necesario para la formación de oligómero en un plásmido que contiene oriC, lo que sugiere que la estructura del complejo DnaA-oriC en el locus cromosómico oriC es similar pero no idéntico al montado en un plásmido. Otra evidencia sugiere que la prolina 28 de DnaA está involucrado en el reclutamiento de DnaB de oriC. Estos resultados proporcionan evidencia directa de que la oligomerización DnaA en oriC se requiere para la iniciación a ocurrir.
Hyperinitiation De Replicación Del ADN En E. Coli Conduce Al Colapso De Replicación Tenedor Y Inviabilidad
Elevada expresión dnaA de un plásmido multicopia induce iniciación más frecuente desde el origen de replicación de Escherichia coli, oriC, pero se mantiene la viabilidad. En comparación, dnaAcos cromosómicamente codificadas también estimula la iniciación, pero esto es letal. Por los métodos cuantitativos, nos muestran que el nivel de iniciación inducida por la elevada expresión de dnaA conduce a las horquillas de replicación colapsadas que son en su mayoría dentro de 10 unidades de mapeo de oriC. Debido a que las horquillas colapsar al azar, los complejos de nucleoproteína en sitios específicos, como los datos no son la causa. Cuando se reinicie la replicación está bloqueada por una mutación en recB o PriA, el aumento de las iniciaciones a través de una elevada expresión dnaA causas inviabilidad. La cantidad de horquillas colapsados es sustancialmente mayor en virtud de una elevada expresión de dnaAcos comparación con la de dnaA. Se propone que el fenotipo letal de dnaAcos cromosómicamente codificadas es un resultado de hyperinitiation que supera la capacidad de reparación de la célula.
Una De Las Funciones Esenciales De Triptófano De Escherichia Coli La Proteína DnaA En Oligomerización En El Origen De Replicación De E. Coli
En la iniciación de la replicación del ADN bacteriano, proteína DnaA recluta helicasa DnaB al origen cromosómico, oriC, que conduce a la ensamblar de la maquinaria de replicación tenedor en este sitio. Debido a una región cerca del término N de DnaA se requiere para la auto-oligomerización y la carga de DnaB helicasa en oriC, se pregunta si estas funciones son separables o interdependientes sustituyendo muchos aminoácidos conservados en esta región con alanina para identificar los residuos esenciales. Se demuestra que la sustitución de alanina de leucina 3, fenilalanina 46, leucina y 62 no afectan a la función de DnaA en la iniciación. Por el contrario, nos encontramos en la caracterización de un mutante DnaA que el triptófano 6 es esencial para la función DnaA debido a que su sustitución por alanina anula la auto-oligomerización, resultando en la imposibilidad de cargar DnaB en oriC. Estos resultados indican que DnaA unido a formas Oric una estructura específica oligomérica, que se requiere para cargar helicasa DnaB.
De La Familia Y-ADN Polimerasas Responder a Los Daños En El ADN Independiente De Inhibición De La Progresión De Replicación Tenedor
En Escherichia coli, las ADN polimerasas de la familia Y-Pol IV (DinB) y Pol V (UmuD2'C) aumentar la supervivencia celular frente a un daño en el ADN por traspasar el bloqueo de la replicación de las lesiones del ADN. Se presenta una función única para estas polimerasas en la replicación del ADN progresión de tenedor es arrestado no por daños en el ADN exógeno, pero con hidroxiurea (HU), lo cual inhibe la ribonucleótido reductasa, y provocando daños estancamiento independiente de la replicación del ADN. Sorprendentemente, el umuC122 :: Tn5 alelo de UmuC, DinB, y ciertas formas de productos de los genes umuD dotar a E. coli con la capacidad de soportar el tratamiento HU (HUR). Las actividades catalíticas de la UmuC122 y las proteínas se DinB tanto se requiere para HUR. Por otra parte, la letalidad provocada por tales las horquillas de replicación estancadas en los derivados de tipo salvaje que parece proceder a través de los pares de toxina / antitoxina mazEF y relBE. Esta nueva función pone de manifiesto el papel de polimerasas de la familia Y-en la mejora de la supervivencia celular en condiciones de privación de nucleótidos, además de sus funciones establecidas en la respuesta al daño del ADN.
