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Articles by Mario J. Borgnia in JoVE
JoVE Immunology and Infection
使用低温电子断层扫描和自动子断层扫描平均HIV包膜糖蛋白分子结构的测定
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9University of Notre Dame, 10Washington University in St. Louis, 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
协议描述了高通量的方法，以确定使用低温电子断层扫描和三维图像处理的膜蛋白的结构。它涵盖了样品制备的详细信息，数据采集，数据处理和解释，最后一个有代表性的目标的方法，HIV - 1包膜糖蛋白的生产。这些计算程序设计的方式，使研究人员和学生远程工作和作出贡献的数据处理和结构分析。
Other articles by Mario J. Borgnia on PubMed
自动的图像采集与处理冷冻电子显微研究大分子的程序集的使用 K 4 X 4 K CCD 相机的新的一代。
我们以前有报道 AutoEM，一个软件包半自动采集的数据从透射电子显微镜的发展。继续努力提高电镜的结构测定生物大分子的程序集的速度，我们在这里汇报新一代的 4k CCD 相机用于冷冻电子显微应用程序的性能。我们证明在 120 kV，和 67000 x 名义放大，在功率谱和信号的信噪比新 4 K CCD 相机可媲美电影图像使用高达约 1/6.5A(-1) 的各项决议的蔡司扫描仪扫描获得的值。标本为每次曝光 4 K ccd 成像面积约三分之一的区域的可以记录在胶片上的类似接触。CCD 相机还的录制图像在低放大倍数从孔来衡量的陶冰洞中厚度的中心目的。此处所示为复杂，1.8 MDa 芽孢杆菌嗜热脂肪二十面体的丙酮酸盐脱氢的催化核心 15 A 三维地图的决心和与获得的 x 射线晶体学这复杂的先前报告原子模型的比较，相机的性能令人满意中低温电子显微镜，使用低剂量条件下。
原子结构对接入低分辨率的地图核心加权拟合方法： 低温电镜技术的应用。
低温电镜技术的"单个粒子"是功能强大的方法来分析大高分子的程序集，不适合进行调查的传统 x 射线晶体学方法的结构。在这些研究中的一个关键步骤是通过以获得 multiprotein 配合物的原子解释到地图索取电子显微镜数据拟合各个组件的原子结构。在这里，我们报告"核心权重"方法，为此目的与网格线程的蒙特卡罗 （GTMC） 方法相结合的使用。单个结构的"核心"被定义为表示密度分布在哪里最不可能被改变由包括高分子大会感兴趣的其他组件的一部分。已由其确定正确的配合 (i) α-链的 T 细胞受体变量域进复杂 5 至 40 A，分辨率 alphabeta 模拟地图和 (ii) E2 进实验确定的地图，在一项决议，二十面体复合体由 60 副本，这种酶的组成的 14 丙酮酸脱氢酶催化域的能力评估方法的性能。使用 x 射线结构的两个测试用例作为参照，我们表明较为传统的方法，与核心加权方法和网格线程的蒙特卡罗方法的组合可以识别正确的配合可靠和迅速从低分辨率的地图都是典型的结构确定使用的单粒子电子显微镜。
可视化的阿尔法螺旋构造使用 9 1.8 MDa 二十面体核心的丙酮酸盐脱氢酶的分子图像密度地图中的新功能。
战略，以实现一般由低温电子显微镜的蛋白复合体的结构中的最高决议涉及平均从大量的个别分子图像信息。不过，很大的局限性被构成的非均质性在图像质量和蛋白质构象所固有的大型数据集的图像。在这里，我们表现出的迭代的细化和严格分子排序组合是从芽孢杆菌嗜热脂肪获得 1.8 MDa 二十面体催化核心地图质量大幅度改善复杂的丙酮酸盐脱氢酶的一种有效方法。从一开始组的 42,945 图像的复杂的核心，我们显示使用只有最好的 139 粒子在数据集生成一个映射，优于那些构造与更多的图像，并从少 9 粒子作为构造图中，毫不含糊地可以可视化处理许多 α-螺旋结构中的位置。
