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Articles by Margaret E. Ackerman in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Determinazione dell'attività fagocitaria dei Campioni anticorpi clinici
1Massachusetts General Hospital, Ragon Institute of MGH, MIT, and Harvard, 2Thayer School of Engineering, Dartmouth College
Vi presentiamo un elevato throughput saggio citometria a flusso per determinare l'attività fagocitaria dei antigene-anticorpi specifici da campioni clinici, utilizzando l'antigene fluorescenti rivestite perline e una linea cellulare monocitica esprimono più recettori Fc, fornendo utilizzo del recettore e determinazioni attività fagocitaria in una forma standardizzata e moda riproducibile per qualsiasi antigene di interesse.
Other articles by Margaret E. Ackerman on PubMed
A33 Antigene Visualizza Persistente Espressione Superficiale
L'antigene A33 è una glicoproteina di superficie delle cellule del piccolo intestino e del colon epitelio con omologia delle proteine associate all'incrocio stretto della superfamiglia delle immunoglobuline, tra cui auto e Jam Sua localizzazione tessuto limitato e l'alto livello di espressione hanno portato al suo uso come destinazione in immunoterapia del cancro del colon. Anche se l'antigene è presente anche nella normale intestino, radioattivi anticorpi contro A33 vengono mantenuti selettivamente da tumori nell'intestino così come nelle lesioni metastatiche per la durata di 6 settimane. Di conseguenza, abbiamo studiato le proprietà traffico e cinetiche dell'antigene per determinare la sua promessa in due fasi, terapie pretargeted. La localizzazione, la mobilità e la persistenza dell'antigene sono stati studiati, e questo lavoro ha dimostrato che l'antigene è altamente immobile ed estremamente persistente, mantenendo la superficie localizzazione per halflife un fatturato superiore a 2 giorni. Al fine di spiegare queste proprietà insolite, abbiamo esplorato la possibilità che la A33 è una componente della giunzione stretta. La semplice proprietà di persistenza superficiale, qui descritto, può contribuire per la conservazione prolungata di anticorpi clinicamente amministrati e la loro capacità rara di penetrare i tumori solidi.
Effetto Del Livello Di Espressione E Tasso Di Fatturato Dell'antigene Sulla Penetrazione Dell'anticorpo in Sferoidi Di Tumore
Tessuto scarsa penetrazione è un ostacolo significativo per lo sviluppo di farmaci di successo dell'anticorpo per l'immunoterapia dei tumori solidi, e sono state apportate diverse modifiche alle proprietà dei farmaci dell'anticorpo per migliorare la penetrazione e l'omogeneità di esposizione. Tuttavia, oltre alle proprietà del farmaco anticorpo, modelli matematici di trasporto anticorpo predicono che il livello di espressione dell'antigene e fatturato tasso significativamente influenzare la penetrazione. Come proprietà intrinseca dell'antigene sono suscettibili di essere difficile da modificare, si possono impostare limiti inerenti alla penetrazione. Di conseguenza, in questo studio, valutiamo il loro contributo valutando la distanza a cui gli anticorpi penetrano sferoidi quando queste proprietà antigene sistematicamente sono molteplici. Inoltre, i profili di penetrazione degli anticorpi contro l'antigene carcino-embrionario e A33, due destinazioni di interesse clinico, vengono confrontati. I risultati concordano bene con le previsioni quantitative del modello e visualizza che localizzazione anticorpo nelle regioni distali dei tumori è meglio raggiunto selezionando lentamente interiorizzati obiettivi che non sono espressi di sopra del livello necessario per l'assunzione di una dose tossica di terapeutica. Ogni molecola legata all'anticorpo antigene che è capovolta o presenti in eccesso comporta un costo in termini di penetrazione profondità, un fattore limitante nello sviluppo di terapie efficaci per il trattamento dei tumori solidi di reale.
Una Topologia Di Anticorpi Bispecific IgG-scFv Modulare
Presentiamo qui un formato (bsAb) Anticorpo bispecific in cui si fonde un scFv disolfuro-stabilizzato al C-terminale della catena leggera di un IgG per creare un anticorpo di IgG-scFv bifunzionale. Quando espresso in cellule di mammifero e purificata dalla proteina in un solo passaggio una cromatografia, la bsAb mantiene affinità parentale di ogni dominio di legame, IgG-come stabilità e vengono illustrati liquidazione targeting e sangue in vivo-IgG-come tumore. L'estensione del C-terminale della catena leggera di una IgG con un scFv o addirittura un piccolo peptide sembrano ostacolare la formazione di legami disolfuro tra le catene leggere e pesanti; Tuttavia, questo non sembra influire sulla proprietà in vivo delle IgG, stabilità o associazione. Così, noi dimostrare qui che la catena leggera di un IgG può essere esteso con un scFv senza compromettere la stabilità e la funzione di IgG. Questo formato serve come piattaforma standard per la costruzione di bsAbs funzionale.