La Replicación Es Necesaria Para La Localización De Respuesta Al Daño Del ADN Reca En Bacillus Subtilis
En tanto en procariotas y eucariotas, las proteínas implicadas en la reparación del ADN a menudo se organizan en complejos de varios componentes que pueden ser visualizados como focos en las células vivas. Se utilizó una fusión de Reca-GFP para examinar las señales subcelulares que directa Reca-GFP para montar como focos en respuesta al daño del ADN. Se han utilizado dos métodos diferentes para inhibir la iniciación de la replicación del ADN y se determinó que la replicación del ADN se requiere para la celda para establecer RecA GFP focos después de la exposición a agentes que dañan el ADN. Además, el uso de escisión de endonucleasa de generar un sitio específico de doble hebra al demostraron que la maquinaria de replicación (replisoma) y la síntesis de ADN se requieren para el montaje de RecA-GFP focos durante la reparación de una rotura de doble hebra. Hemos supervisado los niveles celulares de RecA y se encontró que la formación de enfoque no requiere la inducción adicional de los niveles de proteína, lo que sugiere que los focos resultado de una redistribución de la proteína existente para los sitios de daño encontrada por el replisoma. En conjunto, nuestros resultados apoyan el modelo que la proteína RecA existente ha sido contratado para ssDNA generado por el replisoma en los sitios de daño en el ADN. Estos resultados proporcionan información sobre los mecanismos que utiliza la célula para reclutar las proteínas de reparación del ADN dañado en las células vivas.
Múltiples Orthologues Ku Mediar ADN De Extremos No Homólogos a Participar En La Forma De Vida Libre Y Durante La Infección Crónica De Sinorhizobium Meliloti
La bacteria de extremos no homólogos a participar (NHEJ) aparato es un sistema de dos componentes que utiliza Ku y LigD para reparar el ADN de doble hebra se rompe. Aunque el mecanismo de reacción ha sido ampliamente estudiado, se sabe mucho menos sobre el papel fisiológico de NHEJ bacteriana. Estudios recientes sugieren que NHEJ actúa bajo condiciones en donde se reduce la replicación del ADN o ausente (como en una fase de espora o estacionaria). Curiosamente, los genes que codifican Ku y LigD han sido identificados en una amplia gama de bacterias que pueden infectar crónicamente huéspedes eucarióticos. Sorprendentemente, Sinohizobium meliloti, un simbionte intracelular de las plantas leguminosas, lleva cuatro genes que codifican homólogos Ku (sku1 de sku4). Supresión análisis de los genes sku indicó que todos los homólogos Ku son funcionales. Uno de estos genes, sku2, está fuertemente expresado en células de vida libre, así como en las células bacteroides que residen en el interior de la planta huésped. Para visualizar el aparato NHEJ in vivo, la proteína SKu2 fue fusionado a la proteína amarilla fluorescente (YFP). La radiación ionizante (IR) inducida por la formación foco de SKu2-YFP en la vida libre de células de una manera dosis-dependiente. Por otra parte, SKu2-YFP focos formó en respuesta a la IR de que no se dividen bacteroides, lo que indica que el sistema NHEJ es funcional, incluso durante la fase de infección crónica de la simbiosis.
