En La Especificidad De La Interacción Entre La Saccharomyces Cerevisiae Abrazadera C Factor De Cargador De Replicación Y Preparado Plantillas De ADN Durante La Replicación Del ADN

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2002  |  Pubmed ID: 12370190

La replicación factor C (RFC) cataliza el montaje de la proliferación de las abrazaderas circulares antígeno nuclear de células de todo el ADN preparado, lo que permite la síntesis de processive por la polimerasa de ADN durante la replicación y reparación del ADN. Con el fin de realizar esta función de manera eficiente, RFC rápidamente debe reconocer ADN preparado como sustrato para la abrazadera, en particular durante la síntesis de cadena retrasada. Los informes anteriores, así como experimentos cuantitativos de unión al ADN de este estudio indican, sin embargo, que interactúa con RFC-primer plantilla, así como ADN de una sola y de doble cadena (dsDNA y ssDNA, respectivamente) con una afinidad similar alta (aparente K (d) aproximadamente 10 nm). Entonces, ¿cómo puede distinguir RFC imprimación sitios de ADN de exceso de ssDNA y dsDNA en el tenedor de replicación? Un análisis más detallado revela que a pesar de su alta afinidad por las estructuras de ADN diferentes, RFC selecciona cebador-molde de ADN incluso en presencia de un exceso de 50 veces de ssDNA y dsDNA. La interacción entre ssDNA o dsDNA y RFC es mucho menos estable que entre el ADN cebado y RFC (k (apagado)> 0,2 s (-1) frente a 0.025 s (-1), respectivamente). Proponemos que la capacidad de unirse con rapidez y liberar el ADN de una sola y de doble cadena, junto con la unión selectiva, estable al ADN-primer plantilla permite RFC para analizar el ADN de manera eficiente para los sitios de imprimación donde pueda hacer una pausa para iniciar el ensamble de la abrazadera.

Mecanismo De Carga De La Escherichia Coli DNA Polimerasa III Beta Pinza Deslizante En El ADN. Primer Bona Fide / Templates Preferentemente Dispare La Complex Gamma Para Hidrolizar ATP Y De La Carga De La Abrazadera

The Journal of Biological Chemistry. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12519754

La Escherichia coli ADN polimerasa III gamma cargador de la pinza complejo ensambla la beta en forma de anillo deslizante abrazadera en ADN. La polimerasa núcleo está atado a la plantilla por beta, lo que permite la replicación del genoma procesiva. Aquí se investiga la especificidad por el sustrato de ADN de la reacción de fijación de carga mediante la medición de la cinética de pre-estado de equilibrio de hidrólisis de la unión al ADN y ATP usando el cebador de elongación-competente y deficientes / ADN molde. El cargador de la pinza de ATP enlazado une ambos sustratos de ADN con dominio alargamiento y deficiente ya sea en presencia o ausencia de beta. Sin embargo, la elongación del ADN-competente preferentemente desencadena complejo gamma para la versión beta en el ADN con la hidrólisis concomitante de ATP. La unión a ADN-competente alargamiento convierte el complejo gamma de una alta afinidad por ATP enlazado estado a un estado de ADP enlazado a tener un 10 (5) veces menor afinidad por el ADN. En estado de equilibrio ensayos de unión son engañosas, lo que sugiere que el complejo gamma se une mucho más ávidamente a improrrogable cebador / molde de ADN, porque el reciclaje para el estado de alta afinidad de unión es limitante de la velocidad. Pre-estado estacionario datos de anisotropía de rotación revelan una dinámica de asociación-disociación del complejo gamma con imprimación extensible / templates que llevan a la conclusión diametralmente opuesta. El reconocimiento fuertemente favorecido dinámica de ADN extensible no requiere la presencia de beta. Así, el complejo gamma utiliza unión de ATP y la hidrólisis como un mecanismo para modular su interacción con el ADN en el que la forma de ATP-enlazado se une con alta afinidad a ADN, pero con dominio alargamiento-sustratos de ADN hidrólisis preferentemente gatillo de ATP y la conversión a un estado de baja afinidad .

No Coinciden Reconocimiento De Acoplamiento De Estabilización De MSH2, MSH6 En Un Estado De La ATP Con Destino Al Inicio De La Reparación Del ADN

