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Articles by Margaret E. Ackerman in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Déterminer l'activité phagocytaire des échantillons d'anticorps cliniques
1Massachusetts General Hospital, Ragon Institute of MGH, MIT, and Harvard, 2Thayer School of Engineering, Dartmouth College
Nous présentons une analyse des flux à haut débit par cytométrie de déterminer l'activité phagocytaire de l'antigène-anticorps spécifiques à partir d'échantillons cliniques, en utilisant fluorescentes recouvertes d'antigène perles et une lignée cellulaire monocytaire exprimer plusieurs récepteurs Fc-récepteur et d'utilisation fournissant des déterminations de l'activité phagocytaire dans un standardisés et façon reproductible pour tout antigène d'intérêt.
Other articles by Margaret E. Ackerman on PubMed
A33 Antigène De Surface Affiche Expression Persistante
L'antigène A33 est une glycoprotéine de surface cellulaire de l'intestin grêle et épithélium du côlon avec une homologie à la jonction serrés associés à des protéines de la superfamille des immunoglobulines, y compris la RCA et le JAM. Sa localisation tissulaire restreinte et un haut niveau d'expression ont conduit à son utilisation comme cible dans l'immunothérapie du cancer du côlon. Bien que l'antigène est également présent dans l'intestin normale, d'anticorps radiomarqués contre A33 sont sélectivement retenu par des tumeurs dans l'intestin ainsi que dans les métastases aussi longtemps que 6 semaines. En conséquence, nous avons étudié les propriétés de trafic et cinétique de l'antigène pour déterminer sa promesse en deux étapes, les thérapies pretargeted. La localisation, la mobilité, et la persistance de l'antigène ont été étudiés, et ce travail a démontré que l'antigène est à la fois immobile et très très persistant en conservant sa localisation à la surface pour un chiffre d'affaires de demi-vie supérieure à 2 jours. Afin d'expliquer ces propriétés inhabituelles, nous avons exploré la possibilité que A33 est une composante de la jonction serrée. La propriété simple de la persistance de surface, décrite ici, peut contribuer à la rétention prolongée des anticorps administrés en clinique, et leur capacité rare de pénétrer les tumeurs solides.
Effet Du Taux De Rotation Et Le Niveau D'expression Antigène Sur La Pénétration D'anticorps En Sphéroïdes Tumoraux
La pénétration tissulaire pauvres est un obstacle important au développement de médicaments anticorps efficaces pour l'immunothérapie des tumeurs solides, et des altérations diverses aux propriétés des médicaments anticorps ont été faits pour améliorer la pénétration et l'homogénéité de l'exposition. Cependant, en plus des propriétés du médicament anticorps, des modèles mathématiques de transport d'anticorps prédisent que le niveau d'expression d'antigène et le taux de roulement influencer de manière significative la pénétration. Comme les propriétés intrinsèques d'antigènes sont susceptibles d'être difficile à modifier, ils peuvent fixer des limites inhérentes à la pénétration. En conséquence, dans cette étude, nous évaluons leur contribution en évaluant la distance à laquelle anticorps pénètrent sphéroïdes lorsque ces propriétés antigéniques sont systématiquement modifiés. En outre, les profils de pénétration des anticorps dirigés contre l'antigène carcinoembryonnaire et A33, deux cibles d'intérêt clinique, sont comparés. Les résultats sont en bon accord avec les prédictions quantitatives du modèle et de montrer que la localisation d'anticorps dans les régions distales des tumeurs est le mieux réalisé en sélectionnant des cibles lentement intériorisées qui ne sont pas exprimées au-dessus du niveau nécessaire pour le recrutement d'une dose toxique de thérapeutique. Chaque molécule d'antigène lié à l'anticorps qui est remis ou présenter en excès encourt un coût réel en termes de pénétration en profondeur un facteur limitant dans le développement de thérapies efficaces pour traiter les tumeurs solides.