Abrazadera Beta Dirige Localización De Reparación De Genes En Bacillus Subtilis
Homólogos MutS funcionar en varias rutas celulares que incluyen la reparación de apareamientos erróneos (MMR), el proceso por el cual los desajustes introducidos durante la replicación del ADN se han corregido. Se demuestra que el extremo C de Bacillus subtilis MutS es necesaria para una interacción con la abrazadera beta. Esta interacción es necesaria para la formación de foco MutS-GFP en respuesta a los desajustes. Recíprocamente, se muestra que un mutante de la pinza beta hace que las frecuencias elevadas de mutación y se reduce la formación de foco MutS-GFP. MutS mutantes defectuosos para la interacción con pinza beta no para apoyar el siguiente paso de la vacuna MMR, MutL-GFP formación de foco. Se concluye que la interacción entre MutS y beta es el mayor interacción molecular facilitar la formación de foco y que las ayudas abrazadera beta en la estabilización de MutS a un desajuste en vivo. La capacidad notable de la terminal C a la formación de MutS atención directa a replisomes por sí mismo, sugiere que es un reconocimiento que otorga licencias a la interacción desajuste MutS con pinza beta.
Las Proteasas Clp Y Lon Ocupar Diferentes Posiciones Subcelulares En Bacillus Subtilis
Entre otras funciones, el ATP-dependientes de las proteasas degradan las proteínas mal plegadas y eliminar varias proteínas clave reguladoras necesarias para activar las respuestas de estrés. En Bacillus subtilis, ClpX, ECPB y CLPC ATPasas homohexameric forma que se acoplan a la peptidasa ClpP. Para entender donde estas peptidasas y ATPasas localizar en células vivas, cada proteína se fusionó a un resto fluorescente. Se encontró que ClpX-GFP (proteína verde fluorescente) y ClpP GFP-localizada en las asambleas de coordinación en áreas que no fueron ocupados por el nucleoide. Hemos encontrado que el porcentaje de células con ClpP-GFP focos aumentó choque térmico siguiente manera independiente de la síntesis de proteínas. Se determinó que ECPB-YFP (proteína fluorescente de color amarillo) y CPLC YFP formado focos coincidentes con los bordes nucleoide, por lo general cerca de los polos celulares. Además, hemos encontrado que ClpQ-YFP (HslV) localizada como los focos pequeños, generalmente situadas cerca de la membrana celular. Hemos encontrado que ClpQ-YFP focos eran dependientes de la presencia del cognado ClpY hexamérica ATPasa (HslU). Además, hemos encontrado que Lona-GFP es coincidente con el nucleoide durante el crecimiento normal y que Lona-GFP también localizado en el preespora durante el desarrollo. También se investigó LonB-GFP y encontró que esta proteína localizada en la membrana preespora temprano en el desarrollo, seguido por la localización en todo el preespora más adelante en el desarrollo. Nuestro estudio se ha demostrado que en B. subtilis varias proteasas ATP como combustible ocupan distintas localizaciones subcelulares. Con estos datos, se sugiere que la especificidad de sustrato se pudo determinar, en parte, por la organización espacial y temporal de las proteasas en vivo.
Comparación De Las Respuestas a Doble Filamento Se Rompe Entre Escherichia Coli Y Bacillus Subtilis Revela Requisitos Diferentes Para La Inducción SOS
De ADN de doble hebra se rompe son las lesiones particularmente nocivos que pueden conducir a la inestabilidad genómica y la muerte celular. Se investigó la respuesta SOS de doble filamento se rompe, tanto en Escherichia coli y Bacillus subtilis. En E. coli, doble filamento se rompe inducidos por la radiación ionizante como resultado la inducción de SOS en prácticamente todas las células. Cepas de E. coli incapaces de inducción SOS fueron sensibles a la radiación ionizante. En notable contraste, se encontró que en B. subtilis tanto la radiación ionizante y al sitio-específico de doble hebra provoca la inducción de profago PBSX y expresión de genes en SOS sólo una pequeña subpoblación de células. Estos resultados muestran que la doble cadena se rompe provocan mundial inducción SOS en E. coli pero no en B. subtilis. Sorprendentemente, Reca-GFP formación de enfoque fue casi idéntico siguiente reto radiaciones ionizantes tanto en E. coli y B. subtilis, lo que demuestra que la formación de Reca-GFP focos se produce en respuesta a las rupturas de doble filamento, pero no exige, ni dar lugar a la inducción de SOS en B. subtilis. Además, hemos encontrado que B. subtilis incapaces de inducir SOS células tenían cerca de tipo salvaje niveles de supervivencia en respuesta a la radiación ionizante. Por otra parte, B. subtilis RECN contribuye a mantener bajos niveles de inducción de SOS en la doble cadena de reparación de descanso. Así, se encontró que la contribución de la inducción SOS a doble filamento romper la reparación difiere sustancialmente entre E. coli y B. subtilis.