Biochemistry. Jul, 2003  |  Pubmed ID: 12820877

De reparación de genes proteínas corregir errores en el ADN a través de un proceso de ATP impulsada. En eucariotas, el complejo MSH2-MSH6 reconoce desajustes de pares de bases y la inserción pequeña y deleciones en el ADN y la reparación de los iniciados. Tanto las proteínas MSH2 y MSH6 contienen Walker ATP vinculante motivos que sean necesarios para la actividad de reparación. Para entender cómo este par de ATP y la hidrólisis de las proteínas de unión a la unión al ADN / reconocimiento de falta de coincidencia, la actividad de la ATPasa de Saccharomyces cerevisiae MSH2, MSH6 fue examinada bajo pre-condiciones de estado estacionario. Interferente ácido experimentos revelaron que, en ausencia de ADN, MSH2-MSH6 hidroliza rápidamente ATP (velocidad de ráfaga = 3 s (-1) a 20 grados C) y luego se somete a un paso lento en la vía que limita rotación catalítica (k (gato ) = 0,1 s (-1)). ATP se hidroliza de forma similar en la presencia de ADN dúplex completamente emparejado, sin embargo, en presencia de un G: T o desajuste + T inserción que contiene el ADN, la hidrólisis de ATP está severamente suprimida (tasa = 0,1 s (-1)). Pulso y persecución experimentos revelaron que MSH2-MSH6 une ATP rápidamente en ausencia o en presencia de ADN (tasa = 0,1 microM (-1) s (-1)), lo que indica que para el complejo ADN-MSH2 Msh6.mismatched, un paso después de la unión del ATP, pero antes o en la hidrólisis de ATP es el paso limitante en la vía. Así, el reconocimiento desajuste se acopla a un aumento dramático en el tiempo de residencia de ATP en MSH2-MSH6. Este desajuste inducido, estable ATP unido a estado de MSH2, MSH6 señales de probables eventos posteriores en la vía de reparación.

La Sobreproducción Y El Análisis De Los Complejos Multiproteinas Eucariotas En Escherichia Coli Utilizando Una Estrategia De Doble Vector De

Analytical Biochemistry. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12842110

Los estudios bioquímicos de las proteínas eucariotas son a menudo limitadas por la baja disponibilidad de estos por lo general, los grandes complejos de proteínas de múltiples componentes en forma pura. Escherichia coli es un huésped comúnmente utilizados para la producción de proteínas en gran escala, sin embargo, su utilidad para la producción de proteína eucariótica es limitado debido a problemas asociados con la transcripción, la traducción y plegamiento correcto de las proteínas. A continuación se describe el desarrollo y prueba de origen vegetal, un vector que se ocupa de muchos de estos problemas al mismo tiempo. El vector de planta contiene un promotor T7 controlado por unidad de expresión, un origen de replicación p15A, y los genes de ARN de transferencia raras y la resistencia a la kanamicina. Así, el vector de planta puede ser utilizado en combinación con el vector pET a coexpresan múltiples proteínas en E. coli. El uso de este enfoque, se han producido con éxito gran cantidad de miligramos dos complejos diferentes de Saccharomyces cerevisiae en E. coli: el heterodimeric MSH2, MSH6 desajuste proteína de reparación (248kDa) y las cinco de la subunidad de replicación factor C cargador de la abrazadera (250 kDa). Los análisis cuantitativos indican que estas proteínas están en plena actividad, la afirmación de la utilidad de la planta + pET-basada en la producción de proteínas eucarióticas en E. coli para los estudios in vitro de su estructura y función.

Replication Factor C Clamp Loader Acuerdo Subunidad Dentro De La Circular Pentámero Y Sus Puntos De Fijación a La Proliferación De Antígeno Nuclear De Células

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2003  |  Pubmed ID: 14530260

La replicación factor C (RFC) es una proteína de heteropentameric AAA + cargador de la pinza del factor de proliferación celular procesividad antígeno nuclear (PCNA). El homólogo procariota, complejo gamma, es también un heteropentamer, estudios estructurales y mostrar las subunidades están dispuestas en un círculo. En este informe, Saccharomyces cerevisiae protómeros RFC son examinados para su interacción con los demás y PCNA. Los datos llevan a un modelo de orden subunidad alrededor del círculo. Una característica de la AAA + oligómeros es el uso de sitios bipartitas ATP en el que una subunidad suministra un residuo de arginina catalítico para la hidrólisis de ATP unido a la subunidad vecina. Nos parece que la RFC (3.4) es un complejo de ATPasa dependiente de ADN, y utilizar esta actividad para determinar que los suministros RFC3 una arginina catalítica en el sitio de la ATP RFC4. Esta información, combinada con la disposición de la subunidad, define la composición de los restantes sitios de ATP. Por otra parte, los subconjuntos RFC (2/3) y RFC (04.03) se unen de forma estable a PCNA, sin embargo, ni RFC2 ni RFC4 se unen fuertemente a PCNA, lo que indica que RFC3 forma un sólido punto de contacto para PCNA. La subunidad RFC1 también se une a PCNA bien, y nos identificamos dos residuos hidrófobos en RFC1 que son importantes para esta interacción. Por lo tanto, al menos dos subunidades en RFC hacer contactos fuertes con PCNA, a diferencia del complejo gamma de Escherichia coli en el que sólo una subunidad hace contacto firme con la pinza beta. Múltiples puntos de contacto estrechos con PCNA puede reflejar las demandas adicionales de la carga del anillo de trimérica PCNA en el ADN en comparación con el anillo beta dimérica.