9 MDa 二十面体丙酮酸脱氢酶 Subcomplex，包含使用 Cryoelectron 显微镜的 E2 和 E3 酶的分子结构。
最大多功能催化机之间的单元格中，催化生产的乙酰 CoA 从丙酮酸丙酮酸脱氢酶多酶复合体。我们以前所报告的组成 60 mer 二十面体 dihydrolipoyl 乙酰 (E2) 饰 60 副本的 heterotetrameric 11 MDa subcomplex 分子体系结构 （153 kDa 丙酮酸脱羧酶 alpha(2)beta(2)) (E1) 嗜热脂肪芽孢杆菌 （米尔恩、 J.L.S.、 施，D.、 罗森塔尔、 体育 B.、 阳光、 J.S.、 圣多明各、 G.J.、 吴，十、 布鲁克斯、 B.R.、 帕勒姆，R.N.、 亨德森岛、 R.和研，条 （2002 年） 恩博 J.21，5587 5598)。大约 90 A 分离环缝从外壳 E2 的乙酰基转移酶催化域形成的 E1 四聚物状态。使用 cryoelectron 显微镜，我们在座点缀的 homodimeric 100 kDa dihydrolipoyl 脱氢酶 (E3) 60 副本的 E2 核心三维重建。复杂 E2E3 有大约 75 A 的乙酰基转移酶域内二十面体大会与 E3 homodimers 的外壳，类似环隙。E3 进地图坐标的自动的拟合表明优秀外壳地图的密度和两个最合适的 E3 方向的位置之间的对应关系。E1 在复杂 E1E2 一样，E3 homodimer 的中央二折轴大致面向沿边缘的外壳，使酶的活性位点可从环形 E2 核心和外壳之间的差距。E1E2 和 E2E3 配合物体系结构中的相似之处说明机制的耦合所涉及的两个关键阶段整个环形的差距，需要运动的摆动的 lipoyl 域即乙酰 CoA 合成和再生 dithiolane 环的 lipoyl 域活动网站的基本的相似性。
蛭使用低温电子断层扫描的高度弯曲结构的三维成像。
蛭 bacteriovorus 单元格是上其他革兰阴性菌，包括人类病原体饲料小 deltaproteobacterial。我们使用低温电子断层扫描，表明 B.bacteriovorus 细胞能够很大的灵活性和局部变形的外部和内部的膜，而不会丢失的细胞完整性。这些形状变化可以发生在少于 2 分钟，和高度弯曲的单元格的内部结构的分析表明分子机器的总体分布和 nucleoid 是适度弯曲细胞相似。B.bacteriovorus 单元格显示包含广泛的短和长丝状结构的内部网络。我们建议重排的中唯一属性的单元格信封上，结合这些结构可能是基础 B.bacteriovorus 细胞以查找和输入细菌猎物的非凡的能力。
去噪的生物电子层析成像算法的评价。
派生的透射电镜生物样品的 Tomograms 可以是由于使用了低电子剂量的大多数数据收集计划，和在 3D 体积重建期间所产生的不准确之处的"缺少楔"存在本质上嘈杂的。Tomograms 可以可靠地解释之前，例如，3D 分割，它是数据必须适当地噪可以单独进行优化的程序使用特定的数据集。在这里，我们执行比较各种非线性去噪技术上记录在室温条件下和在低温下的 tomograms 和建立量化的标准来选择去噪方法为给定的断层图最相关的系统化过程。我们证明使用适当的去噪算法有利于感染艾滋病毒的巨噬细胞和蛭细菌分别从标本室和低温下，获得 tomograms 的鲁棒分割。我们与手动提取相同的 tomograms 的主要功能及其性能进行比较来验证这一战略的最佳噪 tomograms 自动分割。
本机艾滋病毒 1 Gp120 三聚体的分子体系结构。
