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Articles by Manjunath Hegde in JoVE
JoVE General
Mikrofluidik-Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien für die Untersuchung Löslich Signal-vermittelte Wechselwirkungen
1McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University
Dieses Protokoll beschreibt eine mikrofluidische Co-Kultur-Modell für die gleichzeitige und lokalisierte Kultur von Epithelzellen und Bakterien. Dieses Modell kann zur Untersuchung der Rolle der verschiedenen löslichen molekularen Signalen auf Pathogenese sowie Bildschirm die Wirksamkeit der vermeintlichen probiotischen Bakterienstämmen verwendet werden können.
Other articles by Manjunath Hegde on PubMed
Wirkungen Von Adrenalin, Noradrenalin Und Indol Auf Escherichia Coli O157: H7, Chemotaxis, Kolonisation Und Gen Ausdruck
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157: H7 ist während der Infektion im Magen-Darm-Trakt eine Vielzahl von Molekülen wie der eukaryotischen Hormone Adrenalin und Noradrenalin und bakterielle Signalmoleküle wie Indol Signalisierung ausgesetzt. Da diese signalisierende Moleküle erwiesen haben, die Regulierung der Phänotypen wie Motilität und Virulenz beteiligt, die ausschlaggebend für EHEC-Infektionen sind, vermutet wir, dass diese Moleküle auch die Ersterfassung der Dickdarm Umwelt und Anlage an der Zelloberfläche Host regieren. Hier berichten wir, dass im Vergleich zu Indol, Epinephrin und Norepinephrin üben unterschiedliche Auswirkungen auf EHEC Chemotaxis, Motilität, Biofilm-Bildung, Genexpression und Kolonisierung von HeLa-Zellen. Mit einem neuartigen zwei-Fluorophor Chemotaxis Assay, ergab, dass EHEC Epinephrin und Norepinephrin angezogen wird, während es von Indol abgestoßen wird. Darüber hinaus erhöht Epinephrin und Norepinephrin auch EHEC Motilität und Biofilm Formation während Indol diese Phänotypen abgeschwächt. DNA Microarray Analyse der Oberfläche-assoziierten EHEC erkennen, dass das Adrenalin/Noradrenalin oben-geregelt die Expression von Genen beteiligt Oberfläche Kolonisation und Virulenz während Exposition gegenüber Indol ihren Ausdruck sank. Die Gen-Ausdruck-Daten auch vorgeschlagen, dass die Autoinducer 2-Aufnahme bei Gefährdung durch Adrenalin/Noradrenalin aber nicht Indol unterdrückt wurde. Einhaltung der in-vitro-Experimente bestätigt, dass Adrenalin und Noradrenalin um Verbundenheit mit Epithelzellen, während das Indol Einhaltung sank. Zusammen genommen zufolge diesen Ergebnissen Epinephrin und Norepinephrin EHEC Infektion erhöhen, während Indol den Prozess dämpft.
Droge Auslastung Muster in Dental Ambulant in Tertiär-Lehrkrankenhaus in Westliche Nepal
Eine hohe Inzidenz von Zahnerkrankungen wurde in Nepal berichtet. Frühere Studien, sowohl in der Manipal Teaching Hospital, Pokhara, Nepal, und anderen Zentren offenbart Probleme bei der Verwendung von Medikamenten in der Zahnmedizin. Eine Reihe von Initiativen zur Verbesserung der Verschreibung wurden durchgeführt. Die hier vorgestellte Studie wurde zur Bewertung der Auswirkungen dieser Initiativen zur Droge Auslastung unter dental ambulant durchgeführt. Die Studie wurde bei Patienten, die Teilnahme an der zahnärztlichen Poliklinik des Krankenhauses über einen Zeitraum von sechs Monaten durchgeführt. Demografische Informationen wurden untersucht. Die Droge Klassen und individuelle Medikamente wurden aufgezeichnet. Die Kosten für Medikamente wurde berechnet unter Verwendung der ambulanten Apotheke-Preisliste. Die Rezepte wurden analysiert mit die WHO / INRUD Verschreibung von Indikatoren. Anomalien wurden bei Verschreibung festgestellt. Verbesserung wurde bei bestimmten Parametern, die im Vergleich zu früheren Studien festgestellt. Die Bildungsinitiativen sollte gestärkt werden. Leitende Interventionen können betrachtet werden. Weitere Studien sind erforderlich.