Doble Función, De Apertura Y Reconocimiento De Pinza Primer-plantilla, Definir Una Subunidad Abrazadera Cargador Clave

Journal of Molecular Biology. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15364574

Fijar las proteínas cargador catalizar el montaje de las abrazaderas circulares de deslizamiento sobre el ADN para permitir la replicación del ADN processive. Durante la reacción, el cargador de la pinza se une cebador-molde de ADN y lo posiciona en el centro de una pinza para formar un enlace topológico entre los dos. Cargadores de Clamp son multi-proteína, como las cinco proteínas de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, y cargadores humanos, y la abrazadera de dos proteínas Pyrococcus furiosus y Methanobacterium cargadoras de sujeción thermoautotrophicum, y hasta el momento el sitio (s) responsable de la unión y la selección de imprimación -molde de ADN como el objetivo para el montaje abrazadera siguen siendo desconocidos. Para solucionar este problema, se analizó la interacción entre el gestor de gamma de E.coli abrazadera compleja y de ADN utilizando la radiación UV-inducida por la proteína-ADN enlaces cruzados y espectrometría de masas. Los resultados muestran que la subunidad delta en el complejo gamma hace contacto estrecho con la unión cebador-molde. Triptófano 279 en el delta dominio C-terminal se encuentra cerca del extremo cebador 3'-OH y pueden jugar un papel clave en el reconocimiento cebador-molde. Estudios anteriores han demostrado que el delta también se une y se abre la pinza beta (residuos hidrófobos en el dominio N-terminal de delta beta contacto. Los sitios de unión de pinza y de unión a ADN-en delta aparecen posicionados para la entrada fácil de cebador-molde en el centro de la abrazadera y la salida de la cadena molde a partir del complejo. Un análisis similar del complejo S.cerevisiae RFC sugiere que la funcionalidad de doble observado para delta en el complejo gamma puede ser cierto también para sujetar cargadores de otros organismos.

Asimétrica Unión De ATP Y Actividad De Hidrólisis De La Thermus Aquaticus Dímero MutS Es Clave Para La Modulación De Su Interacción Con El ADN No Coinciden

Biochemistry. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15476405

MutS procariotas y eucariotas proteínas MSH reconocer los desajustes de pares de bases y las inserciones o deleciones en el ADN e iniciar la reparación de genes. Estas proteínas funcionan como dímeros (y quizás oligómeros superiores de pedido) y poseen una actividad de ATPasa que es esencial para la reparación del ADN. Los estudios previos de MutS Escherichia coli y eucariotas proteínas MSH2, MSH6 han puesto de manifiesto la asimetría en el dímero con respecto a la unión al ADN como en las actividades ATPasa. Nosotros hemos encontrado el Thermus aquaticus MutS proteínas susceptibles de una investigación detallada de la naturaleza y el papel de esta asimetría. Aquí, se muestra que (a) en un dímero MutS una subunidad (S1) se une con alta afinidad de nucleótidos y el otro (S2) con 10-pliegue afinidad más débil, (b) S1 hidroliza ATP rápidamente, mientras que hidroliza S2 ATP en un 30 - 50-pliegue ritmo más lento, (c) el ADN no coinciden unión a MutS inhibe la hidrólisis de ATP en S1 pero hidrólisis lenta continúa en S2, y (d) la interacción entre el ADN no coinciden y MutS se debilita cuando ambas subunidades están ocupadas por el ATP pero se mantiene estable cuando S1 está ocupada por el ATP y S2 por ADP. Estos resultados revelan especies MutS clave en la vía de la ATPasa; S1 (ADP)-S2 (ATP) se forma preferentemente en ausencia de ADN o en la presencia de ADN completamente emparejado, mientras que S1 (ATP)-S2 (ATP) y S1 ( ATP)-S2 (ADP) se forman preferentemente en presencia de ADN no coinciden. Estas especies MutS exhiben diferencias en la interacción con ADN coincidentes que probablemente importante para el mecanismo de acción MutS en la reparación del ADN.

El Papel De Un Residuo De Glutamato Conservadas En El Escherichia Coli Mecanismo SecA ATPasa

The Journal of Biological Chemistry. Apr, 2005  |  Pubmed ID: 15710614

Escherichia coli SecA utiliza ATP para conducir el transporte de proteínas a través de las membranas celulares. Glutamato 210 en el "DEVD" motivo Walker B del SecA ATP-sitio de unión ha sido propuesto como la base catalítica para la hidrólisis de ATP (Hunt, JF, Weinkauf, S., Henry, L., Fak, JJ, McNicholas, P. , Oliver, DB, y Deisenhofer, J. (2002) Ciencia 297, 2018-2026). De acuerdo con esta hipótesis, encontramos que la mutación de glutamato 210 a resultados aspartato en una reducción de 90 veces de la tasa de hidrólisis de ATP en comparación con el tipo salvaje Seca, 0,3 s (-1) frente a 27 s (-1), respectivamente. Seca-E210D también libera ADP a un ritmo más lento en comparación con SecA tipo silvestre, lo que sugiere que además de servir como la base catalítica, el glutamato 210 podría ayudar el volumen de negocios también. Nuestros resultados contradicen un informe anterior que proponía aspartato 133 como la base catalítica (Sato, K., Mori, H., Yoshida, M., y Mizushima, S. (1996) J. Biol.. Chem. 271 de 17.439 a 17.444) . Re-evaluación de la mutante D133N-Seca utilizados en ese estudio confirma su pérdida de la ATPasa de la membrana y las actividades de la translocación, pero sorprendentemente, el análogo Seca-D133A mutante conserva plena actividad, revelando que este residuo no juega un papel clave en la catálisis.

