La Specificità Dell'interazione Tra Il Saccharomyces Cerevisiae Morsetto Fattore Di Replica Caricatore C E Innescato I Modelli Del DNA Durante La Replicazione Del DNA

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2002  |  Pubmed ID: 12370190

Fattore di replica C (RFC) catalizza Assemblea della circolare proliferazione cellulare antigene nucleare morsetti intorno DNA adescato, abilitazione processive sintesi di DNA polimerasi durante la riparazione e la replicazione del DNA. Per poter eseguire questa funzione in modo efficiente, RFC deve riconoscere rapidamente DNA primer come substrato per fissaggio, particolarmente durante la sintesi del filamento in ritardo di sviluppo. Precedenti relazioni così come gli esperimenti di legame del DNA quantitativa da questo studio indicano, tuttavia, che RFC interagisce con primer modello così come singolo - e double-stranded DNA (ssDNA e dsDNA, rispettivamente) con simili ad alta affinità (apparente K(d) circa 10 nm). Quindi come RFC possono distinguere adescate siti del DNA da eccesso ssDNA e dsDNA presso la forcella di replicazione? Un'ulteriore analisi rivela che nonostante la sua elevata affinità per le varie strutture del DNA, RFC seleziona primer-modello DNA anche in presenza di un eccesso di 50 volte di ssDNA e dsDNA. L'interazione tra ssDNA o dsDNA e RFC è molto meno stabile tra DNA adescato e RFC (k(off) > 0,2 s(-1) versus s(-1) 0.025, rispettivamente). Proponiamo che la capacità di rapidamente legare e rilasciare DNA a singolo e doppio filamento accoppiato con selettiva, stabile vincolante al DNA primer-modello consente RFC per la scansione del DNA in modo efficiente adescate siti dove è possibile mettere in pausa per avviare dispositivo di fissaggio.

Meccanismo Di Caricamento Di Escherichia Coli DNA Polimerasi III Beta Morsetto Sul DNA. Bona Fide Primer/Template Attivano Preferenzialmente La Gamma Complessa Di Idrolizzare ATP E Caricare Il Morsetto

The Journal of Biological Chemistry. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12519754

L'Escherichia coli caricatore morsetto complessi di DNA polimerasi III gamma assembla la beta a forma di anello scorrevole pinza sul DNA. La polimerasi di nucleo è legata al modello di beta, abilitazione processive replicazione del genoma. Qui indaghiamo la specificità di substrato del DNA della reazione del morsetto-caricamento misurando la cinetica del legame del DNA e idrolisi di ATP utilizzando allungamento-competente e carente DNA primer/template pre-steady-state. Il caricatore del morsetto con ATP-associazione Lega substrati di DNA allungamento-competente e carenti nella presenza o assenza di beta. Tuttavia, allungamento-abile DNA attiva preferenzialmente gamma complessa di rilasciare beta sul DNA con concomitante idrolisi di ATP. Legame al DNA di allungamento-abile converte la gamma complessa da uno stato ad alta affinità con ATP-associazione in uno stato associato a ADP avendo una 5-piega bassa affinità per il DNA. Analisi steady-state obbligatorie sono fuorvianti, suggerendo che gamma complessa si lega molto più avidamente al perentorio primer/template DNA perché riciclaggio per lo stato di legame ad alta affinità è la limitazione della velocità. Dati pre-steady-state rotazionale anisotropia rivelano una dinamica associazione-dissociazione della gamma complessa con estensibile primer/modelli che portano alla conclusione diametralmente opposta. Il riconoscimento dinamico fortemente favorito del DNA allungabile non richiede la presenza di beta. Così, la gamma complessa utilizza ATP binding e idrolisi come un meccanismo per modulando la sua interazione con il DNA in cui il modulo associato a ATP si lega con alta affinità per il DNA ma substrati DNA allungamento-abile attivano preferenzialmente idrolisi di ATP e la conversione in uno stato di bassa affinità.

Mancata Corrispondenza Di Stabilizzazione Riconoscimento-accoppiato Di Msh2-Msh6 in Uno Stato Di ATP-bound Presso L'iniziazione Di Riparazione Del DNA

