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Articles by Manjunath Hegde in JoVE
JoVE General
Microfluidica Co-coltura di cellule epiteliali e batteri per le indagini solubile del segnale mediato da Interazioni
1McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University
Questo protocollo descrive un microfluidica co-coltura modello per la cultura contemporanea e localizzato delle cellule epiteliali e batteri. Questo modello può essere utilizzato per indagare il ruolo dei diversi segnali solubili molecolare sulla patogenesi e schermo l'efficacia del putativo ceppi batterici probiotici.
Other articles by Manjunath Hegde on PubMed
Effetti Differenziali Di Epinefrina, Norepinefrina E Indolo Su Escherichia Coli O157: H7, Chemiotassi, Colonizzazione E Gene Expression
Durante l'infezione nel tratto gastrointestinale, enteroemorragica Escherichia coli (EHEC) O157: H7 è esposta ad una vasta gamma di molecole, tra cui l'eucariotica ormoni epinefrina e norepinefrina e molecole segnale batterica come indolo di segnalazione. Poiché queste molecole di segnalazione hanno dimostrate di essere coinvolti nella regolazione di fenotipi come motilità e virulenza che sono cruciali per le infezioni di EHEC, abbiamo ipotizzato che queste molecole regolano anche il riconoscimento iniziale dell'intestino crasso ambiente e attaccamento alla superficie della cellula ospite. Qui, segnaliamo che, rispetto a indolo, epinefrina e norepinefrina esercitare effetti divergenti sulla chemiotassi EHEC, motilità, formazione di biofilm, espressione genica e colonizzazione delle cellule HeLa. Utilizzando un'analisi di chemiotassi romanzo due-fluoroforo, è stato trovato che EHEC è attratto da epinefrina e norepinefrina, mentre esso è respinto da indolo. Inoltre, epinefrina e norepinefrina anche aumentata motilità EHEC e formazione di biofilm mentre indolo attenuato questi fenotipi. Analisi microarray del DNA di superficie associato EHEC indicano che adrenalina/noradrenalina up-regolata l'espressione di geni coinvolti nella colonizzazione superficiale e virulenza mentre l'esposizione a indolo diminuito la loro espressione. I dati di espressione genica ha anche suggerirono che assorbimento autoinducer 2 è stato represso all'esposizione di adrenalina/noradrenalina ma non indolo. Esperimenti in vitro aderenza ha confermato che epinefrina e norepinefrina aumentato attaccamento alle cellule epiteliali mentre indolo diminuita aderenza. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che epinefrina e norepinefrina aumentare infezione da EHEC mentre indolo attenua il processo.
Modello Di Utilizzo Della Droga in Pazienti Ambulatoriali Odontoiatriche in Cura Terziaria Teaching Hospital Nel Nepal Occidentale
Un'alta incidenza di malattia dentale è stata segnalata in Nepal. Studi precedenti, entrambi nel Teaching Hospital Manipal, Pokhara, Nepal e altri centri ha rivelato problemi nell'uso di farmaci in odontoiatria. Una serie di iniziative per migliorare la prescrizione è stata effettuata. Lo studio qui presentato è stato intrapreso per valutare l'impatto di queste iniziative sull'utilizzo della droga tra i pazienti ambulatoriali odontoiatriche. Lo studio è stato condotto tra pazienti che frequentano il reparto di odontoiatria ambulatoriale dell'ospedale per un periodo di sei mesi. Dati demografici sono stati studiati. Le classi di droga e i singoli farmaci prescritti sono stati registrati. Il costo dei farmaci è stato calcolato utilizzando il listino prezzi farmacia ambulatoriale. Le prescrizioni sono state analizzate utilizzando il WHO / INRUD prescrivere gli indicatori. Anomalie sono state notate nella prescrizione. Miglioramento è stato osservato in determinati parametri rispetto a studi precedenti. Le iniziative educative devono essere rafforzate. Possono essere considerati interventi gestionali. Ulteriori studi sono necessari.