Un Modulaire IgG-scFv Bispécifique Anticorps Topologie
Ici présenter un anticorps bispécifique (BSAB) format dans lequel un scFv disulfure-stabilisé est fusionné à l'extrémité C-terminale de la chaîne légère d'une IgG de créer un anticorps IgG-scFv bifonctionnel. Lorsqu'elle est exprimée dans les cellules de mammifères et purifié par une étape de la protéine A chromatographie, la BSAB conserve affinités parentales de chaque domaine de liaison, des expositions IgG-comme la stabilité et démontre in vivo IgG-like ciblage de la tumeur et d'épuration du sang. L'extension de l'extrémité C-terminale de la chaîne légère d'une IgG avec un scFv ou même un petit peptide ne semblent perturber la formation de pont disulfure entre les chaînes légères et lourdes, mais cela ne semble pas affecter la liaison, la stabilité ou in vivo propriétés de l'IgG. Ainsi, nous démontrons ici que la chaîne légère d'un IgG peut être étendu avec un scFv sans affecter la fonction IgG et la stabilité. Ce format sert de plate-forme normalisée pour la construction de BsAb fonctionnels.
De Stabilité Et De Biais De Composition Du CDR Enrichir Paysages Fonctionnalités Binder
La protéine sauvage séquence fonction du paysage complique les efforts, tant dans la nature et en laboratoire, pour évoluer la fonction des protéines. La diversification bibliothèque de protéines doit trouver un équilibre entre panachure suffisante pour bien déguster une fonctionnalité alternative contre la probabilité de déstabilisation mutant dessous d'un seuil exprimable. Dans ce travail, nous explorons le paysage séquence fonction dans le cadre du dépistage pour la reconnaissance moléculaire à partir d'une bibliothèque Ig échafaud. La fibronectine de type III de domaine est utilisé pour explorer l'impact de deux stratégies de diversification de séquence: (a) partielle de type sauvage de conservation à des positions structurellement importants au sein de la région paratope et (b) la composition en acides aminés imitant mesure de liaison d'anticorps place la composition au paratope putative positions. Positions structurellement importants au sein de la région ont été identifiés paratope grâce à la stabilité, de structure, et des analyses phylogénétiques et partiellement ou totalement conservée dans la séquence. Pour atteindre adaptée anticorps comme la diversité, nous avons conçu un ensemble de mélanges asymétriques nucléotidiques produisant environ codons correspondant à la répartition observée dans d'anticorps déterminant la complémentarité des régions sans assumer la dépense de triphosphoramidite basée sur la construction. Ces éléments de design ont été explorés par l'intermédiaire de comparaison de trois modèles de la bibliothèque: une bibliothèque aléatoire, une bibliothèque de type sauvage biais dans la boucle DE seule et de la tyrosine-sérine diversité ailleurs, et une bibliothèque de type sauvage biais à 11 positions et l'anticorps- inspirée de distribution d'acides aminés. Utilisation des bibliothèques regroupées pour concurrence directe dans un seul tube, la sélection et la maturation des liants à sept objectifs a abouti à 19 sur 21 clones qui proviennent de l'structurellement biaisé, conception de la bibliothèque adaptée la diversité. L'analyse des séquences des clones sélectionnés soutient l'importance de la diversité à la fois de la composition sur mesure et une distorsion structurelle. En outre, la sélection des fois bien et mal exprimé clones à partir de deux bibliothèques de plus amples explications de l'impact de partialité structurelle.