Biochemistry. Jul, 2003  |  Pubmed ID: 12820877

Mancata corrispondenza riparazione proteine correggere gli errori nel DNA tramite un processo ATP-driven. Negli eucarioti, il complesso di Msh2-Msh6 riconosce appaiamento mismatch e piccoli inserimento/delezioni nel DNA e avvia la riparazione. Proteine sia Msh2 e Msh6 contengono motivi Walker ATP-binding che sono necessarie per l'attività di riparazione. Per comprendere come queste proteine coppia ATP binding e idrolisi al riconoscimento di associazione/disadattamento del DNA, è stata esaminata l'attività dell'atpasi di Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 condizioni pre-steady-state. Acido-quench esperimenti hanno rivelato che in assenza di DNA, Msh2-Msh6 idrolizza ATP rapidamente (burst rate = 3 s(-1) a 20 gradi C) e poi subisce un lento passo nel percorso che limita fatturato catalitico (k(cat) = 0.1 s(-1)). ATP è idrolizzato similmente in presenza di DNA duplex completamente abbinato; Tuttavia, in presenza di un disallineamento G:T o + T inserimento contenenti DNA, idrolisi dell'ATP è severamente repressa (tasso = 0.1 s(-1)). Esperimenti di impulso-chase ha rivelato che Msh2-Msh6 lega ATP rapidamente in assenza o in presenza di DNA (tasso = 0.1 microM(-1) s(-1)), che indica che per il DNA di Msh2-Msh6.mismatched complesso, un passo dopo l'associazione di ATP, ma prima o all'idrolisi dell'ATP è il passo nella via della limitazione della velocità. Così, riconoscimento di disadattamento è accoppiato ad un drammatico aumento del tempo di permanenza dell'ATP su Msh2-Msh6. Questo stato di ATP-bound mismatch-indotta, stabile di Msh2-Msh6 probabile segnala eventi a valle nella via della riparazione.

Sovrapproduzione E L'analisi Di Complessi Multiproteici Eucariotiche in Escherichia Coli Mediante Una Strategia Di Dual-vettore

Analytical Biochemistry. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12842110

Studi di biochimica delle proteine eucariotiche sono spesso limitati dalla scarsa disponibilità di questi complessi multicomponente, tipicamente grandi proteine in forma pura. Escherichia coli è un ospite comunemente utilizzato per la produzione di proteine su larga scala; Tuttavia, l'utilità per la produzione di proteina eucariotica è limitata a causa dei problemi associati con trascrizione, traduzione e corretto ripiegamento delle proteine. Qui descriviamo lo sviluppo e il collaudo dell'impianto, un vettore che affronta simultaneamente molti di questi problemi. Il vettore vegetale contiene un'unità di espressione controllata promotore T7, un p15A origine di replicazione e geni per la rara trasferimento RNAs e resistenza alla kanamicina. Così, il vettore di impianto può essere utilizzato in combinazione con il vettore dell'animale domestico di coesprimere più proteine in e. coli. Utilizzando questo approccio, abbiamo realizzato con successo milligrammi alta quantità di due complessi differenti Saccharomyces cerevisiae in e. coli: la proteina di riparazione del disadattamento heterodimeric Msh2-Msh6 (248kDa) e il fattore di replica cinque subunità C clamp loader (250 kDa). Analisi quantitative indicano che queste proteine sono pienamente attive, affermando l'utilità della pianta + pET-based produzione di proteine eucariotiche in e. coli per studi in vitro della loro struttura e funzione.

Fattore Di Replica C Morsetto Caricatore Subunità Disposizione All'interno Di Un Pentamero Circolare E I Suoi Punti Di Attacco Per L'antigene Nucleare Delle Cellule Di Proliferazione

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2003  |  Pubmed ID: 14530260

Fattore di replica C (RFC) è un heteropentameric AAA + proteina clamp loader del fattore di processivity antigene nucleare (PCNA) delle cellule proliferanti. L'omologo prokaryotic, gamma complessa, è anche un heteropentamer, e gli studi strutturali Visualizza che le subunità sono disposti in un cerchio. In questa relazione, Saccharomyces cerevisiae RFC protomers sono esaminati per la loro interazione con gli altri e PCNA. Il cavo di dati per un modello di subunità ordine intorno al cerchio. Una caratteristica di AAA + oligomeri è l'uso di siti di ATP bipartiti in cui una subunità fornisce un residuo di arginina catalitico per idrolisi di ATP legato per la subunità adiacente. Troviamo il complesso RFC(3/4) è un DNA-dipendente dell'ATPasi, che usiamo questa attività per determinare che RFC3 fornisce un catalitico arginina al sito ATP di RFC4. Questa informazione, unita con la disposizione di subunità, definisce la composizione dei restanti siti di ATP. Inoltre, sottoassiemi RFC(2/3) e RFC(3/4) legano stabilmente a PCNA, eppure né RFC2 né RFC4 associare strettamente a PCNA, indicando che RFC3 costituisce un forte punto di contatto di PCNA. La subunità RFC1 associa anche PCNA strettamente e identifichiamo due residui idrofobici in RFC1 che sono importanti per questa interazione. Pertanto, almeno due subunità nella RFC rendere forti contatti con PCNA, a differenza della gamma Escherichia coli complesso nel quale solo una subunità rende forte contatto con il morsetto di beta. Più forti punti di contatto di PCNA possono riflettere le esigenze extra di caricamento l'anello trimeric PCNA DNA confrontato con l'anello beta dimerica.