Contribución De MSH2 Y MSH6 Subunidades De La ATPasa Asimétrica Y Actividades De Falta De Coincidencia De ADN De Enlace De Saccharomyces Cerevisiae MSH2, MSH6 Coinciden Proteínas De Reparación

DNA Repair. Feb, 2006  |  Pubmed ID: 16214425

Análisis previos de ambos Thermus aquaticus homodímero MutS y heterodímero Saccharomyces cerevisiae MSH2-MSH6 han revelado que las subunidades de los complejos de estas proteínas se unen y ATP hidrolizan asimétrica, emulando a sus propiedades de unión al ADN asimétricos. En el homodímero MutS, una subunidad (S1) se une ATP con alta afinidad y rápidamente se hidroliza, mientras que la otra subunidad (S2) se une ATP con menor afinidad y sus hidroliza a un ritmo aparentemente más lento. Interacción de MutS con los resultados de ADN que no coinciden en la supresión de la hidrólisis de ATP en el S1, pero ¿cuál de estas subunidades, S1 y S2, se pone en contacto específico con la falta de coincidencia (por ejemplo, la base de apilamiento de un residuo de fenilalanina conservado) sigue siendo desconocido. Con el fin de responder a esta pregunta y aclarar los vínculos entre la unión al ADN y las actividades de la ATPasa de cada subunidad en el dímero, que hizo mutaciones en los sitios de la ATPasa de MSH2 y MSH6 y evaluar su impacto en la actividad del heterodímero MSH2, MSH6 ( en MSH2, MSH6, sólo MSH6 se pone en contacto con la base específica de genes). Los principales resultados son: (a) MSH6 hidroliza ATP rápidamente, y por tanto se asemeja a la subunidad S1 de la homodímero MutS, (b) MSH2 hidroliza ATP a una velocidad más lenta, y por lo tanto se asemeja a la subunidad S2 de MutS, (c) en sí, aunque un ATPasa aparentemente débil, MSH2 tiene una fuerte influencia sobre la actividad de la ATPasa de MSH6, (d) MSH6 vinculante a los resultados de ADN que no coinciden en la supresión de la rápida hidrólisis de ATP, lo que revela un "cis" vínculo entre el reconocimiento y la falta de coincidencia ATPasa, (e) los resultante MSH2-MSH6 complejo, con las dos subunidades en el estado de la ATP-dependiente, presenta interacciones alteradas con el desajuste.

Los Efectos De Los Nucleótidos De ADN En MutS Cinética De Unión Clarificar El Papel De La Actividad De La ATPasa MutS De Reparación De Genes

Journal of Molecular Biology. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17207499

Proteínas MutS inicia reparación de genes con el reconocimiento de un no-Watson-Crick de pares de bases o de la base de inserción / deleción del sitio en el ADN, y sus interacciones con el ADN son modulados por la actividad de la ATPasa. A continuación, presentamos un análisis de la cinética de estas interacciones, incluyendo los efectos de la unión de ATP y la hidrólisis, informó directamente desde el sitio desajuste por fluorescencia de 2-aminopurine. Cuando libre de nucleótidos, la Thermus aquaticus MutS dímero se une un desajuste rápidamente (k (ON) = 3 x 10 (6) M (-1) s (-1)) y forma un complejo estable con una vida media de 10 s (k (OFF) = 0,07 s (-1)). Cuando uno o ambos sitios de unión de nucleótidos en el complejo de desajuste MutS * están ocupadas por el ATP, el complejo se mantiene bastante estable, con una vida media de 5-7 s (k (OFF) = 0,1-0,14 s (-1)) , aunque MutS (ATP) se convierte en incapaz de (re) unión de la falta de coincidencia. Cuando uno o ambos sitios de nucleótidos de unión en el dímero MutS están ocupadas por ADP, los MutS * Las formas complejas de desajuste rápido (K (ON) = 7.3 x 10 (6) M (-1) s (-1)) y también se disocia rápidamente, con una vida media de 0,4 s (k (OFF) = 1,7 s (-1)). La integración de estas MutS unión al ADN con la cinética se ha descrito previamente ATPasa cinética revela que: (a) en ausencia de un desajuste, MutS en forma de ADP-bound se acopla en las interacciones altamente dinámicos con ADN, quizás sondeo pares de bases por errores; ( b) en presencia de una falta de coincidencia, MutS estabilizadas en forma de ATP enlazado libera el desajuste lentamente, quizás permitiendo interacciones con proteínas de reparación in situ intermedios, (c) ATP enlazados MutS entonces se desplaza fuera del desajuste, quizás como una abrazadera móvil facilitar las reacciones de reparación en sitios distantes en el ADN, hasta que el ATP es hidrolizado (o disocia) y la proteína se vuelve más.