Indol Zelle Signalisierung Tritt Vor Allem Bei Niedrigen Temperaturen in Escherichia Coli
Wir haben gezeigt, dass die Quorum-sensing-Signale Acylhomoserine Lactone, Autoinducer-2 (AI-2) und Indol beeinflussen die Biofilm-Bildung von Escherichia coli. Hier untersuchen wir, wie die Umwelt, d. h. Temperatur, Indol und AI-2 signalisieren in E. Coli auswirkt. Wir zeigen in Biofilmen, dass Indol-Zusatz zu umfangreicher differenzielle Genexpression bei 30 Grad C (186-Gen) führt bei 37 Grad C (59-Gen), das Indol Biofilm-Bildung vermindert also (ohne Wachstum) deutlich stärker bei 25 und 30 Grad C als bei 37 Grad C und die Wirkung der Quorum-sensing Protein SdiA zugeordnet ist. Der Zusatz von Indol bei 30 Grad C im Vergleich zu 37 Grad C erheblich unterdrückt Gene Uridin Monophosphat (UMP) Biosynthese (CarAB, PyrLBI, PyrC, PyrD, PyrF und Upp) und Uracil-Transport (UraA) beteiligt. Diese Uracil-bezogenen Gene sind auch bei 30 Grad C von SdiA, unterdrückt, die bestätigt, dass Indol Signalisierung SdiA beteiligt ist. Auch im Vergleich zu 37 Grad C, Indol deutlich stärker gesunken Flagellen-bezogene QseB, FlhD und FliA-Promotor-Aktivität, verbessert Antibiotikaresistenz und gehemmt Zellteilung bei 30 Grad C. Im Gegensatz zu Indol und SdiA, der Zusatz von (S) - 4,5 - Dihydroxy-2,3-Pentanedione (AI-2-Vorläufer) führt zu umfangreicher differenzielle Genexpression bei 37 Grad C (63-Gen) als bei 30 Grad C (11-Gen) und, statt zu unterdrücken die UMP-Synthese-Gene, AI-2 induziert sie bei 37 Grad C (aber nicht bei 30 Grad C). Auch der Zusatz von AI-2 induziert die Transkription von Virulenzgene in Enterohemorrhagic E. Coli O157: H7 bei 37 Grad C, aber nicht bei 30 Grad C. also Zelle Signale verursachen unterschiedliche Reaktionen bei unterschiedlichen Temperaturen und Indol und AI-2-basierte Signalisierung sind miteinander verflochten.
Die Neuroendokrine Hormon Noradrenalin Erhöht Pseudomonas Aeruginosa PA14 Virulenz Durch Die Las Quorum-sensing Weg
Es wurde vorgeschlagen, dass die Magen-Darm-Trakt-Umgebung mit hohen gehalten an neuroendokrine Hormone für Darm-abgeleitet von Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen wichtig. In dieser Studie berichten wir, dass das Hormon Noradrenalin p. Aeruginosa PA14 Wachstum, Virulenz Faktor Produktion, Invasion der HCT-8 Epithelzellen und Schwimmen Motilität Konzentration-abhängigen Weise erhöht. Transkriptom-Analyse von p. Aeruginosa ausgesetzt 500 MicroM, aber nicht 50 MicroM Noradrenalin für 7H zeigte, dass Genen, die in der Verordnung die Virulenz Determinanten Pyocyanin, Elastase und Pseudomonas Quinolone Signal (PQS, 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone) herraufreguliert. Die Produktion von Rhamnolipids, die auch bei p. Aeruginosa-Infektionen wichtig sind, war nicht signifikant geändert Suspensionskulturen nach Exposition gegenüber 500 MicroM Noradrenalin doch sank auf halbfeste Oberflächen. Ausschwärmen Motilität, einem Phänotyp, die direkt von Rhamnolipids, beeinflusst ist wurde auch auf 500 MicroM Noradrenalin Belichtung verringert. Die Erhöhung in der transcriptional Aktivierung LasR aber nicht, dass der RhlR und in den Ebenen der PQS legen nahe, dass die Wirkung von Noradrenalin vermittelt werden, vor allem durch die Las Quorum-sensing Weg. Unsere Daten empfehle zusammen, dass Noradrenalin eine wichtige Rolle im Darm abgeleitete Infektionen spielen kann, durch die Erhöhung der Pathogenität von p. Aeruginosa PA14.