Le Funzioni Duale, Morsetto Di Apertura E Il Riconoscimento Di Primer-modello, Definiscono Una Subunità Di Caricatore Del Morsetto Chiave

Journal of Molecular Biology. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15364574

Morsetto caricatore proteine catalizzano Assemblea dei morsetti scorrevoli circolari sul DNA per attivare processive replicazione del DNA. Durante la reazione, il caricatore del morsetto lega DNA primer-modello e si posiziona al centro di un morsetto per formare un collegamento topologico tra i due. Morsetto caricatori sono multi-protein complessi, come il cinque proteina Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae e caricatori morsetto umana e le due proteine Pyrococcus furiosus e Methanobacterium thermoautotrophicum caricatori clamp, e finora i responsabili dell'associazione e selezionando primer-modello DNA come destinazione per fissaggio siti rimangono sconosciuti. Per risolvere questo problema, abbiamo analizzato l'interazione tra l'e. coli gamma complesso clamp loader e DNA mediante cross-linking del DNA-proteina indotta da UV e spettrometria di massa. I risultati mostrano che la subunità delta nella gamma complessa rende a stretto contatto con la giunzione primer-modello. Triptofano 279 nel dominio C-terminale delta si trova vicino il 3'-primer OH fine e può giocare un ruolo chiave nel riconoscimento dell'iniettore-modello. Studi precedenti hanno mostrato quello delta inoltre si lega e si apre la pinza beta (idrofobici residui nel dominio N-terminale del contatto beta delta. Il morsetto-associazione e siti di legame del DNA sul delta appaiono per facile entrata di primer-modello posizionati verso il centro della pinza e uscita del filo del modello dal complesso. Una simile analisi di RFC s complesso suggerisce che la funzionalità dual osservata per delta nella gamma complessa può essere vera anche per caricatori morsetto da altri organismi.

Asimmetrica ATP Binding E Idrolisi Attività Del Aquaticus Di Thermus MutS Dimero è Chiave Per La Modulazione Delle Sue Interazioni Con Il DNA Non Corrispondente

Biochemistry. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15476405

MutS procarioti e negli eucarioti Msh proteine riconoscono appaiamento mismatch e inserzioni o delezioni nel DNA e riparazione del disadattamento initiate. Queste proteine funzionano come dimeri (e forse di più alti ordine oligomeri) e possiedono un'attività ATPasi che è essenziale per la riparazione del DNA. Precedenti studi di Escherichia coli MutS e proteine eucariotiche di Msh2-Msh6 hanno rivelato asimmetria all'interno del dimero rispetto al legame del DNA sia le attività dell'ATPasi. Abbiamo trovato il aquaticus di Thermus proteina MutS suscettibili di indagine dettagliata della natura e del ruolo di questa asimmetria. Qui, ci mostrano che (a) in un MutS una subunità dimero (S1) associa nucleotide con alta affinità e l'altro (S2) con affinità 10 volte più deboli, (b) S1 idrolizza ATP rapidamente mentre S2 idrolizza ATP ad un tasso più lento di 30-50 volte, grippaggio del DNA (c) non corrispondente a MutS inibisce idrolisi dell'ATP a S1 ma continua la lenta idrolisi a S2 e (d) interazione tra il DNA non corrispondenti e il MutS è indebolito quando entrambe le subunità sono occupate da ATP, ma rimane stabile quando S1 è occupato da ATP e S2 dall'ADP. Questi risultati rivelano chiave MutS specie nella via dell'ATPasi; S1(ADP)-S2(ATP) si forma preferenzialmente in assenza di DNA o in presenza di DNA completamente abbinato, mentre S1(ATP)-S2(ATP) e S1(ATP)-S2(ADP) si formano preferenzialmente in presenza di DNA non corrispondente. Queste specie MutS presentano differenze nell'interazione con il DNA non corrispondente che sono probabilmente importanti per il meccanismo d'azione MutS nella riparazione del DNA.

Ruolo Di Un Residuo Di Glutammato Conservata Nel Meccanismo SecA Atpasi Di Escherichia Coli

The Journal of Biological Chemistry. Apr, 2005  |  Pubmed ID: 15710614

Escherichia coli SecA utilizza ATP per guidare il trasporto delle proteine attraverso le membrane cellulari. Glutammato 210 il motivo "Marta" Walker B del sito SecA ATP-associazione è stata proposta come base catalitica per idrolisi dell'ATP (Hunt, J. F., Weinkauf, S., Henry, L., Fak, J. J., McNicholas, P., Oliver, B. D. e Deisenhofer, J. (2002) scienza 297, 2018-2026). Coerente con questa ipotesi, troviamo quella mutazione del glutammato 210 risultati aspartato in una 90-fold riduzione del tasso di idrolisi di ATP rispetto al wild type SecA, 0,3 s(-1) versus s(-1) 27, rispettivamente. SecA-E210D rilascia anche ADP a un ritmo più lento rispetto al wild type SecA, suggerendo che oltre a servire come base catalitica, glutammato 210 potrebbe aiuto fatturato pure. I nostri risultati contraddicono un report precedente che ha proposto come base catalitica aspartato 133 (Sato, K., Mori, H., Yoshida, M. e Mizushima, s. (1996) j Biol Chem. 271, 17439-17444). Rivalutazione del mutante SecA-D133N utilizzato in questo studio conferma la sua perdita di attività di traslocazione ATPasi e membrana, ma sorprendentemente, il mutante analogo SecA-D133A conserva la piena attività, rivelando che questo residuo non gioca un ruolo chiave nella catalisi.