TIRF (ing) Revela MSH2, MSH6 Surf En El ADN

Nature Structural & Molecular Biology. Dec, 2007  |  Pubmed ID: 18059451

Residuos Conservados En La Subunidad Delta Ayuda a La E. Coli Abrazadera Cargador, Complex Gamma, Target Primer-molde De ADN De La Asamblea Clamp

Nucleic Acids Research. Jun, 2008  |  Pubmed ID: 18424802

La Escherichia coli abrazadera cargador, gamma complejo (gamma (3) deltadelta'lambdapsi), cataliza la ATP impulsada por el montaje de abrazaderas de beta en el ADN cebador-molde (p / tDNA), lo que permite la replicación processive. El mecanismo por el cual los objetivos de gamma complejos p / tDNA para el montaje de la abrazadera no se ha resuelto. De acuerdo con estudios previos, con cargo / aminoácidos polares en el interior de la cámara de la abrazadera cargador de interactuar con la doble cadena (ds) parte de la p / tDNA. Nos parece que no dsDNA, ssDNA, puede desencadenar una explosión de la hidrólisis del ATP por el complejo gamma y la abrazadera de montaje, pero sólo a concentraciones mucho más altas que p / tDNA. Por lo tanto, el contacto entre gamma complejo y dsDNA es necesario y suficiente, pero no óptimo, para la reacción, y los contactos adicionales con p / tDNA probable facilitar su selección como el sustrato óptimo para el montaje de fijación. Hemos investigado si una secuencia conservada-HRVW (279) QNRR - en la subunidad delta contribuye a esa relación, ya que triptófano-279 específicamente se entrecruza con la unión cebador-molde. La mutación de delta-W279 debilita unión gamma complejo p / tDNA, lo que dificulta su capacidad para cargar las abrazaderas y promover la replicación del ADN proccessive, y las mutaciones adicionales en la secuencia (delta-R277, el delta-R283) empeoran la interacción. Estos datos revelan una ubicación novedosa en el dominio C-terminal de la cargador de la pinza de E. coli que contribuye a la unión al ADN y ayuda a definir p / tDNA como el sustrato preferido para la reacción.

Mecanismo De Búsqueda De MutS Desajustes De ADN De Reparación Y Señalización

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 18854319

La reparación del ADN no coincide se inicia por el reconocimiento de los desajustes por las proteínas MutS. El mecanismo por el cual MutS busca y reconoce los desajustes y, posteriormente, de reparación de señales sigue siendo poco conocida. Se utilizó una sola molécula de análisis de imágenes de microscopía de fuerza atómica de los complejos de ADN MutS, junto con ensayos bioquímicos para determinar las distribuciones de los estados de conformación, las afinidades de unión a ADN, y las actividades ATPasa de tipo salvaje y dos mutantes de MutS, con alanina sustituciones en la conserva Phe-Glu-Xaa motivo de reconocimiento de desajuste. Se encuentra que el ADN homodúplex, la conservadas Glu, pero no la Phe, facilita MutS inducida ADN de flexión, mientras que a los desajustes, tanto Phe y Glu promover la formación de una conformación sin doblar. Los datos revelan un papel inusual para el residuo Phe en que promueve la inflexible, no plegado, de ADN en sitios desajuste. Además, la formación de la específica sin doblar MutS-ADN conformación a desajustes parece ser necesario para la inhibición de la hidrólisis de ATP por MutS que señales de iniciación de la reparación. Estos resultados proporcionan una explicación estructural para el mecanismo por el cual MutS búsquedas de desajustes y reconoce y para los fenotipos observados de mutantes con sustituciones en el motivo Phe-Xaa-Glu.

Estructura De Una Forma Mutante De La Proliferación De Antígeno Nuclear De Células Que Bloquea La Síntesis De ADN Translesion

Biochemistry. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 19053247

La proliferación de células antígeno (PCNA) es una proteína homotrimérico que funciona como una pinza deslizante durante la replicación del ADN. Varias formas mutantes de PCNA que la síntesis de ADN bloque translesion han sido identificados en los estudios genéticos en levadura. Una de tales proteínas mutantes (codificada por el alelo rev6-1) es una glicina a la sustitución de serina en el residuo 178, situado en la interfaz subunidad de PCNA. Para mejorar nuestra comprensión de cómo esta sustitución interfiere con la síntesis translesion, hemos determinado la estructura cristalina de rayos-X de la proteína PCNA G178S mutante. Esta sustitución tiene poco efecto sobre la estructura del dominio en el que la sustitución se produce. En su lugar, los cambios significativos, estructurales locales se observan en la subunidad adyacente. La diferencia más notable entre las estructuras de mutantes y de tipo salvaje se encuentra en un solo lazo, extendida (que comprende los residuos de aminoácidos 105-110), lo que llamamos ciclo J. En la estructura de la proteína mutante, el bucle J adopta una conformación muy diferente en la que el átomos del esqueleto de la proteína se han movido por tanto como 6,5 A desde sus posiciones en la estructura de tipo salvaje. Para mejorar nuestra comprensión de las consecuencias funcionales de este cambio estructural, hemos examinado la capacidad de esta proteína mutante para estimular la incorporación de nucleótidos por la ADN polimerasa eta (Pol eta). Los estudios cinéticos en estado estable muestran que, aunque de tipo salvaje PCNA estimula la incorporación de Pol eta frente a un sitio abasic, el mutante de la proteína PCNA en realidad inhibe la incorporación al frente de esta lesión del ADN. Estos resultados muestran que la posición de bucle J en PCNA desempeña un papel esencial para facilitar la síntesis translesion.