Kokulturen Von Epithelzellen Und Bakterien Für Die Untersuchung Von Host-Pathogen Interaktionen
Die menschlichen Gastrointestinaltrakt (GI) ist eine einzigartige Umgebung, die in der intestinalen Epithelzellen und nicht-pathogenen (Kommensale) Bakterien nebeneinander existieren. Dieses Gleichgewicht wird durch den Eintrag von Krankheitserregern in der GI-Trakt umwerfen. Ein wichtiger Schritt im Prozess Infektion ist die Navigation des Erregers über die Kommensale bakterielle Schicht Epithelzellen beimessen. Es wurde vorgeschlagen, dass die Untersuchungsverfahren, die den Erreger in der Kommensale Ebene findet eine bedeutende Rolle bei der Festsetzung des Umfangs der Anlage und Kolonisierung spielt. Aktuelle Kultur-Methoden zur Untersuchung der Erreger Kolonisation eignen sich nicht gut für diese Hypothese zu untersuchen, da sie nicht aktivieren Kokulturen von Bakterien und Epithelzellen in einer Weise, die die GI-Trakt Mikromilieu imitiert. Hier berichten wir über die Entwicklung eines mikrofluidische Kokulturen-Modells, das unabhängige Kultur aus eukaryotischen Zellen und Bakterien und testen die Wirkung der Kommensale Mikromilieu auf Erreger Kolonisation ermöglicht. Eine pneumatisch betätigte System entwickelte Form reversibel Inseln, die Entwicklung der bakteriellen Biofilm zusammen mit der Kultur der eine Monolage Epithelialer Zellen zu ermöglichen. Kokulturen Modell zur Entwicklung eines Kommensale Escherichia-coli-Biofilms unter HeLa-Zellen, gefolgt von Einführung der Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) in der Kommensale Insel, in einer Sequenz, die die Abfolge der Ereignisse im GI-Trakt-Infektion nachahmt. Mit Wildtyp E. Coli und TnaA Mutanten (fehlt das Signal Indol) als Kommensale Bakterien, zeigen wir, dass die Kommensale Biofilm Mikromilieu ein entscheidender Faktor für EHEC-Infektiosität und Virulenz. Unser Modell hat das Potenzial, in grundlegenden Studien untersuchen die Wirkung von GI-Trakt Signale auf EHEC Virulenz ebenso wie für Screening von verschiedenen probiotischen Stämme für modulierenden Pathogen Infektiosität in GI-Trakt verwendet werden.
Chemotaxis Auf Das Quorum Sensing Signal AI-2 Erfordert Die Tsr-Chemorezeptor Und Der Periplasmatischen LsrB AI-2-verbindliches Protein
AI-2 ist ein Autoinducer von vielen Bakterien gemacht. LsrB bindet AI-2 in der Periplasm und Tsr ist die l-Serin-Chemorezeptor. Wir zeigen, dass AI-2 Escherichia coli stark anzieht. LsrB und Tsr sind notwendig zur Erfassung von AI-2, aber AI-2 Aufnahme ist nicht, was darauf hindeutet, dass LsrB und Tsr direkt in die Periplasm interagieren.