Contributo Di Msh2, Msh6 Subunità ATPasi Asimmetrica E DNA Incongruenza Attività Di Associazione Di Proteine Di Saccharomyces Cerevisiae Msh2-Msh6 Mismatch Repair

DNA Repair. Feb, 2006  |  Pubmed ID: 16214425

Precedente analisi di Thermus aquaticus MutS omodimero e di Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 eterodimero hanno rivelato che le subunità in questi complessi della proteina legano e idrolizzare ATP asimmetricamente, emulando la loro proprietà di associazione DNA asimmetrica. Nell'omodimero MutS, una subunità (S1) si lega ATP con alta affinità e si idrolizza rapidamente, mentre le altre unità secondaria (S2) si lega ATP con bassa affinità e si idrolizza ad un tasso apparentemente più lento. Interazione di MutS con DNA non corrispondente risultati nella soppressione di idrolisi dell'ATP a S1- ma quale di queste subunità, S1 o S2, rende il contatto specifico con la mancata corrispondenza (ad es., base accatastamento di un residuo di fenilalanina conservata) rimane sconosciuto. Al fine di rispondere a questa domanda e a chiarire i legami tra il legame del DNA e attività dell'atpasi di ogni subunità in dimero, abbiamo fatto le mutazioni nei siti di Msh2 e Msh6 ATPasi e valutare il loro impatto sull'attività dell'eterodimero Msh2-Msh6 (in Msh2-Msh6, solo Msh6 rende base contatto specifico con la mancata corrispondenza). I risultati principali sono: (a) Msh6 idrolizza ATP rapidamente e così ricorda la subunità S1 dell'omodimero MutS, Msh2 (b) idrolizza ATP ad un tasso più lento e così ricorda la subunità S2 del MutS, (c) se stessa un'ATPasi apparentemente debole, Msh2 ha una forte influenza sull'attività dell'atpasi di Msh6, (d) Msh6 legame al DNA non corrispondente risultati nella soppressione della rapida idrolisi dell'ATP, rivelando un sollevatore "cis" tra il suo disadattamento riconoscimento e le attività dell'ATPasi, complesso (e) la risultante Msh2-Msh6, con entrambe le subunità nello stato ATP-bound, esibisce alterate interazioni con la mancata corrispondenza.

Gli Effetti Di Nucleotidi Sulla Cinetica Di Legame DNA-MutS Chiarire Il Ruolo Dell'attività Dell'ATPasi MutS Nella Riparazione Del Disadattamento

Journal of Molecular Biology. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17207499

Proteina MutS avvia mismatch repair con riconoscimento di una coppia di basi non-Watson-Crick o base inserimento/cancellazione sito nel DNA, e sue interazioni con il DNA sono modulati dall'attività dell'ATPasi. Vi presentiamo un'analisi cinetica di queste interazioni, compresi gli effetti di ATP binding e idrolisi, riportati direttamente dal sito incongruenza 2-aminopurine fluorescenza. Quando si libera di nucleotidi, il aquaticus di Thermus MutS dimero si lega rapidamente una mancata corrispondenza (k (a) = 3 x 10 M(-1) s(-1)) e forma un complesso con un'emivita di 10 stabile s (k (OFF) = 0,07 s(-1)). Quando uno o entrambi nucleotide-binding sites sul MutS * mancata corrispondenza del complesso sono occupati da ATP, il complesso rimane abbastanza stabile, con un'emivita di 5-7 s (k (OFF) = 0.1-0,14 s(-1)), sebbene MutS(ATP) diventa incapace di (ri-) associazione la mancata corrispondenza. Quando uno o entrambi siti nucleotide-binding su dimero MutS sono occupati da ADP, il MutS * incongruenza rapidamente forme complesse (k (ON) = 7,3 x 10 M(-1) s(-1)) e anche si dissocia rapidamente, con un tempo di dimezzamento di 0,4 s (k (OFF) = 2.7 s(-1)). Integrazione di queste cinetica MutS DNA-binding con cinetica di ATPasi precedentemente descritta rivela che: (a) in assenza di una mancata corrispondenza, MutS in forma ADP-bound si impegna in interazioni altamente dinamiche con DNA, forse sondaggio coppie di basi per errori; (b) in presenza di un disallineamento, MutS stabilizzato in forma ATP-bound rilascia la mancata corrispondenza lentamente, permettendo forse onsite interazioni con proteine di riparazione a valle; (c) associato a ATP MutS poi si sposta fuori l'incongruenza, forse come una morsa mobile facilitare reazioni di riparazione presso siti distanti sul DNA, fino a quando l'ATP è idrolizzato (o si dissocia) e la proteina si gira.

