DNA複製の間にサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae）クランプローダー複製因子CとプライマーDNAテンプレート間の相互作用の特異性に

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2002  |  Pubmed ID: 12370190

複製因子C（RFC）は、DNA複製や修復時にDNAポリメラーゼによってプロセッシブ合成を可能にし、プライマーDNAの周りに円形の増殖細胞核抗原クランプのアセンブリを触媒する。効率的にこの機能を実行するために、RFCは、急速に、特にラギング鎖合成時に、クランプ用の基板としてプライマーDNAを認識する必要があります。この研究から、以前の報告と同様に定量的なDNA結合実験では、RFCはプライマー·テンプレートと同様に類似した高親和性（見かけのK（D）を持つ一本鎖および二本鎖DNA（それぞれのssDNAとdsDNA）と相互作用すること、しかし、示す約10nm）。どのようにしてRFCは、複製フォークで過剰のssDNAとdsDNAからプライミングされたDNAのサイトを区別する方法はありますか？さらなる分析は、様々なDNA構造の高親和性にもかかわらず、RFCもssDNAとdsDNAの50倍過剰の存在下でのプライマー·テンプレートDNAを選択することが明らかになった。 ssDNAのまたは二本鎖DNAとRFCの間の相互作用ははるかに少ない安定したプライミングDNAおよびRFC（K（オフ）> 0.2秒（-1）対0.025秒（-1）、それぞれ）の間に超えています。我々は急速に結合し、プライマー·テンプレートDNAに選択的な、安定な結合で結合し一本鎖および二本鎖DNAを放出する能力はRFCがプライミングされたサイトはどこにそれがクランプアセンブリを開始するために一時停止することができますを効率的にDNAをスキャンすることができますことを提案する。

DNAにクランプをスライドさせ、大腸菌DNAポリメラーゼIIIのベータ版のロードのメカニズム。善意のプライマー/テンプレート優先的にATPを加水分解するためにガンマコンプレックスをトリガし、クランプをロードします。

The Journal of Biological Chemistry. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12519754

大腸菌DNAポリメラーゼIIIガンマ複雑なクランプローダーは、DNAにクランプをスライドさせ、リング状のベータ版をアセンブルします。コアポリメラーゼはゲノムのプロセッシブレプリケーションを有効にし、βによって、テンプレートにつながれています。ここでは、伸長、熟練した、不十分なプライマー/テンプレートDNAを使用して、DNA結合とATP加水分解の前定常状態速度を測定することにより、クランプローディング反応のDNA基質特異性を調べる。 ATP-結合したクランプローダーは、βの存在下または非存在下のいずれかで、両方の伸長、熟練と欠損DNA基質をバインドします。しかし、伸び、熟練したDNAが優先的にATPの同時加水分解でDNAにベータ版をリリースするガンマ複合体をトリガします。伸長·習熟に結合するDNAは、DNAの10（5） - 倍低い親和性を有するADP結合状態を高親和性ATP結合状態からのγ複合体に変換します。高親和性結合状態にリサイクルが律速されているため、定常状態の結合アッセイは、誤解を招く恐れがあり、そのガンマ複雑なことを示唆してはるかに熱心に非伸縮プライマー/テンプレートDNAに結合する。前の定常状態の回転異方性のデータは、正反対の結論に至る延長プライマー/テンプレートを使用してガンマ複合体の動的なアソシエーション解離を明らかにした。拡張可能なDNAを強く支持し、動的な認識は、βの存在を必要としません。したがって、γ複合体は変調のATP-結合型は、DNAに高親和性で結合したDNAとの相互作用が伸び、熟練したDNA基質優先的にトリガATPの加水分解および低親和性状態へ変換するための機構としてATP結合と加水分解を使用しています。