Indolo Segnalazione Cellulare Si Verifica Principalmente Alle Basse Temperature in Escherichia Coli
Abbiamo dimostrato che il quorum sensing segnali lattoni acylhomoserine, autoinducer-2 (IA-2) e indolo influenza la formazione di biofilm di Escherichia coli. Qui, indaghiamo su come l'ambiente, cioè, temperatura, colpisce indolo e IA-2 segnalazione in e. coli. Vi mostriamo in biofilm che aggiunta indolo conduce alla più ampio espressione genica differenziale a 30 gradi C (186 geni) rispetto a 37 gradi C (59 geni), indolo che riduce la formazione di biofilm (senza intaccare la crescita) più significativamente a 25 e 30 gradi C rispetto a 37 gradi C e che l'effetto è associato con la proteina quorum sensing SdiA. L'aggiunta di indolo a 30 gradi C rispetto a 37 gradi C più significativamente represso geni coinvolti nella biosintesi di Uridina monofosfato (UMP) (carri, pyrLBI, pyrC, pyrD, pyrF e upp) e trasporto uracile (uraA). Questi geni correlati a uracile sono repressi anche a 30 gradi C da SdiA, che conferma che SDIa è coinvolto nella segnalazione dell'indolo. Inoltre, rispetto ai 37 gradi C, indolo più significativamente diminuito flagelli-qseB, flhD e fliA promotore attività connesse, migliorata resistenza agli antibiotici e inibisce la divisione cellulare a 30 gradi C. A differenza dell'indolo e SdiA, l'aggiunta di (S) - 4,5 - diidrossi-2,3-pentanedione (il precursore di IA-2) conduce alla più ampio espressione genica differenziale a 37 gradi C (63 geni) rispetto a 30 gradi C (11 geni), e, invece di reprimere i geni di sintesi UMP, IA-2 li induce a 37 gradi C (ma non a 30 gradi C). Inoltre, l'aggiunta di IA-2 induce la trascrizione dei geni di virulenza in enteroemorragica e. coli O157: H7 a 37 gradi C, ma non a 30 gradi C. quindi, segnali cellulari causano diverse risposte a diverse temperature e indolo - e AI-2-base di segnalazione si intrecciano.
La Noradrenalina Ormone Neuroendocrino Aumenta La Virulenza Di Pseudomonas Aeruginosa PA14 Attraverso Il Las Pathway Quorum Sensing
È stato proposto che l'ambiente gastrointestinale contenenti alti livelli di ormoni neuroendocrini è importante gut-derivati infezioni di Pseudomonas aeruginosa. In questo studio, si segnala che la noradrenalina ormone aumenta la crescita di p. aeruginosa PA14, produzione di fattore di virulenza, invasione delle cellule epiteliali HCT-8 e la motilità del nuoto in modo concentrazione-dipendente. Transcriptome analisi di p. aeruginosa esposto a noradrenalina microM, ma non 50 microM, 500 per 7 h ha dimostrato che i geni coinvolti nella regolazione della piocianina determinanti di virulenza, elastasi e il segnale di chinolonici Pseudomonas (PQS, 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone) erano sovraregolati. La produzione di rhamnolipids, che sono anche importanti nelle infezioni da p. aeruginosa, era non significativamente alterata nelle culture di sospensione dopo l'esposizione a 500 microM noradrenalina ma diminuita su superfici semisolidi. Sciamare motilità, un fenotipo che è direttamente influenzato dalla rhamnolipids, era diminuito anche all'esposizione di noradrenalina microM 500. Aumentare l'attivazione trascrizionale di ieri, ma non quella di rhlR e l'aumento dei livelli di PQS suggeriscono che gli effetti della noradrenalina sono mediati principalmente attraverso il las pathway quorum sensing. Insieme, i nostri dati suggeriscono fortemente che noradrenalina può giocare un ruolo importante nelle infezioni gut-derivati aumentando la patogenicità di p. aeruginosa PA14.
Co-culture Di Cellule Epiteliali E Batteri Per Indagare Le Interazioni Ospite-patogeno
Umano tratto gastrointestinale (GI) è un ambiente unico in cui coesistono cellule epiteliali intestinali e batteri non patogeni (commensali). Questo equilibrio è perturbato dall'ingresso di agenti patogeni nel tratto GI. Un passaggio chiave nel processo di infezione è la navigazione dell'agente patogeno attraverso lo strato di batterico commensale per fissare alle cellule epiteliali. È stato proposto che il microambiente che l'agente patogeno incontra nello strato commensale svolge un ruolo significativo nel determinare l'estensione della colonizzazione e attaccamento. Attuali metodi di coltura per indagare la colonizzazione di agenti patogeni non sono adatti per indagare questa ipotesi in quanto non consentono co-culture di batteri e cellule epiteliali in un modo che imita il microambiente del tratto GI. Riportiamo qui lo sviluppo di un modello di microfluidica co-culture che consente la coltura indipendente delle cellule eucariotiche e batteri e prova l'effetto del microambiente commensale sulla colonizzazione di agenti patogeni. Isole reversibile forma che consentono lo sviluppo di biofilm batterici insieme con la cultura di un monostrato di cellule epiteliali è stato sviluppato un sistema azionato pneumaticamente. Il modello co-culture usato per sviluppare un commensale Escherichia coli biofilm tra cellule HeLa, seguita dall'introduzione di enteroemorragica E. coli (EHEC) nell'isola commensale, in una sequenza che imita la sequenza degli eventi di infezione del tratto GI. Utilizzando il selvaggio-tipo e. coli e un mutante tnaA (manca l'indolo segnale) come i batteri commensali, dimostriamo che il microambiente commensale biofilm è un fattore determinante di EHEC infettività e virulenza. Il nostro modello ha il potenziale per essere utilizzato negli studi fondamentali di indagare l'effetto dei segnali del tratto GI sulla virulenza EHEC pure per quanto riguarda lo screening di diversi ceppi probiotici per modulante infettività patogeno nel tratto GI.