Mecanismo De ATP Impulsada Por La Abrazadera De Carga PCNA Por S. Cerevisiae RFC

Journal of Molecular Biology. May, 2009  |  Pubmed ID: 19285992

Circular abrazaderas de sujeción para las polimerasas de ADN, que sirven como factores esenciales en procesividad la replicación del genoma, y ​​la función en otros procesos celulares críticos también. Sujetar cargadores catalizar conjunto de abrazadera en el ADN, y la cuestión de cómo estas proteínas construir un enlace topológico entre una abrazadera y el ADN, especialmente el mecanismo por el cual el ATP se utiliza para la tarea, permanece abierta. A continuación se describe pre-análisis del estado estacionario de la hidrólisis de ATP, la proliferación de células antígeno nuclear (PCNA) apertura mordaza, y la unión al ADN por Saccharomyces cerevisiae factor de replicación C (RFC), y presentar el primer modelo de cinética de un eucariota abrazadera de carga de la reacción validada mediante el análisis de datos global. Unión a múltiples subunidades RFC ATP inicia un lento cambio conformacional en el cargador de la pinza, que le permite unirse y abrir PCNA y de unirse al ADN también. Abertura PCNA bloquea RFC en un estado activo, y el resultante RFC.ATP.PCNA ((abierto)) intermedia está listo para la entrada de ADN en la abrazadera. De unión al ADN se compromete RFC para la hidrólisis de ATP, que es seguido por PCNA cierre y liberación PCNA.DNA. Este modelo permite la comprensión cuantitativa del mecanismo de varios pasos de un cargador de la pinza eucariotas y, además, facilita el análisis comparativo de los cargadores de diversos organismos.

Mecanismo De La Inhibición Mediada Por El Cadmio De MSH2, MSH6 En Función De Reparación De Genes De ADN

Biochemistry. Oct, 2009  |  Pubmed ID: 19320425

La observación de que el Cadmio (Cd (2 +)) inhibe MSH2, MSH6, que es responsable de identificar los desajustes de pares de bases y otras discrepancias en el ADN, ha dado lugar a la propuesta de que la supresión selectivo de esta proteína y la consecuente reparación del ADN o la apoptosis promover la los efectos carcinogénicos de la toxina del heavy metal. Se ha sugerido que el Cd (2 +) la unión a sitios específicos en MSH2-MSH6 bloquea su unión al ADN y las actividades ATPasa. Para investigar el mecanismo de la inhibición, se midió Cd (2 +) la unión a MSH2, MSH6, directamente y mediante el control de cambios en la estructura de la proteína y la actividad enzimática. Ajuste global de los datos a un modelo de multiligand vinculante reveló que la unión de alrededor de 100 Cd (2 +) iones por MSH2, MSH6 resultados en su inactivación. Este hallazgo indica que el efecto inhibidor de Cd (2 +) se produce a través de un mecanismo no específico. Cd (2 +) y las interacciones MSH2, MSH6 participación de los grupos sulfhidrilo de cisteína, y el CD de alta (2 +): MSH2, MSH6 relación implica otros ligandos como la histidina, aspartato, glutamato y el esqueleto del péptido también. Nuestro estudio también muestra que el cadmio inactiva varias enzimas no relacionadas de manera similar, de acuerdo con un mecanismo de inhibición no específica. Focalización de una variedad de proteínas, incluyendo MSH2-MSH6, de esta manera genérica explicaría el marcado de amplio espectro impacto de Cd (2 +) en los procesos biológicos. Proponemos que la presencia de Cd inespecífica múltiples (2 +) los sitios de unión sobre las proteínas y su propensión a cambiar la conformación de la interacción con Cd (2 +) son esenciales para determinar la susceptibilidad de los sistemas biológicos correspondientes al cadmio toxicidad.

Modelo Basado En El Análisis Global De Los Heterogéneos Datos Experimentales Utilizando Gfit

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2009  |  Pubmed ID: 19399438

El análisis de regresión es indispensable para la comprensión cuantitativa de los sistemas biológicos y precisos para el desarrollo de modelos computacionales. Mediante la aplicación de análisis de regresión, se puede validar los modelos y cuantificar los componentes del sistema, incluidos los que no pueden observarse directamente. Mundial (simultánea) el análisis de todos los datos experimentales disponibles para el sistema produce los resultados más informativos. Para cuantificar los componentes de un sistema complejo, el conjunto de datos debe contener experimentos de diferentes tipos realizadas bajo una amplia gama de condiciones. Sin embargo, la heterogeneidad de este tipo de datos complica la aplicación del análisis global. Los modelos computacionales de forma continua evolucionar para incluir los nuevos conocimientos y para dar cuenta de nuevos datos experimentales, la creación de la demanda de procedimientos de análisis flexible y eficiente. Para solucionar estos problemas, hemos desarrollado un software para analizar el mundo gfit muchos tipos de experimentos, para validar los modelos computacionales, y para extraer la máxima información de los datos experimentales disponibles.