人和猴免疫缺陷病毒包膜糖蛋白 (Env) (艾滋病毒和 SIV，分别） 调解受病毒细胞表面体结合 CD4 靶细胞上的进行感染。Env 是膜的黑腹的跨膜糖蛋白 (gp41) 和表面的糖蛋白 (gp120) 和病毒性表面形式三聚体。我们使用低温电子断层扫描三维图像分类和平均结合起来，报告对本机艾滋病毒-1 unliganded 状态、 复杂与广泛中和抗体 b12 和三元复数与 CD4 和 17b 抗体显示三联 Env 的三维结构。由管接头中的 b12 和 CD4 17b 时限构象到电子断层派生的密度地图单体 gp120 核心的已知的晶体结构，我们推导出在 unliganded 和 CD4 束缚态的本机艾滋病毒 1 gp120 三聚分子模型。我们证明 CD4 绑定在一次重大改组的 Env 三聚体，结果造成向外旋转和位移的每个 gp120 单体。这似乎会加上重排 gp41 地区沿着中轴线的三聚体，导致病毒性与目标细胞细胞膜之间的密切联系。我们的研究结果阐明的结构和有关的中和抗体与靶细胞的附件三联艾滋病毒 1 gp120 构象变化。
三联 SIV 和艾滋病毒 1 包膜糖蛋白对完整病毒的分子体系结构： 在第四纪的结构依赖于应变的变化。
目标单元格和感染的人，密切相关的猴免疫缺陷病毒的第一步 （艾滋病毒和 SIV，分别） 与 heterodimers 的病毒跨膜糖蛋白 (gp41） 和到目标 T 细胞表面的糖蛋白 (gp120) 组成的三联包膜糖蛋白 (Env) 绑定时发生。三联 Env 分子完整的病毒知识是结构的理解基本病毒细胞相互作用的分子机制和有效的基于免疫原的疫苗的设计，以防治艾滋病毒/艾滋病的重要。三联 Env 在 unliganded 结构中已经导致以前的完整艾滋病毒 1 BaL virions 的分析和 CD4 liganded ~ 20 ① 分辨率。在这里，我们表明的三联 Env SIVmneE11S，从体系结构的分子 SIVmac239 和艾滋病毒 1 R3A 株是密切相媲美，先前确定的艾滋病毒 1 BaL，V1 和 V2 变量循环位于图文场中，接近病毒与单元格之间的接触区域的顶点。在三联 Env V1/V2 循环的位置明确证实了艾滋病毒 1 R3A virions 删除这些循环与快递 Env 基因修饰的结构分析。引人注目的是，在 CD4 独立应变，SIV CP MAC 三联 Env 处于一"开放"的构象有 gp120 眼珠类似于见 Hiv-1 BaL 与 sCD4 和 CD4i 抗体 17b 络合时构象中的三聚体。我们的研究结果表明 CD4 独立病毒性条目的分子机制结构解释和进一步建立该低温电子断层扫描可以用于发现独特、 功能上相关的第四纪结构的 Env 显示完整的病毒。
受体中的阵列膜平面横向密度影响大肠杆菌趋化反应的敏感性。
在趋化细菌中，跨膜的化学感受器兴奋传递，谢和咀嚼形成信号复杂的趋化性的感觉器官的核心。这些配合的组织扩展阵列的细胞质膜，使细菌胞外配体通过合作、 变构的响应，导致大量扩增信号诱导配体结合的浓度变化作出反应。在这里，我们有结合低温电子层析成像研究化学感受器阵列完好的大肠杆菌细胞中的 3D 空间体系结构的计算模型开发的协同性和趋化反应的敏感性预测模型。预测实验使用荧光共振能量转移 （音品） 显微镜进行了测试。我们的研究结果表明空间扩展化学感受器阵列横向包装密度的部分有序的变化可以调节细菌趋化反应，，所得的完整细胞低温电子断层扫描阵列分子组织有关信息可以转化为可测试、 预测计算模型的趋化性反应。
三联艾滋病毒 1 糖蛋白 Gp140 抗原和本机艾滋病毒 1 包膜糖蛋白显示相同的关闭和打开第四纪分子体系结构。
