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Articles by Marie-Claude Potier in JoVE
JoVE General
Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)
1Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle Épinière, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, 2Institut des Sciences Moléculaires d'Orsay, Université Paris-Sud, 3Centre de Photonique Biomédicale du Centre Laser, Université Paris-Sud
Une technique pour sonder le cloisonnement radeau lipidique des protéines fluorescentes à la membrane plasmique de cellules vivantes est décrite. Il tire profit de la disparité des temps de diffusion des protéines situées à l'intérieur ou à l'extérieur des radeaux lipidiques. L'acquisition peut être effectuée de manière dynamique dans des conditions de contrôle ou après l'addition de drogues.
Other articles by Marie-Claude Potier on PubMed
L'expression Génique Globale / Temporelle Muscles Du Diaphragme Et Postérieurs De La Dystrophine-déficientes (MDX) Souris
La souris mdx est un modèle pour la dystrophie musculaire humain (DMD), une maladie dégénérative liée à l'X du tissu musculaire du squelette caractérisée par l'absence de la protéine dystrophine. Les souris mdx présentent un phénotype beaucoup plus doux que les patients atteints de DMD. Après la première semaine de vie où tous les muscles mdx évoluer comme les muscles de jeunes patients atteints de DMD, mdx muscles des membres postérieurs compenser sensiblement l'absence de dystrophine, tandis que le muscle du diaphragme mdx devient progressivement affecté par la maladie. Nous avons utilisé cDNA microarrays pour comparer le profil d'expression des gènes 1,082, préalablement sélectionnés par une méthode soustractive, le contrôle et mdx des membres postérieurs et muscles du diaphragme à 12 points dans le temps au cours de la première année de la vie de la souris. Nous avons déterminé que 1) le défaut gène de la dystrophine induit le remodelage expression marquée de 112 gènes codant pour des protéines impliquées dans diverses fonctions des cellules musculaires et 2) les deux tiers des anomalies observées transcriptomal différait entre adultes mdx des membres postérieurs et muscles du diaphragme. Nos résultats ont montré que ni le muscle diaphragme mdx, ni mdx muscles des membres postérieurs évoluer tout à fait comme les muscles de l'homme DMD. Ce résultat doit être pris en considération pour l'interprétation des futures expériences sur des souris mdx comme un modèle pour les essais thérapeutiques.
La Reproduction De 200 Ko Segmentaire Sur Le Chromosome Humain 21 Provient D'une Diffusion Péricentromérique Impliquant Les Chromosomes De L'homme 2, 18 Et 13
Des régions proches de centromères de l'homme contiennent des fragments d'ADN s'étendant centaines de kilobases qui présentent un degré élevé d'identité de séquence (> 95%). Nous rapportons ici la structure génomique et l'évolution d'une famille de quatre régions paralogues liés à un présent de 220 ko fragments génomiques sur le bras long du chromosome humain 21 (21q22.1). Classification phylogénétique des séquences paralogues obtenus à partir de l'ébauche du projet du génome humain sont en accord avec les résultats de la fluorescence comparée hybridation in situ sur les chromosomes en métaphase à partir de singes de l'homme et grande. Le présent exemplaire original en 21q22.1 chez l'homme a été dupliqué dans les grands singes après la divergence de l'orang-outan et inséré dans une région péricentromérique, probablement l'ancêtre de HSA2q, puis diffusé par la transposition d'un fragment plus grand à d'autres endroits péricentromériques: HSA18p11, HSA13q11 et HSA21q11.1. Le degré de diffusion varie selon les espèces.
Enrichissement Ou Appauvrissement D'une Catégorie GO Dans Une Classe De Gènes: Quel Test?
Un certain nombre d'ensembles de programmes disponibles déterminer les enrichissements significatifs et / ou de diminutions d'catégories vont parmi une classe de gènes d'intérêt. Alors qu'une formulation correcte du problème conduit à une distribution nulle exacte unique, ces outils vont utiliser une grande variété de tests statistiques dont les dénominations ne sont souvent pas préciser les sous-jacents P-valeur calculs.