Saccharomyces Cerevisiae MSH2, MSH6 Cinética De Unión De ADN Revela Un Mecanismo De La Orientación De Sitios Para La Reparación Del ADN No Coincide

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 20080735

La falta de coincidencia de ADN sistema de reparación (MMR) identifica los errores de replicación y las bases dañadas en el ADN y las funciones de preservar la integridad genómica. MutS lleva a cabo la tarea de localizar pares de bases que no coinciden, los bucles y las lesiones y el inicio de la triple viral y la cuestión fundamental de cómo esta proteína se dirige sitios específicos en el ADN no se ha resuelto. Para abordar esta cuestión, hemos examinado las interacciones entre Saccharomyces cerevisiae MSH2, MSH6, un homólogo MutS eucariota, el ADN y en tiempo real. La cinética de reacción revelan que MSH2-MSH6 une una variedad de sitios en similarmente altas velocidades (K (ON) de aproximadamente 10 (7) M (-1) s (-1)), y su selectividad se manifiesta en las tasas diferenciales de disociación; por ejemplo, la proteína libera una aminopurina-2: un par de bases T de aproximadamente 90 veces más rápido que un G: T desajuste. Al soltar el 2-AP: sitio T, MSH2-MSH6 es capaz de moverse lateralmente en el ADN para localizar una G en las inmediaciones: T sitio. La larga vida MSH2-Msh6.G: Complejo T activa el siguiente paso en la triple vírica - formación de una abrazadera de la ATP-bound - con más eficacia que el de breve duración-MSH2 Msh6.2-Ap: Complejo T. La mutación de Glu en la conserva Phe-X-Glu motivo de unión al ADN estabiliza MSH2, MSH6 (E339A) 0.2-AP: complejo de T, y el mutante puede ser señal de 2-AP: reparación de T la misma eficacia que los de tipo salvaje MSH2, MSH6 señales G: T reparación. Estos hallazgos sugieren un mecanismo de selección mediante el cual MSH2, MSH6 exploraciones de ADN, interrogar a los pares de bases por los contactos transitorios y deteniéndose en los sitios de destino potenciales, y cuanto mayor sea la pausa mayor es la probabilidad de MMR.

Humano MSH2 (hMSH2) Proteína Controla ATP De Procesamiento Por HMSH2-hMSH6

The Journal of Biological Chemistry. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 21937421

La mecánica de hMSH2-hMSH6 unión de ATP y la hidrólisis son críticos para varios mecanismos propuestos para la reparación de apareamientos erróneos (MMR), que a su vez se basan en la coordinación detallada de procesamiento de la ATP entre los distintos hMSH2 y hMSH6 subunidades. Aquí nos muestran que hMSH2-hMSH6 está estrictamente controlada por hMSH2 y el magnesio en un complejo con ADP (hMSH2 (magnesio-ADP)-hMSH6). La desestabilización de los resultados de magnesio en la liberación de ADP de hMSH2 que permite una alta afinidad de unión del ATP por hMSH6, que a su vez mejora la unión del ATP de hMSH2. Ambas subunidades debe ser enlazado a ATP para formar eficazmente una pinza deslizante estable hMSH2-hMSH6 hidrólisis-independiente que se requiere para MMR. En la presencia de magnesio, las abrazaderas de ATP enlazados correderas permanecen en el ADN de ~ 8 min. Estos resultados sugieren un mecanismo preciso por pasos cinética de hMSH2-hMSH6 funciones que parece imitar interruptores de proteínas G, que limita severamente los modelos de triple vírica, y en parte puede explicar la frecuencia del alelo MSH2 en el síndrome de Lynch o cáncer colorrectal hereditario no polipósico.

Alosterismo Dinámica En El Mecanismo De Acción De MutS De ADN De Falta De Coincidencia De Proteínas De Reparación

Biophysical Journal. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 21961599

Las proteínas multidominio MutS Thermus aquaticus y sus homólogos procariotas y eucariotas reconocer los errores de replicación del ADN e iniciar la reparación de genes. Acciones MutS son alimentadas por la unión y la hidrólisis de ATP, que modulan su interacción con el ADN y otras proteínas en la vía reparador de desajustes. La unión al ADN y las actividades ATPasa se alostéricamente acoplado a una distancia de ~ 70 Å, y el mecanismo molecular de acoplamiento no ha sido aclarado. Para solucionar este problema, todos los átomos de simulaciones de dinámica molecular de ~ 150 ns, incluyendo solvente explícito se realizaron en dos complejos de clave-ATP-consolidados y MutS ATP sin ⋅ ADN (+ T bulto). Se utilizó el análisis de componentes principales en el espacio para evaluar las fluctuaciones ATP ligando los cambios inducidos en la estructura y la dinámica MutS. Los conjuntos moleculares dinámicas-calculados de las estructuras térmicamente accesibles mostraron diferencias notablemente pequeñas entre los dos complejos. Sin embargo, el análisis de la covarianza de las fluctuaciones dinámicas de manifiesto una serie de interresidue potencialmente significativo y acoplamientos entre dominios. Además, el análisis de componentes principales reveló grupos de correlacionados fluctuaciones atómicos que unen el ADN y los sitios de unión de nucleótidos, especialmente en las MutS ATP enlazados ⋅ ADN (+ T) complejos. Estos resultados apoyan la idea de que alosterismo entre los sitios de unión de nucleótidos de ADN y en MutS puede ocurrir a través de los cambios inducidos por ligando en movimiento, es decir, alosterismo dinámico.