TIRF(ING) Rivela Msh2-Msh6 Surf Sul DNA

Nature Structural & Molecular Biology. Dec, 2007  |  Pubmed ID: 18059451

Residui Conservati La Subunità Delta Aiutano Il Caricatore Della Pinza E. Coli, Gamma Complessa, DNA Primer-modello Target Per Fissaggio

Nucleic Acids Research. Jun, 2008  |  Pubmed ID: 18424802

L'Escherichia coli clamp loader, gamma complessa (gamma(3)deltadelta'lambdapsi), catalizza ATP-driven Assemblea dei morsetti beta sul primer-modello DNA (p/tDNA), abilitazione processive replica. Il meccanismo da cui gamma obiettivi complessi p/tDNA per fissaggio non viene risolto. Secondo studi precedenti, carica polare amminoacidi all'interno della camera di caricatore del morsetto interagiscono con la parte di double-stranded (ds) di p/tDNA. Troviamo che dsDNA, non ssDNA, può innescare una raffica di idrolisi dell'ATP da gamma complessa e dispositivo di fissaggio, ma solo a concentrazioni molto più elevati rispetto a p/tDNA. Così, contatto tra gamma complessa e dsDNA è necessaria e sufficiente, ma non ottimale, per la reazione, e ulteriori contatti con p/tDNA probabile facilitano la selezione come il substrato ottimo per il montaggio del morsetto. Abbiamo studiato se QNRR una sequenza conservata-HRVW (279) - nella subunità delta contribuisce a tali interazioni, poiché il triptofano-279 specificamente reticola alla giunzione primer-modello. Mutazione di delta-W279 indebolisce associazione complessa gamma di p/tDNA, che ostacolano la capacità di carico di morsetti e promuovere la replicazione del DNA proccessive, e ulteriori mutazioni nella sequenza (delta-R277, delta-R283) peggiorano l'interazione. Questi dati rivelano una romanzo posizione nel dominio C-terminale del caricatore morsetto e. coli che contribuisce al legame del DNA e aiuta a definisce p/tDNA come il substrato preferito per la reazione.

Meccanismo Di MutS Ricerca DNA Mismatch E Riparazione Di Segnalazione

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 18854319

Riparazione del DNA mismatch è iniziata con il riconoscimento di mancate corrispondenze da MutS proteine. Il meccanismo mediante il quale MutS cerca e riconosce mancate corrispondenze e successivamente segnali ripristino rimane scarsamente compreso. Abbiamo usato la singola molecola analisi di immagini di microscopia forza atomica dei complessi DNA-MutS, accoppiati con dosaggi biochimici, per determinare le distribuzioni di stati conformazionali, le affinità di legame del DNA e le attività dell'atpasi di tipo selvatico e due mutanti di MutS, con le sostituzioni di alanina nel motivo del riconoscimento di disadattamento Glu-Phe-Xaa conservata. Che troviamo su homoduplex del DNA, il Glu conservata, ma non la Phe, facilita MutS-induced DNA flessione, considerando che al disadattamento, sia Phe e Glu promuovere la formazione di una conformazione raddrizzata. I dati rivelano un ruolo insolito per il residuo di Phe in quanto promuove l'inflessibile, non piegare, del DNA in siti di disadattamento. Inoltre, formazione di specifica conformazione MutS-DNA raddrizzata a mancate corrispondenze sembra essere necessaria per l'inibizione della idrolisi dell'ATP da MutS che segnala l'inizio della riparazione. Questi risultati forniscono una spiegazione strutturale per il meccanismo mediante il quale MutS cerca e riconosce mancate corrispondenze e per i fenotipi osservati dei mutanti con le sostituzioni nel motivo Glu-Phe-Xaa.

Struttura Di Una Forma Mutante Di Antigene Nucleare Di Proliferazione Cellulare Che Blocca La Sintesi Del DNA Di Translesion

Biochemistry. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 19053247

Antigene nucleare di proliferazione cellulare (PCNA) è una proteina di homotrimeric che funziona come un morsetto scorrevole durante la replicazione del DNA. Sono state identificate diverse forme mutanti di PCNA che bloccano la sintesi del DNA translesion in studi genetici in lievito. Una tale proteina mutante (codificata dall'allele rev6-1) è la glicina per sostituzione di serina in residui 178, situata presso l'interfaccia subunità di PCNA. Per migliorare la nostra comprensione di come questa sostituzione interferisce con la sintesi di translesion, abbiamo determinato la struttura cristallina ai raggi x della proteina PCNA G178S mutante. Questa sostituzione ha poco effetto sulla struttura del dominio in cui si verifica la sostituzione. Invece, cambiamenti strutturali significativi, locali sono stati osservati nella subunità adiacente. La differenza più notevole tra strutture wild-type e mutanti è loop in un ciclo unico, esteso (comprendente amminoacido residui 105-110), che noi chiamiamo J. Nella struttura della proteina mutante, ciclo J adotta una conformazione molto differente in cui gli atomi del backbone della proteina hanno spostato da quanto 6,5 A dalle loro posizioni nella struttura wild-type. Per migliorare la nostra comprensione delle conseguenze funzionali di questo mutamento strutturale, abbiamo esaminato la capacità di questa proteina mutante di stimolare incorporazione nucleotidica di DNA polimerasi eta (eta pol). Studi di cinetici dello stato stazionario Visualizza mentre wild-type PCNA stimola l'incorporazione dall'eta di pol di fronte un sito abasic, proteina PCNA mutante inibisce effettivamente incorporazione di fronte questa lesione del DNA. Questi risultati mostrano che la posizione del ciclo che j in PCNA gioca un ruolo essenziale nel facilitare la sintesi di translesion.