Bas Déséquilibre Dosage Syndrome De Gènes Sur Le Développement Cervelet
Le syndrome de Down (DS) est une maladie chromosomique par lequel les gènes sur le chromosome 21 sont présents en trois exemplaires. Ce déséquilibre de copies du gène est pensé pour être responsable d'un certain nombre de conditions débilitantes vécues par les personnes trisomiques. Parmi ceux-ci est un volume réduit du cervelet, ou hypoplasie cérébelleuse, qui est censé contribuer à la perturbation de la motricité fine. Des modèles murins de DS (comme Ts65Dn, Ts1Cje, Tc1) présentent un phénotype similaire à celui du cervelet des personnes atteintes de DS et qui se manifeste principalement comme une perturbation de la densité de la couche de cellules granulaires. Dissection des gènes qui trois copie sont responsables de ce phénotype (l'effet du gène primaire de dosage) a été une tâche menée par des chercheurs travaillant avec divers trisomies segmentaires et les souris transgéniques. Il est généralement convenu que, lorsqu'il est exprimé, trois gènes de souris copie trisomiques sont exprimés à environ 1,5 fois supérieure à celle des mêmes gènes dans euploïdes (type sauvage) chez la souris. Cependant, parmi ces études, il ne semble pas y avoir un consensus sur la nature et l'étendue de l'expression différentielle des deux gènes chez la souris copie des trisomiques l'effet de dosage secondaire. Une grande partie de cette variation peut avoir à faire avec le stade de développement d'une enquête et la nature et la complexité du tissu (c.-à-ensemble du cerveau par rapport au cervelet). La découverte récente que les précurseurs des cellules granulaires trisomiques sont moins sensibles à sonic hedgehog induit la prolifération a ouvert une autre voie pour l'identification des trois gènes responsables de la copie le phénotype cérébelleux. Il est à espérer qu'une enquête plus approfondie de ce phénomène, en collaboration avec les trisomies souris transgéniques et de nouveaux segments, va révéler la cause du déficit prolifération et permettre un traitement potentiel.
Modèles Maladie D'Alzheimer Et Humaines Neuropathologie: Similitudes Et Différences
Les modèles animaux visent à reproduire les symptômes, les lésions ou la cause (s) de la maladie d'Alzheimer. De nombreuses souris des lignées transgéniques ont maintenant réussi à reproduire partiellement ses lésions: les dépôts extracellulaires de peptide Abeta et l'accumulation intracellulaire de la protéine tau. APP humain muté résultat de transgènes dans le dépôt de peptide Abeta, similaire mais non identique au peptide Abeta de la plaque sénile de l'homme. Angiopathie amyloïde est commun. Outre le dépôt de Abeta, la dystrophie axonale et l'altération des dendrites ont été observés. Toutes les mutations causent une augmentation de Abeta 42 niveaux, à l'exception de la mutation de l'Arctique, qui modifie la séquence Abeta lui-même. Surexprimant de type sauvage APP seul (comme dans les modèles murins de la trisomie 21 humaine) ne provoque pas de dépôt Abeta dans la plupart des lignes de la souris. Doublement (APP muté x PS1) des souris transgéniques développent des lésions antérieures. Les souris transgéniques dans lesquelles BACE1 a été assommées ou surexprimé ont été produites, ainsi que des lignes avec une expression altérée de néprilysine, la principale enzyme dégradant de Abeta. Les souris transgéniques APP ont soulevé de nouvelles questions concernant les mécanismes de la perte neuronale, l'accumulation de l'amyloïde bêta dans le corps cellulaire des neurones, l'inflammation et la gliose, et les altérations dendritiques. Elles ont permis de tirer quelques leçons des acquis dans la cinétique des changements. Le lien entre les symptômes, les lésions et l'augmentation de Abeta oligomères a été jugée difficile à démêler. Enchevêtrements neurofibrillaires ne se trouvent que dans les lignées de souris qui surexpriment la protéine tau muté ou tau humaine sur un tau murin - / - arrière-plan. Un modèle transgénique triplement (muté APP, PS1 et tau) récapitule les modifications observées dans la MA, mais sa pertinence physiologique peut être discuté. Un certain nombre de modulateurs de Abeta ou de l'accumulation de la protéine tau ont été testés. Un modèle transgénique peut être analysé à trois niveaux au moins (les symptômes, les lésions, la cause de la maladie), et une clef de lecture est proposé de résumer cette analyse.
