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Articles by Margaret E. Ackerman in JoVE
JoVE Immunology and Infection
臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する
1Massachusetts General Hospital, Ragon Institute of MGH, MIT, and Harvard, 2Thayer School of Engineering, Dartmouth College
我々は、蛍光抗原をコーティングしたビーズと標準化で複数のFc受容体は、提供する受容体の使用量と貪食能の測定を表す単球細胞株を利用し、臨床検体から抗原特異的抗体の食作用活性を決定するためにハイスループットフローサイトメトリーアッセイを提示し、興味のある任意の抗原のための再現可能なファッション。
Other articles by Margaret E. Ackerman on PubMed
A33抗原は、永続的な表面表現を表示します。
A33抗原は、CARとJAMを含む免疫グロブリンスーパーファミリーのタイトジャンクション関連タンパク質に対する相同性を有する小腸と大腸上皮の細胞表面糖タンパク質である。その制限された組織の局在化と高レベルの発現は大腸癌の免疫療法のターゲットとしての使用につながっている。抗原は通常の腸内にも存在するが、A33に対する放射性標識抗体が選択的に限り、6週間などのために腸内と同様に転移巣の腫瘍によって保持されます。したがって、我々は、2つのステップ、pretargeted治療の約束を決定するために人身売買や抗原の運動特性を検討してきた。ローカライズ、モビリティ、および抗原の持続性について検討したが、この作品は、抗原が非常に動かないと非常に以上の2日間の売上高の半減期のためにその表面局在化を永続的維持の両方であることが実証されています。これらの異常な特性を説明するために、我々はA33は、タイトジャンクションの構成要素である可能性を探った。表面の永続性の単純なプロパティは、ここで説明し、臨床的に投与された抗体の長期保持、および固形腫瘍を貫通するそれらのまれな能力に貢献するかもしれない。
腫瘍スフェロイドへの抗体の侵入に対する抗原の離職率と発現レベルの効果
悪い組織への浸透は、固形腫瘍の免疫療法のための成功した抗体医薬の発展に多大な障害と、浸透や露出の均一性を向上させるために行われている抗体医薬品の特性に多様な変化である。しかし、抗体医薬品の特性に加えて、抗体輸送の数学モデルは、抗原の発現レベルと離職率が著しく浸透に影響を与えると予測している。内因性抗原のプロパティは変更することが困難になる可能性があるとして、彼らは侵入に固有の制限を設定することができます。そこで、本研究では、これらの抗原特性が系統的に変化させたときの回転楕円体の抗体を貫通する距離を評価することによって、彼らの貢献を評価します。さらに、癌胎児性抗原とA33、臨床的関心の2つのターゲットに対する抗体の浸透プロファイルが比較されます。結果は、モデルの定量的予測とよく一致し、腫瘍の遠位領域に対する抗体をローカライズすることが最善の治療の毒性用量を募集するために必要なレベルを超えて表現されていません徐々に内面化のターゲットを選択することによって達成されることを示している。以上になっているか、浸透固形腫瘍を治療するための効果的な治療法の開発に深さを制限する要因の面で過剰を招きに実質的なコストを提示された各抗体結合抗原分子。
モジュラーのIgG-scFvの二重特異性抗体のトポロジ
ここでは、ジスルフィド安定化のscFvはIgG-scFvが二官能性抗体を作成するには、IgGの軽鎖のC末端に融合された二重特異性抗体（bsAb）形式を提示します。哺乳動物細胞で発現し、ワンステップでタンパク質によるクロマトグラフィー精製したときに、bsAbは、それぞれの結合ドメインの親の親和性を保持し、展示のIgGのような安定性とin vivoでのIgGのような標的腫瘍と血中クリアランスに示しています。 scFvまたはさらに小さなペプチドとIgGの軽鎖のC末端の拡張子は、軽鎖および重鎖間のジスルフィド結合の形成を混乱させるように見えませんが、これは、結合、安定性やin vivoでの影響を与えることが表示されません。 IgGのプロパティ。したがって、我々は、IgGの軽鎖がIgGの機能と安定性に影響を与えずに、scFvを使用して拡張することができますここで示しています。この形式は、機能bsAbsの建設のための標準プラットフォームとしての役割を果たします。