Hiv-1 感染的第一步发生与细胞表面的 CD4 向三联艾滋病毒 1 包膜糖蛋白 (Env) 黑腹的跨膜糖蛋白 (gp41) 和表面的糖蛋白 (gp120) 绑定。可溶性版本的三联 Env 上完整病毒显示类似于观察到的结构和功能特性的设计是非常可取的设计可能是有效的防治艾滋病毒/艾滋病疫苗的抗原视角。使用 cryoelectron 层析成像结合子宗卷平均，我们已经分析了结构的 SOSIP gp140 三聚体，其中被分解、 增溶胞外区的三联 Hiv-1 的版本。我们显示 unliganded gp140 三聚体采用类似于由本机 unliganded 三聚体完好无损的艾滋病毒 1 virions 表面上显示的第四纪安排。当与可溶性 CD4，Fab 17b，将绑定到在其趋化因子 hiv 感染抑制绑定站点，或既是可溶性 CD4 gp120 和 17b Fab 络合时，gp140 三聚体显示打开构象，其中有一个向外旋转和位移的每个 gp120 protomer。我们证明在封闭式和开放式构象的可溶性三聚体三聚体相同，观察的封闭与开放的国家，分别上完好的艾滋病毒 1 BaL virions，三联 gp120 的建立可溶性 gp140 三聚体可以为了模仿的第四纪的结构转换的 gp120 的分子安排显示由本机三联 Env。
可溶性 CD4 绑定国家的使用低温电子断层扫描确定的三联猴免疫缺陷病毒包膜糖蛋白的三维结构。
显示在三联的信封糖蛋白 (Env) 峰值猴免疫缺陷病毒 (SIV) 和人类免疫缺陷病毒类型的曲面上 1 （艾滋病毒-1） virions 由组成三个 heterodimers 的病毒糖蛋白 gp120 和 gp41。虽然 gp120 绑定以细胞表面的 CD4 和趋化因子受体已知征求 gp120 和 gp41 的构象变化，只是最近才阐明第四纪的三聚体结构的变化。因为艾滋病毒 1 BaL 隔离，CD4 附件结果惊人重排反应从"封闭"到"开放"构象三聚体。然而，对 SIV，三聚体的 CD4 影响不被描述。使用低温电子断层扫描，我们现在已经确定的可溶性 CD4 分子体系结构 (sCD4)-绑定的 SIV Env 三聚体为三个不同品系 （SIVmneE11S，SIVmac239 和 SIV CP MAC） 的国家。与艾滋病毒 1 博联公司形成了鲜明的对比，SIVmneE11S 和 SIVmac239 Env 表明只有轻微的构象变化后 sCD4 绑定。在 SIV CP-MAC，三联 Env 一"开放"构象类似于见 Hiv-1 BaL sCD4 络合状态的显示位置，我们显示的 sCD4 或 7 3 绑定后构象有没有发生重大的进一步变化抗体。密度图还显示 7 3 和 17b 抗体针对抗原表位在 gp120 对立双方的 hiv 感染抑制绑定站点上。这些结果提供新的见解的 SIV Env 结构的多样性，并显示有绑定到三联 SIV Env sCD4 的方向依赖应变的变化。
使用低温电子断层扫描和 3D 分卷平均构象非均质性的计算分离。
我们以前都用与分卷平均和分类相结合的低温电子断层扫描以获得生物大分子中的程序集的情况下单一的优势物种在场，这些方法适用于各种三联艾滋病毒 1 和 SIV 包膜糖蛋白 (Env) 分析的 3D 结构。在这里，我们扩展自动化、 迭代，这些研究表明缺少楔更正的 3D 图像的对齐方式和分类方法来区分多个构象，都同时存在。我们目前代表不同构象国家的 Env 向量元素的空间分布测量的方法。我们确定数据处理策略允许明确分离以前为特征的关闭和打开构象，以及 unliganded 和 Env 它们时的抗体 liganded 国家目前的混合物。我们表明识别并删除峰值最低信号的信噪比提高总体准确性的个别 Env sub-volumes，之间的对齐方式，该对齐方式的准确性，反过来，确定图像分类评估构象异构混合物中的异质性的成功。我们成功地分离和重构独特的 3D 结构的 unliganded 和抗体 liganded，以及打开和关闭的构象的 Env 目前同时在混合物通过验证这些分离过程的计算。