Cinétique D'hybridation Sur Puce Pour L'optimisation Des Expériences Sur L'expression Génique
Puces à ADN est un outil puissant pour obtenir un aperçu de l'expression génique dans des échantillons biologiques. Bien que l'utilisation fructueuse de l'analyse d'expression basé sur un microréseau a été démontrée dans un certain nombre d'applications, le principal problème avec cette approche est le fait que les niveaux d'expression déduites des expériences d'hybridation ne sont pas nécessairement en corrélation avec les concentrations d'ARN. En outre sondes oligonucléotidiques correspondant à un même gène peut donner des signaux d'hybridation différentes. En dehors de cross-hybridations et épissage différentiel, cela pourrait être dû à des structures secondaires de sondes ou de cibles. En outre, à faible copie des gènes, l'équilibre d'hybridation peut être atteint après des temps d'hybridation beaucoup plus longue que celle couramment utilisée (la nuit, soit 15 h). Ainsi, les signaux d'hybridation pourrait dépendre des propriétés cinétiques de la sonde, qui peut varier entre les différentes sondes oligonucléotidiques immobilisées sur la puce même. Pour valider cette hypothèse, la cinétique d'hybridation sur puce et de l'analyse thermostabilité duplex ont été effectuées à l'aide puces à oligonucléotides contenant 50-mer des sondes correspondant à 10 gènes de la souris. Nous démontrons que les différences dans la cinétique d'hybridation entre les sondes existent et peuvent influencer l'interprétation des données d'expression. En outre, nous montrons que l'utilisation de la cinétique d'hybridation sur puce, la quantification des objectifs est faisable en utilisant les courbes d'étalonnage.
[Les Lésions De La Maladie D'Alzheimer: Quelles Perspectives Thérapeutiques?]
Le cerveau des lésions associées à la maladie d'Alzheimer sont causées par l'accumulation extracellulaire de peptide Abeta et l'accumulation intracellulaire de la protéine tau. Abeta peptide fait le noyau de la plaque sénile (le «dépôt focal»), il est également présent dans les dépôts extracellulaires "diffuses" et dans les parois des vaisseaux. Enchevêtrements neurofibrillaires, et les fils neuropile sont composés de la protéine tau hyperphosphorylée qui s'accumule aussi dans les processus de la couronne de la plaque sénile. Les dépôts Abeta d'abord impliquer le néocortex, alors que la pathologie tau est d'abord dans la région de l'hippocampe. Dépôts Abeta d'abord se dans le néocortex, alors que l'accumulation intracellulaire de tau affectent principalement la région hippocampique. Abeta dépôts peptidiques sont d'abord trouvé dans tous les domaines du néocortex, alors impliquer l'hippocampe et les noyaux sous-corticaux. Tau lésions successivement associer les régions hippocampiques, des zones multi-et uni-modale et enfin les cortex primaires dans les stades stéréotypés. Les mutations de l'APP, le précurseur de l'amyloïde bêta peptide, provoquer autosomique dominante familiale de la maladie d'Alzheimer, ce qui suggère que d'une cascade de réactions surproduction lien Abeta, la pathologie tau et le phénotype clinique. Les souris transgéniques portant le gène muté humain APP (souris APP) d'élaborer une dépôts. Injection systémique de l'amyloïde bêta peptide empêche le dépôt de Abeta peptide. Toutefois, un essai clinique a dû être interrompue lorsque la méningo-encéphalite a eu lieu dans une proportion significative des patients traités. Des études post mortem ont montré une relative rareté des dépôts Abeta. Études d'immunothérapie à venir devraient bientôt montrer si la prévention du dépôt de Abeta interrompt progression de la maladie.