DNA修復の開始時にATP-結合した状態でのMSH2、MSH6のミスマッチ認識共役安定化

Biochemistry. Jul, 2003  |  Pubmed ID: 12820877

ミスマッチ修復は、ATP駆動型のプロセスを介してDNAのエラーを修正するタンパク質である。真核生物では、MSH2、MSH6複合体はDNAとを開始し修復の塩基対のミスマッチ、小さな挿入/欠失を認識しています。 MSH2とMSH6タンパク質の両方は、修復活性に必要であるウォーカーATP結合モチーフを含んでいます。 DNA結合/ミスマッチ認識にどのようにこれらのタンパク質のカップルAT​​P結合と加水分解を理解するために、サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）MSH2、MSH6のATPase活性は、事前に定常状態の条件下で検討した。酸クエンチ実験は、DNAの存在下で、MSH2、MSH6加水分解するATPが急速に（バースト率は20度Cで= 3秒（-1））、その後、触媒回転率（K（猫を制限する経路の遅いステップを経ることを明らかにした）= 0.1秒（-1））。 ATPは完全に一致した二本鎖DNAの存在下で同様に加水分解であるが、Gの存在下で：Tの不一致または+ T挿入を含むDNAを、ATPの加水分解が厳しく抑制されている（レート= 0.1秒（-1））。パルスチェイス実験では、MSH2、MSH6がない、またはDNAの存在下で急速にATPを結合することを明らかにした（レート= 0.1マイクロモル（-1）sは（-1））、そのMSH2-Msh6.mismatched DNA複合体のために、示すATP結合した後がATPの加水分解の前または次のステップでは、経路の律速段階である。したがって、ミスマッチ認識はMSH2、MSH6にATPの滞留時間の劇的な増加に結合されている。この不一致によって誘発される、修復経路の下流のイベントMSH2、MSH6性信号の安定したATP-結合した状態になります。

デュアルベクトル戦略を使用して過剰生産と大腸菌で真核生物多タンパク質複合体の解析

Analytical Biochemistry. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12842110

真核生物のタンパク質の生化学的研究は、多くの場合、純粋な形でこれらの一般的に大規模な、多タンパク質複合体の低可用性によって制限されます。大腸菌は、大規模なタンパク質生産のための一般的に使用されるホストですが、真核生物のタンパク質生産のためのユーティリティがあるため、転写、翻訳、タンパク質の正しいフォールディングに関連する問題の制限されています。ここでは、植物、同時にこれらの問題の多くに対処するベクターの開発およびテストについて説明します。植物ベクターはT7プロモーター制御発現ユニット、複製のp15A起点と珍しいトランスファーRNAとカナマイシン耐性遺伝子を含んでいます。したがって、植物ベクターを大腸菌内で複数のタンパク質を共発現するpETベクターと組み合わせて使用​​することができます。ヘテロMSH2、MSH6ミスマッチ修復タンパク質（248kDa）と5-サブユニットの複製因子Cクランプローダー（250 kDa）はこのアプローチを使用して、我々が正常に大腸菌内で二つの異なるサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）複合体の高ミリグラムの量を生産しています。定量分析は、これらのタンパク質はその構造と機能のin vitro試験のための植物のユーティリティ+大腸菌で真核生物のタンパク質のPETベースの生産を肯定、完全にアクティブであることを示している。

増殖性細胞核抗原への循環量体とその添付ファイルのポイント内の複製因子Cクランプローダーサブユニット配置

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2003  |  Pubmed ID: 14530260

複製因子C（RFC）は、増殖細胞核抗原（PCNA）プロセ因子のheteropentameric AAA +タンパク質のクランプローダーです。原核生物のホモログ、γ複合体はまた、ヘテロであり、構造の研究では、サブユニットが円形に配置されて表示されます。本報告では、サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のRFCプロトマーは、互いに及びPCNAとの相互作用について検討されています。データは、円周上のユニットの順序のモデルにつながる。 AAA +オリゴマーの特徴は、1サブユニットは、隣接するサブユニットに結合し、ATPの加水分解の触媒アルギニン残基を提供している二部ATPサイトの使用です。我々は、RFC（3/4）複合体はDNA依存性ATPase活性であることがわかり、我々はRFC4のATPサイトへの触媒アルギニンをそのRFC3供給を決定するために、このアクティビティを使用しています。サブユニットの配置と組み合わせたこの情報は、残りのATPサイトの構成を定義します。さらに、RFC（2/3）とは、RFC（3/4）サブアセンブリは、PCNAにそのRFC3フォーム強力な接点を示すPCNAにしっかりとバインドをPCNAに安定して結合し、まだRFC2もRFC4も。 RFC1サブユニットはまた、しっかりとPCNAをバインドして、我々はこの相互作用のために重要であるRFC1で2つの疎水性残基を識別します。したがって、RFCには、少なくとも2つのサブユニットは1つだけサブユニットはβクランプとの強い接触している大腸菌γ複合体とは異なり、PCNAとの強固なコンタクトを行います。 PCNAへの複数の強力な接点は二量体βリングと比較してDNA上にPCNAの三量体のリングロードの余分な需要を反映しているのかもしれない。

デュアル機能、クランプ開口部とプライマーとテンプレートの認識は、キークランプローダーサブユニットを定義します。

Journal of Molecular Biology. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15364574