安定性とCDR組成バイアスはバインダー機能の風景を豊かに
頑丈なタンパク質配列関数の風景は、タンパク質の機能を進化させる自然の中で、実験室の両方の努力を、複雑になります。タンパク質ライブラリーの多様化を徹底的に表現しきい値以下の変異体不安定化の可能性に対し、代替となる機能をサンプリングするのに十分な斑入りの間でバランスを取る必要があります。本研究では、我々は、Ig足場ライブラリーから分子認識のためのスクリーニングのコンテキスト内で配列関数風景を探る。パラトープ領域内の構造的に重要な位置にある（a）の部分的な野生型保全、および（b）に合わせたアミノ酸組成は、推定パラトープで抗体結合部位の組成を模倣する：フィブロネクチンタイプIIIドメインは2つのシーケンスの多様化戦略の影響を調べるために使用されますポジション。パラトープ領域内で構造的に重要な位置は安定性、構造、系統解析を介して識別され、部分的または完全に順番に保存されていた。合わせて、抗体のような多様性を達成するために、我々は約triphosphoramiditeベース建設の費用をかけずに抗体の相補性決定領域で観察された分布に一致するコドンをもたらす歪んだヌクレオチドの混合物のセットを設計されています。これらの設計要素は3つのライブラリの設計との比較を経由して検討された11の位置に野生型バイアスDEループのみと他のチロシン - セリンは、多様性の野生型のバイアスをランダムライブラリー、ライブラリ、ライブラリと抗体アミノ酸の分布に影響を与えた。 1本のチューブ内での直接的な競争のためにプールされたライブラリを使用して、7つのターゲットへの結合剤の選択と成熟は、構造的にバイアスされ、合わせて多様性ライブラリーの設計に由来する19〜21のクローンが得られた。選択されたクローンの配列分析は、オーダーメード組成の多様性と構造的なバイアスの両方の重要性をサポートしています。さらに、2つのライブラリーから両方よくおよび悪い発現するクローンの選択は、さらに構造のバイアスの影響を明らかにした。
臨床抗体サンプルの貪食活性を決定するための堅牢でハイスループットアッセイ
貪食、抗体-オプソニン化材料によるFcγ受容体との係合を介して誘導することができる。さらに、抗体誘導性のエフェクター機能の効率は、抗体のグリコシル化の変化によって飛躍的に変調されたことが示されている。感染症は、順番に抗体の機能を調節する抗体の糖鎖を、調節することができるので、エフェクター機能の誘導を決定するのではなく、中和または力価が可能なアッセイは、より完全に適応免疫応答の品質を評価する貴重な機会を提供しています。ここでは、臨床検体から抗原特異的抗体の貪食能を定義するための堅牢でハイスループットフローサイトメトリーアッセイを説明します。複雑な表現型を検討できるようにする - 阻害と活性化、高および低親和性受容体を含む：このアッセイは、多数のFc受容体を発現単球細胞株を採用しています。我々は、インフルエンザ、HIV、デング熱などのウイルスの配列に対する抗原特異的抗体媒介性食作用を測定するには、このハイスループット、フローベースのアッセイの適応性を示しています。貪食アッセイフォーマットは、さらにそれを、この重要なを募集する臨床およびワクチン誘発抗体サンプルの能力の違いを解析するための非常に有用なシステムとなって、同時サイトカイン放出の分析と同様に、特定のFcγ受容体サブタイプの役割を決定することができエフェクター機能。
遺伝子組み換えアルギン酸リアーゼ-PEGコンジュゲートは、強化された触媒機能と免疫反応性の低減を出展
アルギン酸リアーゼの酵素は、特に嚢胞性線維症気道で、細菌感染を治療するための将来のバイオ医薬品のエージェントを表します。高レベルの触媒能力を維持しながら、効果的に治療の候補者をdeimmunizeするには、結合された遺伝子工学-PEG化戦略が実装されました。合理的に設計され、サイト固有のPEG化変異体は、直交するマレイミド - チオール結合化学により構築した。 NHS-エステル仲介化学による酵素のランダムなPEG化とは対照的に、A1-IIIアルギン酸リアーゼの制御モノPEG化は、モデルの基板に向かって活動の野生型のレベルを維持したコンジュゲートを生成する。重要なのは、PEG化変異は、細菌アルギン酸塩、究極の治療標的と強化された液相の動態を示した。 