Le Cholestérol Présent Dans La Plaque Sénile: Souvent évoqué, Jamais Vu
Les composants lipidiques de la plaque sénile (SP) restent encore largement inconnus. Les plaques séniles sont dit être enrichi en cholestérol dans quelques études utilisant la sonde de cholestérol filipine et une méthode basée sur l'activité histoenzymatic cholestérol oxydase. Nous fournissons des données qui suggèrent fortement que ces résultats sont des faux positifs: le PS étaient encore tachés en l'absence de l'enzyme cholestérol oxydase; filipine encore marqué les plaques après l'extraction des lipides. D'autre part, résorufine, la très fluorescent du produit final de la méthode histoenzymatic, lié avec une forte affinité pour les PS et des enchevêtrements neurofibrillaires de manière indépendante le taux de cholestérol-, et pourrait servir comme un nouveau marqueur de la substance amyloïde. En conclusion, l'enrichissement en cholestérol probable de la SP n'a jamais été prouvé jusqu'à présent, et pourrait nécessiter non-histologiques méthodes doit être vérifié.
Temps-gated Totale Microscopie De Fluorescence à Réflexion Avec Une Source D'excitation Supercontinuum
Nous présentons le développement instrumental d'une polyvalente fluorescence totale de configuration interne réflexion en microscopie durée de vie d'imagerie éclairé par une source laser supercontinuum. Il permet l'exécution imagerie à grand champ de vie de fluorescence avec une résolution axiale longueur d 'onde pour une large gamme de fluorophores. Le temps d'acquisition à court global et la résolution axiale sont bien adaptés pour des applications dynamiques neurobiologiques.
Signature De L'expression Des Gènes Hypoplasie Cérébelleuse Dans Un Modèle Murin Du Syndrome De Down Durant Le Développement Postnatal
Le syndrome de Down est une anomalie chromosomique causée par la présence de trois copies du chromosome 21. Les mécanismes par lesquels cette aneuploïdie produit le phénotype complexe et variable observée chez les personnes atteintes du syndrome de Down sont toujours en discussion. Des études récentes ont démontré un niveau de transcription accrue des gènes de trois copies avec une certaine compensation de dosage ou d'amplification pour un sous-ensemble d'entre eux. L'impact de cet effet de dosage génique sur le transcriptome total est encore débattu des études longitudinales et d'évaluer la variabilité entre les échantillons, les tissus et les stades de développement sont nécessaires.
Hypoxanthine-guanine Phosphoribosyl Transférase Régule Programmation Précoce Du Développement Des Neurones Dopaminergiques: Implications Pour La Pathogenèse De La Maladie De Lesch-Nyhan
Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase carence entraîne (HPRT) dans la maladie de Lesch-Nyhan (LND), où les personnes touchées présentent un trouble neuro-comportemental caractéristique qui a été liée à un dysfonctionnement des voies dopaminergiques des noyaux gris centraux. Étant donné que les fonctions de HPRT, une enzyme responsable du recyclage ménager purines, n'ont pas de relations directes avec les voies dopaminergiques, les mécanismes par lesquels les affectent carence en HPRT demeurent inconnues. Les études actuelles montrent que la carence en HPRT influe sur les processus de développement au début contrôlant le phénotype dopaminergique, en utilisant plusieurs modèles cellulaires différents de carence en HPRT. Méthodes de puces à ADN et PCR quantitative ont été appliqués à 10 pays différents HPRT-déficiente (HPRT (-)) sous-lignées dérivées de la lignée cellulaire MN9D. Malgré la variation inhérente à ces lignées mutantes, plusieurs anomalies compatibles étaient évidentes. Le plus remarquable sont les augmentations des ARNm pour 1 et 2 engrailed, facteurs de transcription connus pour jouer un rôle clé dans la spécification et la survie des neurones dopaminergiques. Les augmentations dans les ARNm ont été accompagnés par une augmentation des protéines engrailed, et la restauration de l'expression est revenue HPRT engrailed vers des niveaux normaux, ce qui démontre une relation fonctionnelle entre HPRT et engrailed. La pertinence fonctionnelle de la signature moléculaire anormale de développement de l'HPRT (-) des cellules MN9D était évidente dans la croissance des neurites appauvrie lorsque les cellules ont été contraints de faire la différence chimiquement. Pour vérifier que ces anomalies ne sont pas idiosyncrasique à la ligne MN9D, HPRT (-) de la sous-lignées SK-N-BE (2) M17 ligne de neuroblastome humain ont été évalués et une expression accrue des ARNm engrailed a également été observée. La surexpression de engrailed eu lieu même dans des fibroblastes primaires de patients atteints de la LND d'une manière qui suggère une corrélation avec la sévérité de la maladie. Ces résultats fournissent une preuve nouvelle que la carence en HPRT peut affecter les neurones dopaminergiques en influençant les mécanismes de développement précoces.