プロセッシブDNA複製を有効にするには、ローダのタンパク質がDNA上の円形スライディングクランプのアセンブリを触媒するクランプ。反応の間に、クランプローダーはプライマー·テンプレートDNAを結合し、両者間のトポロジーリンクを形成するために、クランプの中央に配置します。クランプローダーは、多タンパク質など5種類のタンパク質を大腸菌などの複合体を、サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、人間のクランプローダー、二つの蛋白質熱菌Pyrococcus furiosusと古細菌のエーテル型クランプローダー、およびプライマー結合および選択するための責任をこれまでのサイト（S）です。クランプアセンブリのターゲットとして、テンプレートDNAは不明のままである。この問題に対処するために、我々は、UV誘導タンパク質-DNA架橋と質量分析計を用いて大腸菌のγ複雑なクランプローダーとDNAとの相互作用を分析した。結果は、γ複合体のデルタサブユニットに近いプライマーとテンプレートのジャンクショ​​ンとの接触になりますことを示している。デルタC-末端ドメインのトリプトファン279 3'-OHプライマーの端の近くに位置し、プライマーとテンプレートの認識に重要な役割を果たす可能性があります。これまでの研究では、デルタにも結合し、βクランプ（デルタ接触βのN末端ドメインの疎水性残基を開くことが示されています。デルタ上にクランプ結合とDNA結合部位は、中心部へのプライマー·テンプレートの容易なエントリを配置して表示され複合体からの鋳型鎖のクランプして終了します。S.cerevisiae RFC複合体の同様の分析のガンマ複合体でデルタを観察し、デュアル機能が他の生物からローダーをクランプするためにも真であることを示唆している。

サーマス·アクアのMutSダイマーの非対称ATP結合と加水分解活性は、ミスマッチDNAとの相互作用の調節の鍵である

Biochemistry. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15476405

原核生物と真核生物のMutS MSHタンパク質はDNAに塩基対のミスマッチ、挿入または欠失を認識し、ミスマッチ修復を開始します。これらのタンパク質は二量体（そしておそらく、より高次のオリゴマー）として機能し、DNA修復に不可欠であるATPアーゼ活性を有する。大腸菌のMutSと真核生物のMSH2、MSH6タンパク質を明らかにした以前の研究では、DNA結合とATPase活性の両方に関してダイマー内の非対称性。我々は、このの性格と役割の非対称性の詳細な調査に従順サーマス·アクアののMutSタンパク質を発見した。ここでは、（）のMutSダイマーサブユニット1（S1）には30​​のATP加水分解S2間に急速に、（b）はS1加水分解し、ATPを高親和性と10倍弱い親和性を有する（S2）は、他のヌクレオチドと結合することを示している - 50倍遅い速度では、（C）のMutSへの結合ミスマッチDNAは、S1が遅い加水分解がS2で継続でATP加水分解を阻害し、両方のサブユニットはATPによって占有されている場合（d）のミスマッチDNAとのMutSとの間の相互作用が弱まっているが、安定しているときにS1 ATPとADPによるS2によって占有されています。これらの結果は、ATPアーゼ経路で重要なのMutSの種を明らかにし、S1（ATP）-S2（ATP）とS1間（ATP）S1（ADP）-S2は、DNAの非存在下で、または完全に一致したDNAの存在下で優先的に形成されている（ ATP）-S2は、（ADP）ミスマッチDNAの存在下で優先的に形成される。これらのMutS種はDNA修復でのMutSの作用機序のために可能性が重要であるミスマッチDNAとの相互作用の違いを示す。

大腸菌セカATPaseの機構で保存されグルタミン酸残基の役割

The Journal of Biological Chemistry. Apr, 2005  |  Pubmed ID: 15710614

大腸菌セカは、細胞膜を横切ってのタンパク質の輸送を駆動するためにATPを使用しています。セカATP-結合部位の "DEVD"ウォーカーBモチーフに210をグルタミン酸は、ATP加水分解の触媒塩基（ハント、JF、Weinkauf、S.、ヘンリー、L.、FAK、JJ、McNicholas、P.として提案されている、オリバー、DB、およびDeisenhofer、J.（2002）科学297、2018年から2026年）。この仮説と一致し、我々は、それぞれ野生型セカ、0.3秒（-1）対27の（-1）と比較してATPの加水分解速度の90倍の減少でアスパラギン酸の結果にグルタミン酸の変異は210を見つける。セカ-E210Dはまた、触媒塩基として働くに加えて、グルタミン酸210は、同様に売上高を助けるかもしれないことを示唆し、野生型セカと比較して遅い速度でADPを解放します。我々の結果は、触媒塩基としてアスパラギン酸133を提案した以前の報告と矛盾する（佐藤、K.、森、H.、吉田、M.、および水島、S.（1996）J.许文献。271、17439から17444）が。その研究で使用されているセカ-D133N変異体の再評価は、そのATPase活性の損失と膜輸送活動を確認したが、意外にも、類似したセカ-D133A変異体は、この残基が触媒作用に重要な役割を果たしていないことを明らかにし、完全な活性を保持します。

サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae）MSH2、MSH6ミスマッチ修復蛋白質の非対称ATPaseおよびDNAミスマッチ結合活性にMSH2とMSH6サブユニットの貢献

DNA Repair. Feb, 2006  |  Pubmed ID: 16214425

サーマス·アクアのMutSホモ二量体及びサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）MSH2、MSH6ヘテロ二量体の両方の以前の分析では、非対称的にこれらのタンパク質複合体のバインドのサブユニットと加水分解するATPは、その非対称のDNA結合特性をエミュレートすることが明らかになっている。のMutSホモ二量体では、一方のサブユニット（S1）は、高い親和性と加水分解してATPを結合する、それは急速に、他のサブユニット間（S2）、明らかに遅い速度で低い親和性と加水分解することでATPを結合する。 S1またはS2でのATP加水分解の抑制ミスマッチDNAの結果とのMutSとの相互作用S1-しかし、これらのサブユニットのうち、どれが、ミスマッチ（例えば、保存されたフェニルアラニン残基によってスタックベース）を持つ特定の連絡先を作ることは不明である。この質問に回答し、DNA結合と二量体の各サブユニットのATPase活性との間のリンクを明らかにするために、我々はMSH2とMSH6のATPase部位に変異を行い、MSH2、MSH6ヘテロ（の活性に与える影響を評価MSH2、MSH6に、唯一のMSH6）はミスマッチと塩基特定の連絡先になります。主な調査結果は以下のとおりです。（）MSH6加水分解急速にATP、その結果、ホモ二量体のMutSのS1サブユニットに似ている、遅い速度で（b）はMSH2加水分解ATP、したがってのMutSのS2サブユニットに似ている、（c）はそれ自体でも明らかに弱いATPaseは、MSH2は、その不一致の認識とATPase活性の間に "シス"リンケージを明らかにし、急激なATPの加水分解の抑制ミスマッチDNAの結果から（d）MSH6結合、MSH6のATPase活性に強い影響力を持っている（e）のATP結合状態の両方のサブユニットと結果MSH2、MSH6複合体は、ミスマッチで変更の相互作用を示す。

のMutS-DNA結合速度のヌクレオチドの効果は、ミスマッチ修復にのMutS ATPase活性の役割を明確に

Journal of Molecular Biology. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17207499

のMutSタンパク質は、DNA中の非ワトソン - クリック塩基対または塩基挿入/欠失部位の認識にミスマッチ修復を開始し、DNAとの相互作用は、ATPアーゼ活性により変調されています。ここでは、ATP結合と加水分解の影響を含め、これらの相互作用の速度論的解析を提示、2 - アミノプリンの蛍光によるミスマッチサイトから直接報告した。時のヌクレオチドフリー、サーマス·アクアのMutSダイマーは、急速にミスマッチ（K（ON）= 3×10（6）M（-1）の（-1））を結合し、10秒の半減期で安定した複合体を形成（K（OFF）= 0.07秒（-1））。 1または*のMutSミスマッチコンプレックス上の両方のヌクレオチド結合部位はATPによって占有されている場合、複雑な5-7秒の半減期で、かなり安定している（K（OFF）= 0.1から0.14の（-1））たが、のMutS（ATP）（再）のミスマッチを結合できなくなる。つまたはのMutSダイマーの塩基結合部位の両方が急速にADP、のMutS *不一致複雑なフォーム（K（ON）= 7.3×10（6）M（-1）S（-1））、また、解離によって占有されている場合急速に、0.4秒の半減期（K（OFF）= 1.7秒（-1））である。前述のATPase活性動態とこれらのMutS DNA結合動態の統合があることを明らかにする：（a）ミスマッチが存在しない場合に、ADP-結合した形でのMutSは、おそらくエラーの塩基対をプローブ、DNAと非常にダイナミックな相互作用に従事し、（ b）の不一致の存在下で、ATP-結合した形で安定化のMutSは、おそらく下流の修復タンパク質と現場との対話を可能にし、徐々にミスマッチを解放すると、（c）ATP結合型のMutS、おそらく携帯電話クランプとして、ミスマッチをオフに移動しますATPが加水分解される（または解離）とタンパク質が上になるまで、DNA上の離れた部位での修復反応を促進します。