Un Robuste, à Haut Débit Essai Pour Déterminer L'activité Phagocytaire Des échantillons D'anticorps Cliniques
La phagocytose peut être induite par l'engagement des récepteurs Fcy par l'anticorps-opsonisé matériel. En outre, l'efficacité de l'anticorps induits par des fonctions effectrices a été démontré d'être dramatiquement modulée par des changements dans la glycosylation des anticorps. Parce que l'infection peut moduler glycanes d'anticorps, ce qui à son tour modulent des fonctions d'anticorps, des dosages permettant de déterminer l'induction des fonctions effectrices plutôt que la neutralisation ou titre de fournir une occasion précieuse de mieux caractériser la qualité de la réponse immunitaire adaptative. Nous décrivons ici un dosage en flux robuste et à haut débit par cytométrie de définir l'activité phagocytaire de l'antigène-anticorps spécifiques à partir d'échantillons cliniques. Ce test utilise une lignée cellulaire monocytaire, qui exprime de nombreux récepteurs Fc: y compris inhibiteur et d'activation, et des récepteurs de haute affinité et faible - qui permet phénotypes complexes pour être étudiés. Nous démontrer l'adaptabilité de ce haut-débit, basé sur les flux de dosage pour mesurer l'antigène spécifique médiée par les anticorps phagocytose contre un réseau de virus, y compris la grippe, le VIH, et la dengue. Le format de dosage phagocytose permet en outre de l'analyse simultanée de la libération de cytokines, ainsi que la détermination du rôle des récepteurs spécifiques Fcy-sous-types, ce qui en fait un système très utile pour les différences d'analyse de la capacité des cliniques et le vaccin échantillons d'anticorps induits par le recrutement de cette critique fonction effectrice.
Génétiquement Modifiés Alginate Lyase-PEG Conjugués Pièce Améliorée Fonction Catalytique Et Réduit Immunoréactivité
Enzymes lyase d'alginate représentent éventuels agents biothérapeutiques pour traiter les infections bactériennes, en particulier dans les voies aériennes fibrose kystique. Pour bien deimmunize un candidat thérapeutique tout en maintenant le niveau de compétence élevé catalytique, un combiné génie génétique-PEGylation stratégie a été mise en œuvre. Conçu de façon rationnelle, les variantes propres à chaque site PEGylation ont été construits par la chimie couplage orthogonal maléimide-thiol. À la différence de pégylation aléatoire de l'enzyme par la chimie médiée NHS-ester, contrôlée mono-PEGylation de A1-III alginate lyase produite un conjugué qui maintient des niveaux de type sauvage de l'activité sur un substrat modèle. De manière significative, la variante pégylé exposé améliorées cinétique en phase de solution avec de l'alginate bactérienne, la cible thérapeutique ultime. L'immunoréactivité de l'enzyme pégylée a été comparé à un contrôle de type sauvage en utilisant des études de liaison in vitro avec les deux anticorps spécifiques d'enzymes, de vaccinés lapins blancs de Nouvelle-Zélande, et une bibliothèque d'anticorps à chaîne unique, provenant d'un volontaire de l'homme. Dans les deux cas, l'enzyme pégylée a été jugé nettement moins immunoréactive. Soulignant le potentiel de l'enzyme de l'utilité pratique,> 90% des adhérents, mucoïdes, les biofilms de Pseudomonas aeruginosa ont été retirés de surfaces abiotiques la suite d'un traitement d'une heure avec la variante pégylé, alors que l'enzyme de type sauvage enlevé seulement 75% de biofilms dans des études parallèles. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que le site spécifique mono-pégylation de alginate lyase génétiquement A1-III a abouti à une enzyme avec des performances améliorées par rapport à thérapeutiquement paramètres pertinents.
Fusion Catalysée Protéine-protéine Par Sortase Une
Protéines chimériques vanter l'utilisation généralisée dans des domaines allant de la biologie cellulaire à la livraison de drogue. La protéine de fusion post-traductionnelle en utilisant le sortase transpeptidase bactérienne A fournit une alternative intéressante lorsque la fusion du gène traditionnelle échoue. Nous décrivons l'utilisation de cette enzyme dans la ligature in vitro des protéines et de signaler la fusion réussie de 10 paires de domaines protéiques conservés avec des fonctionnalités - à démontrer la nature robuste et facile de cette réaction.