Meccanismo Della Pinza PCNA ATP-driven Caricamento Da S. Cerevisiae RFC

Journal of Molecular Biology. May, 2009  |  Pubmed ID: 19285992

Morsetti circolare legare la polimerasi del DNA, che serve come fattori essenziali processivity nella replicazione del genoma e la funzione in altri processi cellulari critiche pure. Morsetto caricatori catalizzano di fissaggio sul DNA, e la questione di come queste proteine costrutto un link topologico tra un morsetto e DNA, specialmente il meccanismo da cui ATP viene utilizzato per l'attività, rimane aperto. Qui descriviamo analisi pre-steady-state di idrolisi dell'ATP, antigene nucleare delle cellule di proliferazione (PCNA) pinza apertura e grippaggio del DNA dal fattore di Saccharomyces cerevisiae replica C (RFC) e presentare il primo modello cinetico di una reazione di morsetto-caricamento eucariotica convalidato dall'analisi dei dati globali. Associazione ATP da più subunità RFC avvia un lento cambiamento conformazionale nel caricatore del morsetto, permettendogli di legare e aprire PCNA e legare DNA pure. PCNA apertura serrature RFC in uno stato attivo e il risultante RFC.ATP.PCNA((Open)) intermedio è pronto per l'ingresso di DNA nel morsetto. Legame del DNA si impegna RFC per idrolisi dell'ATP, che è seguita da chiusura PCNA e PCNA.Rilascio di DNA. Questo modello consente la comprensione quantitativa del meccanismo di un caricatore del morsetto eucariotica multistep e facilita inoltre l'analisi comparativa dei caricatori da diversi organismi.

Meccanismo Di Inibizione Mediata Da Cadmio Funzione Di Msh2-Msh6 Nella Riparazione Del DNA Mismatch

Biochemistry. Oct, 2009  |  Pubmed ID: 19320425

L'osservazione che cadmio (Msh2-Msh6, che è responsabile per l'identificazione di appaiamento mismatch e altre discrepanze nel DNA, ha portato alla proposta che targeting selettivo di questa proteina e la conseguente soppressione di riparazione del DNA o apoptosi promuovere gli effetti cancerogeni del metallo pesante tossina inibisce la Cd(2+)). È stato suggerito che Cd(2+) associazione a siti specifici su Msh2-Msh6 blocca il legame del DNA e attività ATPasi. Per studiare il meccanismo di inibizione, abbiamo misurato Cd(2+) associazione di Msh2-Msh6, direttamente e attraverso il monitoraggio dei cambiamenti nella struttura della proteina e l'attività enzimatica. Raccordo globale dei dati di un modello di associazione multiligand ha rivelato che associazione di circa 100 Cd(2+) ioni per Msh2-Msh6 risultati nella sua inattivazione. Questo risultato indica che l'effetto inibitorio di Cd(2+) avviene attraverso un meccanismo aspecifico. CD(2+) e Msh2-Msh6 interazioni coinvolgono gruppi sulfidrilici cisteina e il Cd(2+):Msh2 alto-Msh6 rapporto implica altri leganti quali istidina, aspartato, glutammato e la spina dorsale del peptide pure. Il nostro studio dimostra anche che il cadmio inattiva diversi enzimi estranei allo stesso modo, coerente con un meccanismo di inibizione aspecifico. Targeting di una varietà di proteine, tra cui Msh2-Msh6, in questo modo generico spiegherebbe l'impatto contrassegnato ad ampio spettro di Cd(2+) sui processi biologici. Proponiamo che la presenza di più siti di legame Cd(2+) aspecifici su proteine e la loro propensione a modificare la conformazione su interazione con Cd(2+) sono determinanti critici della suscettibilità dei sistemi biologici corrispondente alla tossicità del cadmio.

Analisi Globale Basata Sul Modello Di Dati Eterogenei Sperimentali Utilizzando Gfit

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2009  |  Pubmed ID: 19399438

Analisi di regressione è indispensabile per una comprensione quantitativa di sistemi biologici e per lo sviluppo di modelli computazionali accurati. Applicando l'analisi di regressione, si può convalidare modelli e quantificare i componenti del sistema, incluse quelle che non possono essere osservate direttamente. Analisi globale (simultanea) di tutti i dati sperimentali disponibili per il sistema produce i risultati più informativi. Per quantificare i componenti di un sistema complesso, il dataset deve contenere gli esperimenti di diversi tipi, effettuati nell'ambito di una vasta gamma di condizioni. Tuttavia, eterogeneità di tali set di dati complica la realizzazione dell'analisi globale. Modelli computazionali si evolvono continuamente per includere nuove conoscenze e per tenere conto di nuovi dati sperimentali, creando la richiesta di procedure di analisi flessibile ed efficiente. Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato software gfit per analizzare globalmente molti tipi di esperimenti, per convalidare i modelli computazionali e per estrarre il massimo di informazioni dai dati sperimentali disponibili.