Synthetische Quorum-sensing-Schaltung Konsortialen Biofilm-Entstehung Und Ausbreitung in Einem Microfluidic-Gerät Zu Steuern
Sie müssen für die Nutzung von Biofilmen für chemischen Umwandlungen in Bioraffinerien gesteuert und ersetzt werden. Zuvor, engineered wir die globale Aufsichtsbehörden Hha und zyklische Diguanylate-Bindung BdcA Proteine zu erstellen, die Biofilm Zerstreuung zu aktivieren. Hier berichten wir eine Biofilm-Schaltung, die diese zwei Zerstreuung Proteine zusammen mit einer Bevölkerung-gesteuerte Quorum-sensing-Switch verwendet. Mit dieser synthetischen Schaltung, in einem Roman mikrofluidische Gerät wir bilden eine erste Kolonisator Biofilm, eine zweite Zelltyp (Dispergatoren) in diese vorhandenen Biofilm einführen, eine robuste Dual-Arten-Biofilm zu bilden und verdrängen die erste Kolonisator-Zellen in der Biofilm mit eine extrazelluläre Signal aus den Zellen Disperser. Wir entfernen auch Disperser Biofilms einen chemisch induzierte Schalter und die konsortiale Bevölkerung konnte zu optimieren. Daher haben zum ersten Mal Zellen entwickelt worden, die sind in der Lage, eine vorhandene Biofilm zu verdrängen und dann entfernt werden, auf Befehl erlaubt konsortialen Biofilm Formation für verschiedene Anwendungen zu steuern.
Mikrofluidische Gerät Für Hochdurchsatz-bakterielle Biofilm-Studien
Bakterien sind fast immer als Matrix-ummantelt, Oberfläche-assoziierte, artenübergreifenden Gemeinschaften bekannt als Biofilme in ökologische Nischen gefunden. Es steht fest, dass lösliche chemische Signale, die von den Bakterien erzeugten die Organisation und Struktur des Biofilms zu beeinflussen; Daher gibt es erhebliche Interesse verstehen, wie verschiedene chemische Signale sind für Gemeindeentwicklung coordinately genutzt. Herkömmliche Methoden zur Untersuchung von Biofilm-Bildung wie Makro-Maßstab-Durchflusszellen sind niedrig-Durchsatz und erfordern große Mengen erlauben keine räumliche und zeitliche Steuerung der Biofilm-Gemeinschaft-Formation. Hier beschreiben wir die Entwicklung von ein PDMS-basierte zweilagigen mikrofluidische fließen Zelle (μFC) Gerät zur Untersuchung der bakteriellen Biofilm-Bildung und Organisation an verschiedenen Konzentrationen an löslichen Signale. Das μFC-Gerät enthält acht separate Microchambers für den Anbau von Biofilmen acht verschiedene Konzentrationen der Signale über einen einzigen diffusiven mischen-basierte Konzentrationsgradienten Generator ausgesetzt. Das Vorhandensein von Pneumatikventile und eine separate Zelle Aussaat Port ein, der unabhängig vom Farbverlauf-mischen-Kanäle bietet vollständigen Isolierung der Biofilm-Microchamber von den Farbverlauf Mixer und auch gut unter kontinuierlicher, Batch oder Semi-batch Bedingungen führt. Wir demonstrieren die Nützlichkeit der μFC durch das Studium der Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von Indol-wie Biofilm-Signalen (7-Hydroxyindole und Isatin), einzeln oder in Kombination, Biofilm-Entwicklung von pathogenen E. Coli. Dieses Modell kann verwendet werden, für die Entwicklung eines grundlegenden Verständnis der Vorgänge um bakterielle Bindung an Flächen, die sind wichtig, Infektionen und Chemikalien, die die Biofilm-Bildung oder Hemmung beeinflussen.