Diminution De L'expression Des Récepteurs Fc Sur Les Cellules Immunitaires Innées Avec Facultés Affaiblies Est Associée à Des Anticorps Médiée Par L'activité Phagocytaire Cellulaire Dans Chroniquement VIH-1 Les Personnes Infectées
En plus de la neutralisation, d'anticorps médiation autres activités antivirale comprenant phagocytose dépendante des anticorps cellulaire (ADCP), un anticorps cytotoxicité cellulaire dépendante (ADCC), ainsi que le dépôt du complément. Alors qu'il est établi que l'infection à VIH est progressive associée à une diminution ADCC et l'ADCP, le mécanisme sous-jacent de cette perte de la fonction est inconnue. Nous rapportons ici des changements considérables dans l'expression FcR au cours de l'infection à VIH sur les deux MDC et les monocytes, y compris FcyRI expression élevée dans l'infection à VIH aiguë et une expression réduite de FcγRII et FcyRIIIA en infection chronique au VIH. En outre, le blocage sélectif des FcγRII seule a été associé à une perte d'activité ADCP, ce qui suggère que FcγRII joue un rôle central dans la modulation de l'ADCP. Dans l'ensemble, l'infection à VIH est associée à un certain nombre de changements dans l'expression FcR sur les cellules phagocytaires qui sont associés à des changements dans leur capacité à répondre aux anticorps opsonisées objectifs, susceptibles de contribuer à un échec de la clairance virale chez progressive infection VIH-1.
Exploiter Bias Dans Une Bibliothèque Non-immune Anticorps Humain Pour Prédire Antigénicité
Non-immunes humaines bibliothèques de fragments d'anticorps ont généré liaison à l'antigène des protéines utiles que la recherche prospective, de l'imagerie, agents diagnostiques et thérapeutiques. Cependant, parce que la génération de ces bibliothèques s'appuie sur des séquences d'anticorps clonage du répertoire immuns circulants plutôt que vraiment naïfs, les séquences des lignées germinales, leur composition peuvent refléter la suppression de séquences autoréactifs, ce qui les rend moins aptes pour isoler des clones de liaison aux antigènes de l'homme, mais peut-être utile dans les applications où une poignée de vitro sur la diversité des anticorps circulants représentant est souhaitée. Nous démontrons ici que d'un grand non-immune bibliothèque humaine scFv est relativement pauvre des séquences capables de reconnaître des antigènes humains par rapport à des antigènes orthologues. En outre, parce que ce non-naïve, non-immune bibliothèque peut capturer une section représentative de la diversité des anticorps, nous explorons son utilité possible dans la conduite de début pré-écrans pour prédire l'antigénicité de la thérapeutique potentiels et de trouver une corrélation entre l'immunogénicité clinique d'une petite panel de protéines thérapeutiques avec leur propension à interagir avec la bibliothèque.
Concepts émergents Sur Le Rôle De L'immunité Innée Dans La Prévention Et Le Contrôle De L'infection à VIH
Bien que les anticorps neutralisants peuvent fournir stérilisation protection contre l'infection du VIH par l'intermédiaire de leurs domaines variables, le domaine constant d'anticorps fournit un lien fonctionnel entre l'immunité innée et adaptative et offre un moyen d'exploiter les puissantes propriétés antivirales d'un large éventail de l'immunité innée des cellules effectrices. Il ya eu une prise de conscience croissante du rôle de ces mécanismes effecteurs à travers champs de l'immunothérapie du cancer à l'auto-immunité et des maladies infectieuses, ainsi que la spéculation que ce mécanisme pourrait être responsable de la protection observée dans l'essai RV144 vaccin contre le VIH. Cette revue résume ces activités extraneutralizing humorales immunitaires, les progrès dans la définition de l'importance de ces mécanismes effecteurs lors de la progression de l'infection à VIH, et l'impact potentiel que ces vaccins-réponses immunitaires induites par peut avoir sur la protection contre l'infection.