Sinorhizobium Meliloti CpdR1 Es Crítica Para El Coordinador De La Progresión Del Ciclo Celular Y La Infección Crónica Simbiótica
ATP impulsada por proteolisis juega un papel importante en la regulación de las respuestas de las células bacterianas ciclo, el desarrollo y el estrés. En la simbiosis nitro-fijación con plantas hospedantes, Sinorhizobium meliloti, se somete a una profunda diferenciación celular, incluyendo endorreduplicación de la OME. Los mecanismos de regulación que rigen las alteraciones del ciclo celular de S. meliloti en la planta son en gran parte desconocido. Aquí, se presenta la caracterización de los dos homólogos, los CPDR cpdR1 y cpdR2, de S. meliloti que codifican un solo dominio de los reguladores de respuesta. En Caulobacter crescentus, CPDR controla la localización polar de la proteasa ClpXP, con lo que la mediación de la proteólisis regulada de proteínas clave (s), tales como Ctra., implicado en la progresión del ciclo celular. El S. meliloti cpdR1 nulo mutante puede invadir el citoplasma de acogida, sin embargo, las bacterias intracelulares no son capaces de diferenciarse en bacteroides. Se demuestra que S. meliloti CpdR1 tiene un patrón de localización polar y un papel en el posicionamiento ClpX similar a C. crescentus CPDR, lo que sugiere una función conservada de las proteínas CPDR entre los alfa-proteobacterias. Sin embargo, en S. meliloti, de vida libre de las células del mutante nulo cpdR1 muestran una morfología llamativa de coccoids irregulares y la replicación de ADN aberrante. De este modo, se demuestra que CpdR1 media la coordinación de los eventos del ciclo celular, que son fundamentales tanto para la división de las células de vida libre y la diferenciación necesaria para la infección crónica intracelular.
La Hidroxiurea Induce Radical Hidroxilo Mediada Por La Muerte Celular En Escherichia Coli
La hidroxiurea (HU) inhibe específicamente la clase I de la ribonucleótido reductasa (RNR), el agotamiento de las piscinas dNTP y condujo al arresto de la replicación del tenedor. Aunque la inhibición de HU RNR es bien sabido, el mecanismo por el cual conduce a la muerte celular sigue siendo desconocido. Para investigar el mecanismo de muerte celular inducida por HU, se utilizó un enfoque de sistemas de nivel para determinar las respuestas genómicas y fisiológicos de E. coli a tratamiento con HU. Nuestros resultados sugieren un modelo por el cual el tratamiento HU induce rápidamente un conjunto de respuestas de protección frente a la inestabilidad genómica. Continúa la tensión HU activa la absorción de hierro y las toxinas MazF y RelE, cuya actividad causa la síntesis de proteínas incompleta traducidos y la estimulación de las respuestas al estrés de sobres. Estos efectos alterar las propiedades de una de terminales oxidasas de la célula del citocromo, causando un aumento en la producción de superóxido. El aumento de la producción de superóxido, junto con el aumento de la absorción de hierro, los combustibles de la formación de radicales hidroxilo que contribuyen a la muerte celular inducida por HU.