PEG化酵素の免疫反応性は、ヒトのボランティアから派生した免疫ニュージーランド白ウサギ、単鎖抗体ライブラリーから、両酵素に特異的な抗体を用いてin vitro結合実験で使用して野生型対照と比較した。両方のケースでは、PEG化酵素は、実質的に少ない免疫反応性であることが判明した。実用性のために酵素の可能性を強調し、野生型酵素は、並列研究ではバイオフィルムの75％のみを削除し、一方、接着性、粘液、緑膿菌バイオフィルムの> 90％、PEG化バリアントで1時間処理後の非生物表面から削除されました。集計では、これらの結果は、遺伝子組み換えA1-IIIのアルギン酸リアーゼの部位特異的モノPEG化は、治療に関連するメトリックに相対的なパフォーマンスが向上した酵素が得られたことを示している。
Sortase触媒を用いたタンパク質 - タンパク質融合
キメラタンパク質は、細胞生物学からの薬物送達に至るまでの分野で広く使用さを誇っています。細菌のトランスペsortaseを使用して翻訳後タンパク質融合は、従来の遺伝子融合が失敗した魅力的な代替手段を提供しています。我々はin vitroでのタンパク質のライゲーションでは、この酵素の使用を記述し、保存機能を持つ蛋白質ドメインの10組の成功の融合を報告 - この反応の堅牢性と容易な性質を実証します。
自然免疫細胞で減少したFcレセプターの発現は、慢性的にHIV-1感染個体において障害抗体媒介性細胞の貪食能に関係している
中和に加えて、抗体は、抗体依存性細胞貪食（ADCP）、抗体依存性細胞傷害（ADCC）と同様に、補体沈着を含む他の抗ウイルス活性を媒介する。それは進歩的なHIV感染が減少ADCCおよびADCPに関連付けられていることを確立されている間は、関数のこの損失の基礎となるメカニズムは不明である。ここでは、急性HIV感染症と慢性HIV感染のFcγRIIおよびFcγRIIIaをの発現量の減少で上昇FcγRIの発現を含む、樹状および単球の両方のHIV感染の過程でのFcR発現のかなりの変化を報告します。さらに、FcγRII単独での選択的遮断はFcγRIIは、変調ADCPで中心的な役割を果たしていることを示唆し、ADCPの活動の損失と関連していた。全体として、HIV感染が潜在的に進行性のHIV-1感染におけるウイルスクリアランスの障害に貢献、オプソニン抗体のターゲットに対応する能力の変化に関連付けられている貪食細胞上のFcR発現の変化の数に関連付けられています。
抗原性を予測する非免疫ヒト抗体ライブラリーにバイアスを利用すること
非免疫ヒト抗体断片のライブラリは、将来の研究、イメージング、診断および治療剤として有用な抗原結合タンパク質を生成している。しかし、このようなライブラリの生成は循環する免疫レパートリーではなく、本当にナイーブ、生殖系列配列からクローニング抗体配列に依存しているため、その組成は、ヒトの抗原に結合するクローンを単離するためにはあまり適してい、自己反応性配列の欠失を反映しているかもしれませんが、おそらく代表的な循環する抗体の多様性に関するin vitroハンドルが望まれているアプリケーションで有用です。ここでは、大規模な非免疫ヒトscFvライブラリは比較的オルソログ抗原と比較してヒト抗原を認識することができる配列の枯渇していることを示している。この非ナイーブ、非免疫ライブラリは、抗体の多様性の代表的なセクションを取り込む可能性があるため、さらに、我々は将来の治療薬の抗原性を予測するために初期のプレ画面を行う際にその可能性ユーティリティを探索し、小規模の臨床免疫原性との相関関係を見つけるライブラリと対話するための彼らの傾向を持つタンパク質治療薬のパネル。
予防とHIV感染の制御における自然免疫の役割に関する新たな概念
中和抗体は、それらの可変ドメインを介したHIV感染からの保護を殺菌提供することができますが、抗体の定常ドメインは、自然免疫と適応免疫の間の機能のリンクを提供し、自然免疫エフェクター細胞の広範囲の強力な抗ウイルス特性を活用するための手段を提供しています。癌免疫療法から自己免疫と感染症と同様に、このメカニズムはRV144のHIVワクチンの臨床試験で観察された保護の責任ではないかという憶測にフィールド全体でこれらのエフェクター機構の役割の成長の感謝がありました。このレビューは、これらextraneutralizing体液性免疫活動、HIV感染の進行中に、これらのエフェクター機構の重要性を定義する際に進行状況、およびそのようなワクチンによって誘導される免疫応答は、感染からの保護を持っているかもしれない潜在的な影響をまとめたものです。