Stabilità E CDR Composizione Biases Arricchire Paesaggi Funzionalità Binder
Il paesaggio di funzione di sequenza proteica robusto complica gli sforzi, sia in natura che in laboratorio, di evolvere la funzione della proteina. Diversificazione libreria proteine dovrà trovare un equilibrio tra sufficiente variegatura alla funzionalità alternativa accuratamente campione contro la probabilità di destabilizzazione mutante di sotto di una soglia esprimibile. In questo lavoro, esploriamo il paesaggio di sequenza-funzione nel contesto dello screening per il riconoscimento molecolare da una libreria di impalcatura di Ig. Il dominio della fibronectina tipo III è utilizzato per esplorare l'impatto delle strategie di diversificazione sequenza due: (a) parziale conservazione del selvaggio-tipo a strutturalmente importanti posizioni all'interno della regione di paratope e (b) su misura composizione aminoacidica imitando la composizione sito di legame dell'anticorpo alla paratope presunte posizioni. Strutturalmente importanti posizioni all'interno della regione di paratope sono stati identificati attraverso analisi filogenetica e strutturali di stabilità e parzialmente o completamente conservate in sequenza. Per realizzare su misura anticorpo-come diversità, abbiamo progettato una serie di miscele di nucleotide inclinate producendo codoni corrispondenti circa la distribuzione osservata nelle regioni di complementarità-determinazione dell'anticorpo senza incorrere in spese di costruzione a base di triphosphoramidite. Questi elementi di design sono stati esplorati tramite comparazione di tre disegni di libreria: una libreria casuale, una biblioteca con selvaggio-tipo bias in DE loop solo e diversità di tirosina-serina altrove e una libreria con selvaggio-tipo bias a 11 posizioni e la distribuzione dell'amminoacido anticorpo-ispirato. Utilizzando le librerie nel pool per concorrenza diretta in un unico tubo, selezione e maturazione dei leganti a sette obiettivi ceduto 19 di 21 cloni che ha provenuto dal design libreria strutturalmente prevenuto, diversità su misura. Analisi di sequenza dei cloni selezionati sostiene l'importanza di diversità compositiva su misura e di distorsione strutturale. Inoltre, selezione dei cloni di bene e male espressi da due librerie chiarito ulteriormente l'effetto di distorsione strutturale.
Un Robusto, High-throughput Test Per Determinare L'attività Fagocitaria Dei Campioni Clinici Dell'anticorpo
Fagocitosi possono essere indotta tramite il coinvolgimento dei recettori fcy da anticorpo-opsonized materiale. Inoltre, l'efficienza delle funzioni effettrici anticorpo-indotta ha dimostrato di essere drammaticamente modulata dai cambiamenti nella glicosilazione dell'anticorpo. Poiché l'infezione può modulare anticorpo glicani, che a loro volta modulano le funzioni dell'anticorpo, dosaggi in grado di determinare l'induzione delle funzioni effettrici anziché neutralizzazione o titolo forniscono una preziosa occasione per caratterizzare più pienamente la qualità della risposta immunitaria adattativa. Qui descriviamo un dosaggio cytometric di flusso robusto e ad alta velocità per definire l'attività fagocitaria di anticorpi specifici per l'antigene da campioni clinici. Questo test si avvale di una linea cellulare monocitica che esprime numerosi recettori Fc: tra cui recettori inibitorio e attivazione e ad alta e bassa affinità - permettendo fenotipi complessi essere studiato. Noi di dimostrare l'adattabilità di questo dosaggio ad alta velocità, basata sul flusso per misurare la fagocitosi mediata da anticorpi antigene-specifiche contro la matrice di virus, influenza, HIV e dengue. Il formato assay fagocitosi ulteriormente permette analisi simultanea di rilascio di citochine, come pure la determinazione del ruolo di specifici sottotipi di recettori fcy, rendendolo un sistema molto utile per l'analisi di differenze nella capacità di clinico e vaccino indotto campioni anticorpo per reclutare questa funzione effector critico.
Alginato Geneticamente Ingegnerizzati Liasi-PEG Coniugati Exhibit Enhanced Funzione Catalitica E Ridotta Immunoreattività
Enzimi liasi alginato rappresentano potenziali agenti bioterapeutici per trattare le infezioni batteriche, soprattutto nelle vie aeree la fibrosi cistica. Per deimmunize in modo efficace un candidato terapeutico mantenendo alto livello proficiency catalitico, è stata implementata una strategia combinata di ingegneria genetica-PEGylation. Razionalmente progettati, site-specific PEGylation varianti furono costruiti dalla chimica giunto ortogonale con-tiolo. In contrasto con casuale PEGylation dell'enzima di NHS-estere mediata chimica, mono-PEGylation controllata della liasi di alginato A1-III prodotto un coniugato che mantenuto selvaggio tipo livelli di attività verso un substrato di modello. Significativamente, la variante peghilato esposta soluzione avanzata fase cinetica con alginato batterica, l'ultimo obiettivo terapeutico. L'immunoreattività dell'enzima pegilato è stato paragonato a un controllo di tipo selvatico mediante studi di binding in vitro con enzimi specifici anticorpi, da conigli Nuova Zelanda Bianca immunizzati e una libreria di anticorpo catena singola, derivata da un essere umano volontario. In entrambi i casi, l'enzima pegilato è stato trovato per essere sostanzialmente meno immunoreattivi. Potenziale per utilità pratica, sottolineando l'enzima del > 90% degli aderenti, mucoide, Pseudomonas aeruginosa biofilms sono stati rimossi dalle superfici abiotiche seguendo un trattamento di un'ora con la variante pegilato, considerando che l'enzima wild type rimosso solo il 75% di biofilm in studi paralleli. Nel complesso, questi risultati dimostrano che mono-PEGylation site-specific di geneticamente ingegnerizzati A1-III liasi alginato ha reso un enzima con prestazioni migliorate rispetto alla metrica terapeuticamente rilevanti.