ATP Vinculante Y Controladas Por La Hidrólisis Determinar La Tasa De Eventos-en La Reacción Catalizada Por RFC-PCNA Cargando Clamp

Journal of Molecular Biology. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22197378

La subunidad de varios de replicación factor C (RFC) cargas complejas circulares antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) Se sujeta en el ADN, donde sirven como correas móviles de polimerasas y coordinar las funciones de muchas otras proteínas de ADN metabólicos. La reacción de carga pinza es complejo, con múltiples componentes (RFC, PCNA, ADN y ATP) y eventos (como mínimo: PCNA apertura / cierre, la liberación de unión al ADN /, y la unión del ATP / hidrólisis) que producen una pinza topológicamente relacionados · producto de ADN en menos de un segundo. En este sentido, el informe previo a las medidas de estado estacionario de varios pasos en la reacción catalizada por Saccharomyces cerevisiae RFC y presentar un modelo integral basado en el análisis cinético global de los datos. Aspectos destacados del mecanismo de reacción que son de unión del ATP al RFC inicia la activación lenta del cargador de la pinza, lo que le permite abrir PCNA (a ~ 2 s (-1)) y se unen-primer molde de ADN (ptDNA). Rápida unión de ptDNA conduce a la formación de la RFC · ATP · PCNA (abierto) complejo · ptDNA, que cataliza una ráfaga de hidrólisis de ATP. Otro paso lento en la reacción siguiente hidrólisis de ATP y se asocia con PCNA cierre alrededor ptDNA (8 s (-1)). La disociación de PCNA · ptDNA de RFC conduce a la rotación de catalizador. Proponemos que estos principios y fines que determinan la tasa de eventos son intramoleculares cambios conformacionales en el RFC y PCNA que la apertura y cierre de pinza de control, y que la unión y la hidrólisis de ATP interruptor RFC entre conformaciones con afinidades de alta y baja, respectivamente, para abrir PCNA y ptDNA, y por lo tanto la reacción de carga bookend abrazadera.

Un Punto Central En El Cargador Giratorio RFC Clamp PCNA Controles De Apertura Y Carga En El ADN

Journal of Molecular Biology. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22197374

La replicación factor C (RFC) es un complejo de cinco subunidades que las cargas de antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) abrazaderas en el ADN cebador-molde (ptDNA) durante la replicación. Subunidades RFC pertenecen a la AAA (+) superfamilia, y su actividad de ATPasa impulsa las interacciones entre el cargador de la pinza, la pinza, y la ptDNA, llevando a topológicamente ligado PCNA · ptDNA. Se presenta la cinética de eventos transitorios en Saccharomyces cerevisiae carga RFC catalizada por PCNA, incluyendo ATP inducida por la activación de RFC, la apertura de PCNA, ptDNA vinculante, la hidrólisis de ATP, cierre PCNA, y PCNA · Lanzamiento ptDNA. Esta perspectiva detallada permite la evaluación de individuo RFC-A, RFC-B, C-RFC, RFC-D, y RFC-E funciones subunidad en el mecanismo de reacción. Las funciones han sido atribuidas a las subunidades RFC con anterioridad sobre la base de un análisis de estado estacionario de los mutantes de la ATPasa-arginina-dedo ", sin embargo, pre-análisis del estado estacionario proporciona un punto de vista diferente. La subunidad central RFC-C sirve como un punto crítico del eslabón giratorio en el cargador de la pinza. La unión a esta subunidad ATP inicia la activación de RFC, y el cargador de la pinza adopta una conformación en espiral que se estabiliza PCNA en una espiral abierta correspondiente. La importancia de la respuesta de la subunidad RFC a la disminución de unión del ATP como RFC-C> RFC-D> RFC-B, con RFC-A innecesarias. RFC-C-dependiente de la activación del RFC también permite ptDNA vinculante, lo que lleva a la formación de la ATP · · RFC PCNA (abierto) · ptDNA compleja. Tras la hidrólisis de ATP conduce al complejo de la disociación, con RFC-D la actividad que más contribuyen a la rápida liberación de ptDNA. La función esencial del núcleo subunidad ATPasa RFC-B/C/D en la carga de la abrazadera es consistente con la localización similar central de las tres subunidades ATPasa activos del cargador de la pinza de Escherichia coli.