Classification Et Basic Pathology De La Maladie D'Alzheimer
Les lésions de la maladie d'Alzheimer comprennent l'accumulation de protéines, les pertes de neurones et des synapses, et des altérations liées à des processus réactifs. Extracellulaire d'accumulation se produit Abeta dans le parenchyme sous forme de dépôts diffus, focal ou stellaire. Il peut s'agir des parois des vaisseaux des artères, veines et capillaires. Les cas dans lesquels les parois des vaisseaux capillaires sont affectés ont une probabilité plus élevée d'avoir un ou deux allèles apoepsilon 4. Parenchymateuse ainsi que vasculaire dépôt Abeta suit une progression pas à pas. Tau accumulation, probablement le meilleur histopathologique corréler des symptômes cliniques, prend trois aspects: dans le corps cellulaire du neurone comme dégénérescence neurofibrillaire, dans les dendrites en tant que fils neuropile, et dans les axones formant la couronne de plaques séniles neuritique. La progression de la pathologie tau est progressif et stéréotypée du cortex entorhinal, par le biais de l'hippocampe, à l'isocortex. La perte neuronale est hétérogène et spécifique à la zone. Son mécanisme est encore discuté. Le moment de la perte synaptique, probablement liée à Abeta peptide lui-même, peut-être sous forme d'oligomères, est également controversée. Divers types clinico-pathologiques de la maladie d'Alzheimer ont été décrites, selon le type des lésions (la plaque et ne enchevêtrement prédominante), le type d'apparition (début focal), la cause (génétique ou sporadique) et les lésions associées (corps de Lewy , les lésions vasculaires, la sclérose hippocampique, TDP-43 inclusions et des maladies des céréales argyrophiles).
Nanoroughened Films Plasmonique Pour La Détection Améliorée Biodétection
Bien que la fluorescence est la technique de marquage en vigueur dans les applications de biodétection, amélioration de la sensibilité est encore un défi effort. Nous montrons que les diapositives de revêtement de microscope standard avec des films d'argent nanoroughened fournit un rehaussement du signal à haute fluorescence due à des interactions plasmoniques. Comme une preuve de concept, nous avons appliqué ces films avec des propriétés adaptées à plasmoniques puces à ADN. En utilisant des dispositifs de balayage optique, nous avons réalisé des amplifications de signaux de plus de 40 fois.
Déficits Prolifération Et La Dysrégulation Expression Des Gènes Dans Le Syndrome De Down (Ts1Cje) Cellules Progénitrices Neurales Cultivées à Partir De Neurosphères
Neurophenotypes du syndrome de Down sont caractérisés par un retard mental et un volume du cerveau a diminué. Pour déterminer si les déficits en matière de prolifération pourrait être responsable de ce phénotype, cellules progénitrices neurales ont été isolés à partir du développement de E14 néocortex de Down syndrome souris partielles Ts1Cje trisomie et euploïdes (WT) littermates et cultivé comme neurosphères. Progéniteurs neuronaux Ts1Cje proliféré à un rythme plus lent, en raison de l'allongement du cycle cellulaire, et un plus grand nombre de cellules ont été positifs pour la protéine fibrillaire gliale acide. Une augmentation dans la mort cellulaire a également été noté. Profils d'expression génique de cellules progénitrices neurales de Ts1Cje et WT ont montré que 54% des gènes triploïdes avaient des ratios d'expression (Ts1Cje/WT) significativement plus que le ratio gène diploïde devrait de 1,0. Certains gènes diploïdes associés à la prolifération, la différenciation et la fonction gliale ont été dérégulé. Fait intéressant, la prolifération et la dysrégulation l'expression des gènes détectés chez les souris Ts1Cje n'a pas besoin de la surexpression de la protéine du chromosome 21 gènes précurseur de l'amyloïde (APP) et la superoxyde dismutase soluble 1 (SOD1).