TIRF（ING）は、DNAにサーフィンMSH2、MSH6を明らかに

Nature Structural & Molecular Biology. Dec, 2007  |  Pubmed ID: 18059451

デルタサブユニットに保存された残基は、大腸菌のクランプローダー、ガンマコンプレックス、クランプアセンブリのターゲットプライマー、テンプレートDNAヘルプ

Nucleic Acids Research. Jun, 2008  |  Pubmed ID: 18424802

大腸菌クランプローダー、γ複合体（γ（3）deltadelta'lambdapsi）、プロセッシブレプリケーションを有効にし、プライマー·テンプレートDNA（P / tDNA）にβクランプのATP駆動型のアセンブリを触媒する。クランプアセンブリのガンマ複雑なターゲットのP / tDNAによってメカニズムが解決されません。以前の研究によると、/充電クランプローダーチャンバー内の極性アミノ酸は、p / tDNAの二本鎖（ds）の部分と相互作用します。我々は、dsDNAではなく、ssDNAは、γ複合体によるATP加水分解のバーストをトリガし、アセンブリをクランプすることができますを見つけるだけP / tDNAよりもはるかに高い濃度で。したがって、ガンマ複雑かつ二本鎖DNAとの間の接触は、反応のために、必要かつ十分ですが、最適ではありませんし、P / tDNAの追加の連絡先は、おそらくクランプアセンブリの最適な基質として、その選択を容易にします。デルタサブユニットのような相互作用に寄与して以来、トリプトファン-279具体的にはプライマーとテンプレートのジャンクショ​​ンへのクロスリンク - 私たちは保存されたシーケンスHRVW（279）QNRRかどうかを検討した。デルタ-W279の変異は、シーケンス内のそのクランプをロードしproccessive DNA複製を促進する能力、およびその他の変異（デルタ-R277、デルタ-R283）の相互作用を悪化させるの妨げとなっている、P / tDNAにガンマ複雑な結合を弱める。これらのデータは、反応の好ましい基質としてp / tDNAを定義するのに役立ち、DNA結合に寄与し、大腸菌のクランプローダーのC末端ドメイン内の新しい場所を明らかにした。

DNAの不一致とシグナリング修復を求めてのMutSのメカニズム

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 18854319

DNAミスマッチ修復のMutSタンパク質によるミスマッチの認識によって開始されます。を検索しのMutSとの不一致、その後、信号の修復を認識するメカニズムはあまり理解されたままになります。我々はアラニンで、コンフォメーションの状態、DNA結合親和性と、野生型とのMutSの2つの変異体のATPase活性の分布を決定するために生化学的アッセイと組み合わせるのMutS-DNA複合体の原子間力顕微鏡画像の単分子解析を用いた保存されたPHE-Xaaは-Gluのミスマッチ認識モチーフの置換。我々は、ミスマッチで、Phe及びGluの両方が曲がっていないコンフォメーションの形成を促進する一方、homoduplex DNA上に、保存されたグルタミン酸ではなく、Pheは、のMutSによるDNAの曲げを容易にことがわかります。データは、ミスマッチの部位でDNAの曲げない曲がらないし、促進するという点でPhe残基のために珍しい役割を明らかにした。さらに、ミスマッチで特定の曲がっていないのMutS-DNAの立体構造の形成は、修理の開始を通知のMutSによるATP加水分解の阻害に必要であることが表示されます。これらの結果は、を検索しのMutSとのミスマッチおよびPhe-Xaaは-Gluのモチーフで置換した変異体の観察された表現型を認識するメカニズムの構造の説明を提供しています。

そのブロックの損傷乗り越えDNA合成増殖性細胞核抗原の変異型の構造

Biochemistry. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 19053247

細胞核抗原（PCNA）を増殖することhomotrimericタンパク質で、DNA複製時のスライディングクランプとして機能します。 PCNA、そのブロックの損傷乗り越えDNA合成のいくつかの変異体は、酵母の遺伝学的研究で同定されている。そのような変異体タンパク質（rev6-1対立遺伝子によってコードされる）PCNAのサブユニットの界面に位置する残基178のセリンへの置換グリシンである。この置換は乗り越え合成を妨げる方法についての我々の理解を向上させるために、我々は、PCNA G178S変異体タンパク質のX線結晶構造を決定した。この置換は、置換が発生したドメインの構造にほとんど影響を与えません。代わりに、重要な、局所構造変化は、隣接するサブユニットで観察されています。変異体と野生型の構造の間の最も顕著な違いは、我々は変異体タンパク質の構造では、ループJ.コール、単一の拡張ループ（アミノ酸残基の105から110を含む）、であり、ループJは非常に異なるコンフォメーションを採用しているのタンパク質骨格の原子は同じくらい野生型構造内の位置から6.5などで移動しました。この構造変化の機能的影響についての我々の理解を向上させるために、我々は、DNAポリメラーゼη（POLη）によりヌクレオチドの取り込みを促進するために、この変異体タンパク質の能力を検討した。定常状態速度論的研究では、野生型PCNAは脱塩基部位の反対側のpolηによって取り込みを刺激しながら、変異PCNAタンパク質が実際にこのDNA損傷と反対の取り込みを阻害することを示しています。これらの結果は、PCNAのループJの位置が乗り越え合成を促進する上で重要な役割を果たしていることを示している。