Las Mutaciones En La Pinza De Bacillus Subtilis Que Beta Separar Sus Funciones En La Replicación Del ADN De Reparación De Genes
La pinza beta es una abrazadera de replicación esencial deslizante requerido para la síntesis de ADN procesiva. La pinza beta es también un factor crítico para varios otros aspectos del metabolismo del ADN, incluyendo la reparación del ADN mismatch (MMR). El alelo dnaN5 de Bacillus subtilis codifica una forma mutante de la pinza beta que contiene la sustitución G73R. Las células con el alelo dnaN5 son sensibles a la temperatura para el crecimiento debido a un defecto en la replicación del ADN en 49 grados C, y muestran un aumento en la frecuencia de mutación causada por un defecto parcial en MMR a temperaturas permisivas. Se han seleccionado de los supresores de intragenic dnaN5 que rescataron viabilidad a 49 grados C para determinar si el defecto de replicación del ADN podría ser separado del defecto MMR. Se aislaron tres supresores intragénicos de dnaN5 que restauraron el crecimiento a la temperatura no permisiva manteniendo al mismo tiempo un aumento en la frecuencia de mutación. Los tres alelos DNAn codificada la sustitución G73R, junto con una de las tres nuevas mutaciones missense. Las mutaciones sin sentido aislados fueron S22P, S181G, y E346K. De éstos, S181G y E346K están situados cerca de la hendidura hidrófoba de la pinza beta, un sitio común ocupado por proteínas que se unen la pinza beta. Usando varios métodos, nos muestran que el incremento en la frecuencia de mutación que resulta de cada alelo DNAn está vinculada a un defecto en MMR. Por otra parte, encontramos que S181G E346K y permitió el crecimiento a temperaturas elevadas y no tienen un efecto apreciable en la frecuencia de mutación cuando se separa de G73R. Por lo tanto, hemos encontrado que los cambios de residuos específicos en la beta de B. subtilis abrazadera separar el papel de la pinza beta en la replicación del ADN de su papel en MMR.
Estructura De La Endonucleasa De Dominio De MutL: Sin Licencia Para Cortar
La reparación del ADN no coincide corrige los errores que se han escapado de la polimerasa corrección, el aumento de la replicación de la fidelidad 100 - 1000 veces en los organismos que van desde las bacterias hasta los seres humanos. La proteína MutL juega un papel central en la reparación de genes mediante la coordinación de múltiples interacciones proteína-proteína que la eliminación de la señal de cadena a partir del reconocimiento por la falta de coincidencia MutS. Aquí se presenta la estructura cristalina del dominio endonucleasa de Bacillus subtilis MutL. La estructura está organizada en la dimerización y subdominios reguladoras conectadas por una palanca helicoidal que abarca el motivo endonucleasa conservada. Adicionales del clúster motivos conservados alrededor de la palanca y definir un Zn (2 +)-sitio de unión que es fundamental para la función MutL in vivo. La estructura presenta un poderoso mecanismo de inhibición para evitar muescas no deseado de ADN recién replicado y nos permite proponer un modelo que describe cómo la interacción con MutS y la abrazadera procesividad podría autorizar la actividad endonucleasa de MutL. La estructura también proporciona un marco molecular para proponer y probar las funciones adicionales de MutL en la reparación de genes.
Papel De La Escherichia Coli YbeY, Una Proteína Altamente Conservada, En El RRNA Procesamiento
La familia de proteínas UPF0054 es altamente conservadas con homólogos presentes en casi todos los bacteria secuenciada. En algunas bacterias, el gen correspondiente es esencial, mientras que en otros sus resultados en la pérdida de un fenotipo altamente pleiotrópico. A pesar de detallados estudios estructurales, una función celular para esta familia de proteínas ha permanecido desconocida. Presentamos aquí que la supresión del homólogo de Escherichia coli, YbeY, causa defectos de huelga que afectan a la actividad de los ribosomas, la fidelidad y el montaje de traslación del ribosoma. Mapeo de 16S, 23S y 5S rRNA termini revela que YbeY influye la maduración de los tres rRNAs, con un efecto particularmente fuerte en la maduración en tanto la maduración y 5'-3'-fines de ARNr 16S, así como de la 5'- termini de rRNAs 23S y 5S. Además, demostramos fuertes interacciones genéticas entre ybeY y RNC (codificación RNasa III), ybeY y RNR (codificación RNasa R), y ybeY y PNP (codificación PNPasa), lo que sugiere un papel para YbeY en la maduración del ARNr. La mutación de aminoácidos muy conservadas en YbeY, permitió la identificación de dos residuos (H114, R59) que se encontraron para tener un efecto significativo en vivo. Se discuten las implicaciones de estos hallazgos para la maduración de ARNr y el ensamblaje de ribosomas de las bacterias.