Fusione Della Proteina-proteina, Catalizzata Da Sortase A
Le proteine chimeric vantano uso diffuso in aree che vanno dalla biologia cellulare alla consegna della droga. Fusione di alberino-di traduzione della proteina utilizzando il batterica transpeptidasi sortase A fornisce che una fusione del gene attraente alternativa quando tradizionale non riesce. Ci descrivono l'uso di questo enzima per la legatura di proteine in vitro e segnalare la riuscita fusione di 10 coppie di domini della proteina con conservata funzionalità - dimostrando la natura robusta e facile di questa reazione.
Diminuzione Dell'espressione Dei Recettori Fc Sulle Cellule Del Sistema Immunitario Innate è Associato Con Compromissione Anticorpo-mediata Fagocitaria Attività Cellulare in Cronicamente Infettata Di HIV-1 Individui
Oltre alla neutralizzazione, anticorpi mediano altre attività antivirali, tra cui la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente (ADCP), citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC), così come completano di deposizione. Mentre si è stabilito che l'infezione da HIV progressiva è associato con ridotto ADCC e ADCP, il meccanismo sottostante per questa perdita di funzione è sconosciuto. Qui riportiamo notevoli cambiamenti nell'espressione FcR nel corso dell'infezione da HIV su entrambi MDC e monociti, tra cui elevata espressione FcγRI nell'infezione di HIV acuta e ridotta espressione di FcγRII e FcγRIIIa nell'infezione cronica da HIV. Inoltre, blocco selettivo di FcγRII da solo è stato associato con una perdita di attività ADCP, suggerendo che FcγRII svolge un ruolo centrale nella modulazione ADCP. Nel complesso, l'infezione da HIV è associato con un certo numero di cambiamenti nell'espressione FcR su cellule fagocitiche che sono associati con i cambiamenti nella loro capacità di rispondere agli obiettivi dell'anticorpo-opsonized, potenzialmente contribuire a un fallimento nella clearance virale nell'infezione da HIV-1 progressivo.
Sfruttando Il Bias in Una Libreria Non Immune Anticorpo Umano a Predire Antigenicità
Librerie di frammento di anticorpo umano non-immune hanno generato antigen-binding proteins utile come ricerca prospettico, imaging, agenti diagnostici e terapeutici. Tuttavia, poiché la generazione di tali librerie si basa sulla clonazione dell'anticorpo sequenze da repertorio immune circolo piuttosto che veramente ingenuo, sequenze di germline, loro composizione possono riflettere l'eliminazione delle sequenze autoreattivi, rendendoli meno adatto per l'isolamento di cloni di associazione agli antigeni umani, ma forse utili nelle applicazioni dove un handle in vitro su rappresentante circolanti diversità anticorpale è desiderato. Qui dimostriamo che una libreria di grandi dimensioni scFv umana non immune è relativamente impoverita di sequenze in grado di riconoscere antigeni umani rispetto agli antigeni di orthologs. Inoltre, perché questa non-naïve, biblioteca non immune può catturare una sezione rappresentativa della diversità anticorpale, esploriamo la sua possibile utilità nel condurre Alimentadores presto per prevedere l'antigenicità di potenziali terapie e trovare una correlazione tra la clinica immunogenicità di un piccolo pannello di terapie di proteine con la loro propensione per l'interazione con la libreria.
Concetti Emergenti Sul Ruolo Dell'immunità Innata Nella Prevenzione E Controllo Dell'infezione Da HIV
Mentre neutralizzando gli anticorpi può fornire sterilizzante protezione dall'infezione da HIV tramite loro domini variabili, il dominio costante dell'anticorpo fornisce un collegamento funzionale tra l'immunità innata e adattiva e offre un mezzo per sfruttare le potenti proprietà antivirali di un ampio spettro di cellule effettrici immunitarie innate. C'è stato un crescente apprezzamento del ruolo di questi meccanismi effettori attraverso campi da immunoterapia cancro per autoimmunità e malattie infettive, come pure speculazioni che questo meccanismo può essere responsabile per la protezione osservata nel vaccino RV144 HIV prova. Questa recensione riassume questi extraneutralizing attività immunitaria umorale, progressi nel definire l'importanza di questi meccanismi effettori durante la progressione nell'infezione da HIV e il potenziale impatto che tali risposte immunitarie indotta da vaccino può avere sulla protezione dall'infezione.