Âge Et De L'albumine D-binding Protein Site Tissu De Contrôle Du Plasminogène Activateur Niveaux: Impact Neurotoxique
Tissulaire recombinant de type activateur du plasminogène (tPA) est le médicament fibrinolytique de choix pour traiter les patients d'AVC. Cependant, un nombre croissant de preuves indique que, outre son rôle bénéfique thrombolytique, le tPA peut aussi avoir un effet délétère sur le cerveau ischémique. Bien que les influences du vieillissement l'incidence des AVC, les complications et les résultats, dépendant de l'âge des relations entre le tPA endogène et blessures de course n'ont pas encore été étudié. Ici, nous déclarons que le vieillissement est associé à une réduction sélective du cerveau tPA expression dans le cerveau murin. En outre, nos résultats montrent que l'albumine site D-binding protein (DBP) comme une clé liée à l'âge régulateur de la transcription neuronale du tPA. En outre, l'inhibition de la DBP-médiation expression du tPA confère dans la neuroprotection in vitro. En conséquence, des niveaux réduits de tPA chez les souris âgées sont associés avec de plus petites blessures excitotoxiques / ischémique et la protection de la perméabilité de l'unité neurovasculaire cours de l'ischémie cérébrale. De même, nous fournissons des preuves neuroradiologique indiquant l'existence d'une relation inverse entre l'âge et le volume de la lésion ischémique chez les patients ayant subi un AVC ischémique aigu. Ensemble, ces résultats indiquent que la relation entre le DBP, le tPA et le vieillissement jouent un rôle important dans le résultat de l'ischémie cérébrale.
Changements De Cholestérol Dans La Maladie D'Alzheimer: Méthodes D'analyse Et D'impact Sur La Formation De Grande Endosomes
Un nombre croissant de résultats impliquant le métabolisme du cholestérol dans la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer (AD) suggèrent le taux de cholestérol en tant que cible pour le traitement. La recherche en génétique, la pathologie, l'épidémiologie, la biochimie et la biologie cellulaire, ainsi que dans des modèles animaux, suggère que le cholestérol, son transporteur dans le cerveau, l'apolipoprotéine E, protéine précurseur amyloïde, et bêta-amyloïde interagissent tous dans la pathogénie de la MA. Étonnamment, les questions clés restent en suspens en raison de l'absence de méthodes sensibles et spécifiques pour évaluer les niveaux de cholestérol dans le cerveau à la résolution subcellulaire. Les objectifs de cet examen ne sont pas seulement de discuter des différentes méthodes pour mesurer le taux de cholestérol et de ses métabolites et de cataloguer les résultats obtenus à partir de patients atteints de MA, mais aussi pour discuter de nouvelles données reliant taux élevé de cholestérol membrane plasmique, avec les adaptations des compartiments d'endocytose. Ces études sont particulièrement pertinentes pour pathologie de la MA, car élargie endosomes sont considérées comme le premier changement morphologique observé dans le cerveau AD, dans les deux cas sporadiques et le syndrome de Down.