Saccharomyces Cerevisiae Cinetica Di Legame Del DNA Msh2-Msh6 Rivelano Un Meccanismo Di Targeting Siti Per La Riparazione Del DNA Mismatch

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 20080735

Il DNA mismatch repair system (MMR) Identifica errori di replicazione e danneggiato di basi nel DNA e funzioni per preservare l'integrità genomica. MutS esegue l'operazione di individuazione non corrispondenti coppie di basi, loop e lesioni e avvio MMR, e la questione fondamentale di come questa proteina obiettivi specifici siti nel DNA è irrisolto. Per rispondere a questa domanda, abbiamo esaminato le interazioni tra Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6, un omologo MutS eucariotico e DNA in tempo reale. La cinetica di reazione rivela che Msh2-Msh6 associa una varietà di siti a prezzi altrettanto veloce (k (a) circa 10 M(-1) s(-1)) e i relativi manifesti selettività nei tassi di dissociazione differenziale; ad esempio, la proteina rilascia un 2-coppia di basi Aminopurine:T circa 90-fold più veloce di una mancata corrispondenza G:T. Il rilascio del 2-Ap:T sito, Msh2-Msh6 è in grado di muoversi lateralmente sul DNA per individuare un sito G:T nelle vicinanze. Il longevo complesso Msh2-Msh6.G:T innesca il passo successivo nel MMR - formazione di un limite ATP morsetto - più efficacemente che la breve durata Msh2-Msh6.2-Ap:T complesso. Mutazione di Glu il motivo obbligatorio Glu-Phe-X DNA conservato stabilizza Msh2-Msh6 (E339A). 2-complesso Ap:T e il mutante può segnalare 2-Ap:T efficacemente come wild-type Msh2-Msh6 segnali G:T riparazione riparazione. Questi risultati suggeriscono un meccanismo di targeting per cui Msh2-Msh6 scansioni del DNA, interrogare paia di basi da contatti transitori e fermandosi a potenziale target siti e la più lunga pausa maggiore sarà la probabilità di MMR.

MSH2 Umano Della Proteina (hMSH2) Controlla ATP Elaborazione Di HMSH2-hMSH6

The Journal of Biological Chemistry. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 21937421

La meccanica di hMSH2-hMSH6 ATP binding e idrolisi sono critica di vari meccanismi proposti per la riparazione del disadattamento (MMR), che a sua volta si affidano il coordinamento dettagliato del trifosfato di Adenosina di elaborazione tra i singoli hMSH2 e hMSH6 subunità. Qui vi mostriamo che hMSH2-hMSH6 è strettamente controllato da hMSH2 e magnesio in un complesso con ADP (hMSH2(magnesium-ADP)-hMSH6). Destabilizzazione di magnesio provoca rilascio di ADP da hMSH2 che consente l'associazione di alta affinità ATP da hMSH6, che quindi migliora l'associazione ATP hMSH2. Entrambe le subunità devono essere associate a ATP per formare efficientemente un morsetto scorrevole di idrolisi indipendente stabile hMSH2-hMSH6 necessario per MMR. In presenza di magnesio, i morsetti scorrevoli con ATP-associazione rimangono sul DNA per ∼8 min. Questi risultati suggeriscono un preciso stepwise meccanismo cinetico per hMSH2-hMSH6 funzioni che sembra mimare gli interruttori della proteina G, vincola gravemente modelli per MMR e possono parzialmente spiegare la frequenza allele MSH2 nella sindrome di Lynch o cancro colorettale ereditario non poliposico.

Allosterism Dinamici Nel Meccanismo Di Azione Del Disadattamento Del DNA Di Riparazione Proteina MutS

Biophysical Journal. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 21961599

La proteina multidominio Thermus aquaticus MutS e suoi omologhi procarioti ed eucarioti riconoscono errori di replicazione del DNA e avviare la riparazione del disadattamento. MutS azioni sono alimentate da ATP binding e idrolisi, che modulano le sue interazioni con il DNA ed altre proteine nella via del mismatch repair. Il legame del DNA e le attività dell'ATPasi allosterically sono accoppiate ad una distanza di ∼70 Å e il meccanismo molecolare dell'accoppiamento non è stato chiarito. Per risolvere questo problema, sono state eseguite simulazioni di dinamica molecolare all-atom di ns ∼150 compresi solvente esplicito sui due principali complessi - ATP-bound e ATP-free MutS⋅DNA (+ rigonfiamento T). Abbiamo usato analisi delle componenti principali nello spazio di fluttuazione per valutare ATP ligando-alterazioni indotte dalla struttura MutS e dinamiche. L'ensemble calcolato in base alla dinamica molecolare di strutture accessibili termicamente ha dimostrato nettamente più piccole differenze tra i due complessi. Tuttavia, analisi della covarianza delle fluttuazioni dinamiche ha rivelato un certo numero di giunti interresidue e interdominio potenzialmente significativi. Inoltre, analisi delle componenti principali ha rivelato ammassi di correlato fluttuazioni atomiche che collega il DNA e i siti di legame del nucleotide, specialmente nella MutS⋅DNA(+T) con ATP-associazione complessa. Questi risultati supportano l'idea che allosterism tra i nucleotidi e siti di legame del DNA in MutS possono verificarsi tramite modifiche indotta dal ligando in movimento, cioè, dinamico allosterism.