El Daño Del ADN Y Especies Reactivas De Nitrógeno Son Barreras Para El Vibrio Cholerae Colonización Del Intestino Delgado De Ratón Lactante
La ingestión de Vibrio cholerae pasar por el estómago y colonizan el intestino delgado de su huésped. Aquí, mostramos que el V. cholerae requiere por lo menos dos tipos de sistemas de reparación del ADN para competir de manera eficiente para la colonización del intestino del ratón lactante. Estos resultados muestran que el V. cholerae experimenta aumentado el daño de ADN en el tracto gastrointestinal murino. Coincidiendo con esto, se demuestra que el paso por el intestino de ratón aumenta la frecuencia de mutación de V. cholerae en comparación con el pasaje de cultivo líquido. Nuestro análisis genético identifica conocidos y nuevos enzimas de defensa necesarios para la desintoxicación de las especies reactivas de nitrógeno (pero no las especies reactivas de oxígeno) que también son necesarios para el V. cholerae para colonizar eficientemente el intestino del ratón recién nacido, que apunta a especies reactivas de nitrógeno como la causa potencial de daño en el ADN . Se demuestra que los posibles especies reactivas de nitrógeno deletéreo para el V. cholerae no son generadas por inducible anfitrión óxido nítrico sintasa (iNOS) y la actividad en lugar se pueden derivar de nitrito acidificado en el estómago. Estar de acuerdo con esta hipótesis, se demuestra que las cepas deficientes en la reparación del ADN o la defensa nitrógeno reactivo especies que son defectuosos en la colonización intestinal se han reducido el crecimiento o aumento de la frecuencia de mutación en los medios que contienen nitritos acidificados. Por otra parte, hemos demostrado que neutralizar el ácido estomacal rescata el defecto de la colonización de la reparación del ADN y de nitrógeno reactivo especies mutantes defectuosos de defensa que sugieren una vía de defensa común de estos mutantes.
De Reparación De Genes Provoca La Liberación De La Dinámica De Una ADN Polimerasa Esencial Del Tenedor De Replicación
Reparación de apareamientos erróneos (MMR) corrige errores en el ADN polimerasa que se producen durante la replicación del genoma. MMR es crítico para el mantenimiento del genoma, y su pérdida aumenta las tasas de mutación varios cientos de veces. Trabajos recientes han demostrado que la interacción entre las proteínas MutS desajuste reconocimiento y la abrazadera de replicación procesividad es importante para MMR en Bacillus subtilis. Para entender mejor como MMR se acopla a la replicación del ADN, se analizó la localización subcelular de las proteínas de replicación del ADN y la MMR fusionados a la proteína verde fluorescente (GFP) en células vivas, a raíz de un aumento en los errores de replicación del ADN. Se demuestra que los focos de la polimerasa del ADN esencial dnaE-GFP incorporación desajuste disminución de seguir y que la pérdida de dnaE-GFP focos requiere MutS. Por otra parte, nos muestran que MutS y MutL unen dnaE in vitro, lo que sugiere que dnaE se acopla a la reparación. También se encontró que dnaE-GFP disminución de focos en vivo después de un daño en el DNA independiente de detención de la síntesis de ADN que muestra que la pérdida de dnaE-GFP focos es causada por perturbaciones en la replicación del ADN. Proponemos que MutS en contacto directo con la maquinaria de replicación del ADN, causando un cambio dinámico en la organización de dnaE en el tenedor de replicación durante la MMR. Nuestros resultados establecen una conexión sorprendente e íntimo entre la triple vírica y el complejo de la polimerasa del ADN de replicación in vivo.