Chemiotassi Al Quorum Sensing Segnale AI-2 Richiede La Chemoreceptor Tsr E La Periplasmica LsrB IA-2-proteina
IA-2 è un autoinducer fatto da molti batteri. LsrB si lega AI-2 nella periplasm, e Tsr è la chemoreceptor l-Serina. Mostriamo che IA-2 attira fortemente Escherichia coli. Tsr and LsrB sono necessari per il rilevamento di AI-2, ma AI-2 assorbimento è non, suggerendo che LsrB e Tsr interagire direttamente nel periplasm.
Circuito Di Quorum Sensing Sintetico Per Controllare La Formazione Di Biofilm Consortial E Dispersione in Un Dispositivo Microfluidico
Per utilizzare i biofilm per trasformazioni chimiche in bioraffinerie che hanno bisogno di essere controllato e sostituito. In precedenza, abbiamo progettato il regolatore globale Hha e ciclico BdcA diguanylate-associazione per creare le proteine che consentono la dispersione del biofilm. Qui riportiamo un circuito di biofilm che utilizza queste due proteine dispersione insieme con un interruttore di quorum sensing basati sulla popolazione. Con questo circuito sintetico, in un dispositivo microfluidico romanzo, formano un biofilm iniziale colonizzatore, introdurre un secondo tipo di cella (dispersori) in questo biofilm esistenti, formano un biofilm dual-specie robusto e spostare le celle colonizzatore iniziale il biofilm con un segnale extracellulare dalle cellule disperser. Abbiamo inoltre rimuovere il biofilm dispersore con un interruttore chimicamente indotto, e la popolazione consortial potrebbe sintonizzarsi. Pertanto, per la prima volta, le cellule hanno state ingegnerizzate che sono in grado di spostare un biofilm esistente e quindi rimosso il comando che permette di controllare la formazione di biofilm consortial per varie applicazioni.
Un Dispositivo Microfluidico Per Gli Studi Di Biofilm Batterici Ad Alto Rendimento
Batteri sono quasi sempre trovati in nicchie ecologiche come matrix-hanno incassato, superficie-associati, multispecie comunità conosciuta come biofilm. Esso è ben consolidata che segnali chimici solubili prodotte dai batteri influenzano l'organizzazione e la struttura del biofilm; quindi, c'è un interesse significativo nella comprensione chimico come i diversi segnali di coordinately sono utilizzati per lo sviluppo della Comunità. I metodi convenzionali per indagare la formazione di biofilm come le cellule di flusso su scala macro sono basso-throughput, richiedono grandi volumi e non consentono un controllo spaziale e temporale della formazione di biofilm comunità. Qui, descriviamo lo sviluppo di un dispositivo di cella (μFC) del flusso PDMS-based microfluidic due strati per indagare la formazione di biofilm batterici e organizzazione in risposta a diverse concentrazioni di segnali solubili. Il dispositivo μFC contiene otto microchambers separati per coltivare biofilm esposti a otto differenti concentrazioni di segnali attraverso un generatore singolo gradiente di concentrazione dei base di miscelazione diffusiva. La presenza di valvole pneumatiche e una cella separata semina porta che è indipendente dalla pendenza di miscelazione canali offre il completo isolamento del microchamber biofilm dal gradiente mixer e svolge anche bene in continue, batch o semi-batch condizioni. Noi dimostrare l'utilità del μFC di studiare l'effetto di diverse concentrazioni di segnali indolo-come biofilm (7-hydroxyindole e isatin), singolarmente o in combinazione, per lo sviluppo di biofilm di e. coli patogeni. Questo modello può essere utilizzato per lo sviluppo di una comprensione fondamentale degli eventi che portano all'attacco batterico sulle superfici che sono importanti per le infezioni e le sostanze chimiche che influenzano la formazione di biofilm o inibizione.