S.セレビシエRFCによるATP駆動型PCNAクランプローディングのメカニズム

Journal of Molecular Biology. May, 2009  |  Pubmed ID: 19285992

同様にゲノムの複製、およびその他の重要な細胞プロセスの機能に不可欠な能力（processivity）因子としてDNAに円形のクランプテザーポリメラーゼ、。ローダーは、DNAにクランプを触媒するクランプと、これらのタンパク質は特にクランプとDNAとの間のトポロジーリンク、ATPは、タスクのために利用されるメカニズムを構築する方法の質問は、開いたままになります。ここでは、ATP加水分解の前の定常状態解析を記述し、細胞核抗原（PCNA）クランプの開口部、及びサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の複製因子C（RFC）によって結合DNAを増殖、および検証真核生物のクランプローディング反応の最初の動力学モデルを提示グローバル·データ分析による。複数のRFCサブユニットに結合するATPは、それが結合し、開いたPCNAのと同様にDNAを結合することができるように、クランプローダーの遅いコンフォメーション変化を開始します。 PCNAの開口部は、アクティブ状態にRFCをロックし、その結果RFC.ATP.PCNA（（オープン））中間クランプへのDNAのエントリーの準備ができています。 DNA結合は、PCNA閉鎖とPCNA.DNAのリリースが続いているATPの加水分解にRFCをコミットします。このモデルでは、真核生物のクランプローダーの多段階のメカニズムを定量的に理解することを可能にし、さらに多様な生物からローダーの比較分析を容易にします。

DNAミスマッチ修復におけるMSH2、MSH6機能のカドミウム媒介阻害のメカニズム

Biochemistry. Oct, 2009  |  Pubmed ID: 19320425

塩基対のミスマッチおよびDNAの他の不一致を識別するための責任があるカドミウム（Cd（2 +））はMSH2、MSH6を阻害するという観察は、DNA修復またはアポトーシスのこのタンパク質の標的選択とその結果として抑制が促進することを提案につながっている重金属毒素の発がん性。それが示唆されているCD（2 +）MSH2、MSH6ブロックのDNA結合とATPase活性の特定部位に結合する。阻害のメカニズムを調べるために、我々は直接、タンパク質の構造と酵素活性の変化を監視することにより、MSH2、MSH6に結合する（2 +）のCDを測定した。 multiligand結合モデルへのデータのグローバルフィッティングは、その不活化でMSH2、MSH6結果ごと（2 +）約100 Cdのイオン結合が明らかになった。この知見は、Cd（2 +）の抑制効果は非特異的なメカニズムを介して発生したことを示します。 CD（2 +）とMSH2、MSH6の相互作用は、システインのスルフヒドリル基を含む、高いCD（2 +）：MSH2、MSH6比も同様にそのようなヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ペプチド骨格のような他の配位子の関与が。私たちの研究はまた、カドミウム阻害の非特異的なメカニズムと一致し、同様にいくつかの無関係な酵素を不活性化することを示しています。この一般的な方法でMSH2、MSH6含むタンパク質は、種々の標的は、生物学的プロセス上のCDのマーク広域スペクトルの影響（2 +）を説明するであろう。我々は提案する、複数の非特異的なCDの存在（2 +）結合タンパク質上のサイトとCdとの相互作用に立体構造を変更するには、それらの傾向は（2 +）毒性カドミウムに対応する生物学的システムの感受性の重要な決定要因である。

Gfitを用いた異種実験データのモデルベースの​​グローバル分析

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2009  |  Pubmed ID: 19399438

回帰分析は、生物学的システムを定量的に理解するために、正確な計算モデルを開発するために不可欠です。回帰分析を適用することにより、一つのモデルを検証し、直接観察できないものも含めてシステムのコンポーネントを、定量化することができます。システムで使用可能なすべての実験データのグローバル（同時）分析は、最も有益な結果を生成します。複雑なシステムの構成要素を定量化するために、データセットは、条件の広い範囲で行うさまざまなタイプの実験を含める必要があります。しかし、このようなデータセットの不均一性は、グローバル解析の実装を複雑にします。計算モデルは、継続的に新しい知識を含めて、柔軟かつ効率的な解析の手順については、需要を創出し、新たな実験データを考慮する進化しています。これらの問題を解決するために、我々はグローバルな計算モデルを検証するために、利用可能な実験データから最大限の情報を抽出するために、実験の多くの種類を分析するgfitソフトウェアを開発しました。

サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae）MSH2、MSH6 DNA結合速度はDNAミスマッチ修復のためにターゲットサイトの機構を明らかに

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 20080735

DNAミスマッチ修復系（MMR）は、ゲノムの完全性を維持するためにDNAと機能でレプリケーションエラーや損傷を受けた塩基を識別します。のMutSがミスマッチ塩基対、ループや病変を検索してMMRを開始するタスクを実行し、このタンパク質はDNAに特異的な部位を標的とする方法の根本的な問題が未解決です。この問題に対処するために、我々はリアルタイムでサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）MSH2、MSH6、真核生物のMutSホモログ、およびDNAとの相互作用を検討した。例えば、、反応速度は、MSH2、MSH6が（M（-1）の（-1）k（オン）約10（7））同様に速い速度でさまざまなサイトをバインドして、その選択は、差動解離速度に現れることを明らかにTミスマッチ：Gよりも約90倍高速にT塩基対：タンパク質は、2 - アミノプリンを解放します。 2-AP解放に：Tサイト：Tサイト、MSH2、MSH6近くのGを見つけるためにDNA上の横方向に移動することができます。 T複合体：MSH2-Msh6.G長命 - - ATP-結合したクランプの形成をより効果的に短命のMSH2-Msh6.2-APよりT複合体は、MMRの次のステップをトリガします。 T複合体、および変異体は2-APを通知することができます：T修理などを効果的に、野生型MSH2、MSH6信号が保存されたPHE-X-GluのDNA結合モチーフでGluの変異はMSH2、MSH6（E339A）0.2-APを安定化G：T修理。これらの知見は、ターゲティングのメカニズムを示唆することによりDNA MSH2、MSH6スキャン、一時的な接触によって塩基対を尋問し、潜在的な標的部位で一時停止、長い停止MMRの可能性が高く。

人間のMSH2（hMSH2の）タンパク質は、hMSH2の-hMSH6によってATP処理を制御する

The Journal of Biological Chemistry. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 21937421

hMSH2の-hMSH6 ATP結合と加水分解のメカニズムは、順番に個々のhMSH2とhMSH6サブユニット間ATP処理の詳細な調整に依存しているミスマッチ修復（MMR）、には、いくつか提案されたメカニズムに重要です。ここでは、厳密にADP（hMSH2の（マグネシウム-ADP） - hMSH6）との複合体でhMSH2のマグネシウムによって制御されてhMSH2の-hMSH6ことを示している。その後、hMSH2のでATP結合を強化hMSH6によって、高親和性ATP結合することができますhMSH2のADPからリリースのマグネシウム結果の不安定化。両方のサブユニットを効率的にMMRために必要な安定したhMSH2の-hMSH6加水分解に依存しないスライディングクランプを形成するために、ATP-結合しなければなりません。マグネシウムの存在下で、ATP結合型スライディングクランプは〜8分間、DNA上に残っています。これらの結果は深刻なMMRのモデルを制約し、部分的にリンチ症候群や遺伝性非ポリポーシス大腸癌でMSH2対立遺伝子頻度を説明するかもしれない、Gタンパク質のスイッチを模倣するように見えるのhMSH2-hMSH6関数の正確な段階的な反応機構を示唆している。

DNAミスマッチ修復蛋白質のMutSの作用機構の動的アロステリズム

Biophysical Journal. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 21961599

マルチドメイン蛋白質サーマス·アクアののMutSおよびその原核生物および真核生物のホモログは、DNA複製のエラーを認識し、ミスマッチ修復を開始します。のMutSのアクションは、DNAとミスマッチ修復経路における他のタンパク質との相互作用を調節するATP結合と加水分解によって支えられています。 DNA結合とATPase活性は、アロステリック〜70Åの距離で結合されており、カップリングの分子機構は明らかにされていない。 ⋅DNA（+ Tの膨らみ）ATP-結合およびATP-フリーのMutS - この問題に対処するためには、明示的な溶媒を含む約150 nsの全原子分子動力学シミュレーションは、2つの重要な複合体で行われた。我々はのMutSの構造とダイナミクスのATPリガンド誘発変化を評価するために変動空間で主成分分析を使用していました。熱的にアクセス可能な構造の分子動力学計算されたアンサンブルは、2つの複合体の間に著しく小さな違いを示した。しかし、力学的変動の共分散分析は、潜在的に重要なinterresidueとドメイン間のカップリングの数を明らかにした。また、主成分分析は、特にATP結合型のMutS⋅DNA（+ T）複合体で、DNAとヌクレオチド結合部位を結ぶ相関の原子揺らぎのクラスターを明らかにした。これらの結果はのMutSのヌクレオチドとDNA結合部位の間にアロステリズムは、動きのリガンド誘発性の変化、すなわち、力学アロステリズムを経由して発生する可能性があるという考えをサポートしています。