Un Punto Centrale Girevole RFC Clamp Loader PCNA Comanda L'apertura E Il Caricamento Sul DNA

Journal of Molecular Biology. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22197374

Fattore di replica C (RFC) è un complesso di cinque subunità che carica la proliferazione delle cellule antigene nucleare (PCNA) morsetti sul DNA primer-modello (ptDNA) durante la replica. Subunità RFC appartengono alla Superfamiglia delle AAA(+), e loro attività ATPasi unità interazioni tra il caricatore del morsetto, pinza e ptDNA, che porta a PCNA·ptDNA topologicamente collegati. Riportiamo la cinetica di eventi transitori in Saccharomyces cerevisiae catalizzata da RFC PCNA sollecitazioni, compresa attivazione indotta da ATP RFC, apertura PCNA, associazione ptDNA, idrolisi dell'ATP, chiusura PCNA e rilascio PCNA·ptDNA. Questa prospettiva dettagliata consente la valutazione delle singole RFC-A, RFC-B, RFC-C, RFC-D e RFC-E subunità funzioni nel meccanismo di reazione. Le funzioni sono state attribuite a subunità RFC precedentemente basata su un'analisi steady-state di mutanti ATPasi 'arginina-dito'; Tuttavia, analisi pre-steady-state fornisce una visione diversa. La subunità centrale RFC-C serve come un punto critico girevole nel caricatore del morsetto. Associazione ATP a questa subunità avvia attivazione RFC e il caricatore del morsetto adotta una conformazione a spirale che stabilizza PCNA in una spirale aperta corrispondente. L'importanza della risposta subunità RFC all'associazione di ATP diminuisce come RFC-C > RFC-D > RFC-B, con il RFC-A essere inutili. RFC-C-dipendente attivazione di RFC permette anche ptDNA vincolante, che porta alla formazione della RFC·ATP·PCNA (aperto) ·ptDNA complesse. Successiva idrolisi dell'ATP conduce alla dissociazione del complesso, con attività di RFC-D contribuire più a rilascio rapido ptDNA. Il ruolo del core RFC-B/C/D subunità ATPasi nel morsetto di caricamento è coerenza con la simile posizione centrale di tutte le subunità attive tre ATPasi del caricatore morsetto Escherichia coli.

ATP Binding E Idrolisi-Driven Tasso-determinazione Eventi Nel Morsetto PCNA RFC-catalizzato Reazione Di Caricamento

Journal of Molecular Biology. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22197378

Il fattore di replica multi-subunit C (RFC) complessi carichi circolare proliferazione cellulare antigene nucleare (PCNA) morsetti sul DNA dove servono come mobile di attacchi per le polimerasi e coordinare le funzioni di molte altre proteine DNA metaboliche. La pinza reazione di caricamento è complessa, che coinvolge molteplici componenti (RFC, PCNA, DNA e ATP) ed eventi (minimamente: PCNA, apertura e chiusura, DNA binding e rilasciare e associazione/idrolisi dell'ATP) che producono un clamp· topologicamente collegatiProdotto del DNA in meno di un secondo. Riportiamo le misure pre-steady-state di diversi passi nella reazione catalizzata da Saccharomyces cerevisiae RFC e presentano un modello di cinetico globale basato su analisi globale dei dati. Punti salienti del meccanismo di reazione sono che associazione ATP a RFC avvia lenta attivazione del caricatore del morsetto, permettendogli di aprire PCNA (presso ∼2 s(-1)) e bind primer-modello DNA (ptDNA). Associazione rapida di ptDNA porta alla formazione della RFC·ATP·PCNA (aperto) ·ptDNA complesso, che catalizza una raffica di idrolisi dell'ATP. Un altro passo lento nella reazione segue l'idrolisi dell'ATP ed è associato con chiusura PCNA intorno a ptDNA (8 s(-1)). Dissociazione di PCNA·ptDNA dalla RFC conduce al fatturato catalitico. Proponiamo che questi eventi tasso-determinazione precoce e tardi sono cambiamenti conformazionali intramolecolari in RFC e PCNA che controllano la pinza apertura e chiusura, e che idrolisi e associazione ATP alternare RFC conformazioni ad alta e bassa affinità, rispettivamente, per PCNA aperto e ptDNA e così bookend la reazione di caricamento del morsetto.