L'endocytose Dépendante De La Clathrine APP Et La Sécrétion Abeta Sont Très Sensibles à La Teneur En Cholestérol Membrane Plasmique
Plusieurs éléments de preuve de soutenir une forte relation entre le cholestérol et la pathogenèse des maladies d'Alzheimer. Le taux de cholestérol membranaire est connue pour moduler la protéine précurseur amyloïde (APP) endocytose et bêta-amyloïde (Abeta) sécrétion. Ici, nous montrons dans un modèle de lignée cellulaire humaine de l'endocytose (cellules HEK293) que le cholestérol exerce ces effets de manière dose-dépendante et linéaire, sur une large gamme de concentrations (-40% à +40% des variations de taux de cholestérol membrane plasmique induite par méthyl-bêta-cyclodextrine (MBCD) et MBCD-cholestérol complexe respectivement). Nous avons constaté que l'effet progressif de cholestérol est inhibée par interférence ARN médiée par la régulation négative de la clathrine petite. Modulation de l'endocytose clathrine APP par le cholestérol a été démontrée en utilisant des mutants de protéines impliquées dans la formation des endosomes précoces (dynamin2, Eps15 et Rab5). Il est important de nous montrer que d'autres protéines membranaires de l'APP ne sont pas affectés par le cholestérol dans la même mesure. En effet dépendante de la clathrine endocytose de la transferrine et cannabinoid1 récepteurs ainsi que l'internalisation des protéines de surface marqués avec un dérivé de la biotine (sulfo-NHS-SS-biotine) ne sont pas sensibles aux variations de taux de cholestérol membrane plasmique de -40% à 40%. En conclusion endocytose dépendante de la clathrine APP semble être très sensible aux niveaux de cholestérol membranaire. Ces résultats suggèrent que l'augmentation du cholestérol dans la MA pourrait être responsable de l'internalisation accrue de la clathrine-, dynamin2-, Eps15 et Rab5 l'endocytose dépendante de l'APP et de la surproduction qui a suivi de l'amyloïde bêta.
Augmentation Du Cholestérol Locale Déclenche Protéine Précurseur Amyloïde-BACE1 Clustering Dans Des Radeaux Lipidiques Et L'endocytose Rapide
Peptide amyloïde (Aß) est généré par clivage séquentielle de la protéine précurseur amyloïde (APP) par β-sécrétase (BACE1) et γ-sécrétase. La production augmente Aß après le chargement du plasma cholestérol membranaire par des mécanismes inconnus. Pour déterminer comment APP-BACE1 proximité affecte ce phénomène, nous avons développé une imagerie de fluorescence durée de vie microscopique Förster transfert d'énergie par résonance (FLIM-FRET) technique pour la visualisation de ces molécules, soit par épifluorescence ou à la membrane plasmique que l'aide totale fluorescence à réflexion interne. En outre, nous avons utilisé la spectroscopie de corrélation de fluorescence pour déterminer la partition des lipides des radeaux de l'APP-protéine fluorescente jaune (YFP) et BACE1-protéine fluorescente verte (GFP) des molécules à la membrane plasmique des neurones. Nous montrons que moins de 10 min après l'exposition le taux de cholestérol, de la proximité Bace1-GFP/APP-mCherry augmente sélectivement à la membrane et l'APP relocalise à rafts, précédés par endocytose rapide. Après une exposition de cholestérol plus, l'APP et BACE1 se trouvent à proximité intracellulaire. Nous démontrons que le chargement du cholestérol n'augmente pas la production de Aß en ayant un impact direct sur BACE1 activité catalytique mais plutôt en modifiant l'accessibilité de BACE1 à son substrat, l'APP. Ce changement dans l'accessibilité est médiée par le regroupement dans des radeaux lipidiques, suivie par endocytose rapide.
Analyse De L'expression Des Gènes Au Niveau Cellulaire En Utilisant Une Seule Base De Microgouttelettes De La Technologie Microfluidique
Dans le présent travail, nous avons mesuré l'expression de l'ARN messager des gènes spécifiques à la fois à partir d'ARN totaux et les cellules encapsulées dans des gouttelettes. La puce microfluidique introduit comprend les fonctionnalités suivantes: ARN / encapsulation de cellules, lyse, la transcription inverse et en temps réel la réaction en chaîne par polymérase. Nous avons montré que les mesures simplex et duplex d'expression des gènes peut être effectuée sur une population de 100 échantillons d'ARN purifiés encapsulés dans des gouttelettes simultanément nl 2 en moins de 2 h. Une analyse de 100 échantillons contenant de un à trois cellules a montré la cohérence excellente avec des techniques standard concernant des valeurs moyennes. Les distributions de cellule à cellule de l'expression E-cadhérine suggèrent des fluctuations de l'ordre de 80% dans le nombre de transcriptions, qui est très compatible avec les conclusions générales tirées de la littérature. Un modèle mathématique a également été mis en place pour renforcer l'interprétation de nos résultats. Le présent travail ouvre la voie à l'acquisition systématique de ces informations dans les études biologiques et biomédicales.