RFCクランプローダーの中央旋回ポイントはPCNAは、DNA上のオープンと読み込みを制御

Journal of Molecular Biology. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22197374

複製因子C（RFC）は、5つのサブユニット複合体であり、その複製の間にプライマー·テンプレートDNA（ptDNA）に細胞核抗原（PCNA）のクランプを増殖ロードされます。 RFCサブユニットは、AAA（+）スーパーファミリーに属し、そのATPase活性は、位相的にリンクされたPCNA·ptDNAにつながる、クランプローダー、クランプ、ptDNA間の​​相互作用を駆動します。我々は、ATPによって誘導される活性化RFC、PCNAの開口部、ptDNA結合、ATP加水分解、PCNAの閉鎖、およびPCNA·ptDNAリリースを含むサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）RFC-PCNA触媒負荷の過渡事象の速度を報告します。この詳細な視点は、個々のRFC-A、RFC-B、RFC-C、RFC-D、および反応機構におけるRFC-Eサブユニットの機能評価を可能にします。関数は、以前に "アルギニンフィンガー 'のATPase変異体の定常状態解析に基づいて、RFCサブユニットに帰されているが、前の定常状態解析は、異なるビューを提供します。中央のユニットは、RFC-Cは、クランプローダーの重要なスイベルポイントとして機能します。このサブユニットに結合するATPは、RFCのアクティベーションを開始し、クランプローダーは、対応するオープンな螺旋状にPCNAを安定させる螺旋状のコンフォメーションを採用しています。 RFCビーイング不要とRFC-C> RFC-D> RFC-BなどのATP結合が減少し、へのRFCサブユニット応答の重要性。 RFCのRFC-C-依存性の活性化はまた、RFC·ATP·PCNA（オープン）·ptDNA複合体の形成につながる、ptDNA結合することができます。その後のATP加水分解は、RFC-D活性が急速ptDNAリリースに最も貢献して、複雑な解離につながる。クランプ負荷のRFC-B/C/DサブユニットのATPアーゼコアの極めて重要な役割は、エシェリヒア·コリクラ​​ンプローダーのすべての3つのATPアーゼ活性サブユニットと同様の中央の位置と一致しています。

ATP結合と加水分解ドリブン律速RFC-触媒PCNAクランプローディング反応におけるイベント

Journal of Molecular Biology. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22197378

マルチサブユニットは、複製因子C（RFC）は、複雑な負荷がポリメラーゼのモバイルテザーとして、多くの他のDNA代謝タンパク質の機能を調整するDNA上に円形の増殖細胞核抗原（PCNA）のクランプを。クランプローディング反応は複数のコンポーネント（RFC、PCNA、DNA、およびATP）とイベント（低侵襲：PCNAのオープン/クローズ、DNA結合/リリース、およびATP結合/加水分解）を含む、複雑であり、位相的にリンクされているクランプを得る·DNAの製品秒未満インチここでは、サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のRFCによって触媒される反応でいくつかのステップの前の定常状態の測定値を報告し、データのグローバル解析に基づいた包括的な動力学モデルを提示します。反応機構のハイライトは、RFCへのATP結合は、それがPCNA（〜2秒（-1）で）とbindプライマー·テンプレートDNA（ptDNA）を開きできるように、クランプローダーの遅い活性化を開始することがあります。 ptDNAの急速な結合は、ATP加水分解のバーストを触媒するRFC·ATP·PCNA（オープン）·ptDNA複合体の形成につながる。反応のもう一つの遅いステップは、ATP加水分解に続き、ptDNA周りPCNA閉鎖（8秒（-1））に関連付けられています。 RFCからPCNA·ptDNAの解離は、触媒売上高につながる。我々は、オープンPCNAとptDNAのために、それぞれ、これらの初期および後期の律速イベントは分子内コンフォメーションのRFCおよびPCNAを制御するクランプの開口部と閉鎖の変化、高および低親和性コンフォメーションの間のATP結合と加水分解スイッチRFCであることを提案するしたがって、クランプローディング反応をブックエンド。