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Articles by Mario J. Borgnia in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine dell'HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9University of Notre Dame, 10Washington University in St. Louis, 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
Il protocollo descrive un approccio high-throughput per determinare le strutture di proteine di membrana con crio-elettroni tomografia ed elaborazione delle immagini 3D. Esso copre i dettagli della preparazione dei campioni, raccolta, elaborazione e interpretazione dei dati, e si conclude con la produzione di un bersaglio rappresentante per l'approccio, l'HIV-1 glicoproteina Busta. Queste procedure di calcolo sono stati progettati in un modo che consente ai ricercatori e agli studenti di lavorare in remoto e contribuire alla elaborazione dei dati e l'analisi strutturale.
Other articles by Mario J. Borgnia on PubMed
Un Metodo Di Montaggio Nucleo-ponderata Per Ancoraggio Strutture Atomiche in Mappe a Bassa Risoluzione: Applicazione Di Crio-microscopia Elettronica
Crio-microscopia elettronica di "singole particelle" è un metodo potente per analizzare le strutture di grandi assiemi macromolecolare che non sono suscettibili di indagine tradizionali metodi cristallografici dei raggi x. Un passo fondamentale in questi studi è possibile ottenere atomiche interpretazioni dei complessi multiproteici montaggio strutture atomiche dei singoli componenti in mappe ottenute da dati microscopici elettrone. Qui, segnaliamo l'uso di un metodo di "core-ponderazione", combinato con un approccio Monte Carlo (GTMC) griglia-threading per questo scopo. Per rappresentare la parte dove la distribuzione di densità è meno probabilità di essere modificato da altri componenti che costituiscono l'assembly macromolecolare di interesse è definito il "nucleo" di una singola struttura. Le prestazioni del metodo sono stata valutata dalla sua capacità di determinare la misura corretta del (i) la catena alfa del dominio variabile T-cell receptor in mappa simulato dell'Alfabeta complesso a risoluzioni tra 5 e 40 A e (ii) il dominio catalitico E2 della piruvato deidrogenasi in una mappa di determinato sperimentalmente, a 14 una risoluzione, del complesso icosahedral formata da 60 copie di questo enzima. Utilizzando le strutture dei raggi x di due casi di test come riferimenti, ci dimostrano che, in contrasto con i metodi più tradizionali, la combinazione del metodo core-ponderazione e l'approccio Montecarlo griglia-threading può identificare la misura corretta in maniera affidabile e rapidamente dalle mappe a bassa risoluzione che sono tipiche delle strutture determinati con l'uso della microscopia elettronica singola particella.
Immagine Automatica Acquisizione Ed Elaborazione Utilizzando Una Nuova Generazione Di 4 K X 4 Telecamere CCD K Per Gli Studi Di Microscopici Elettrone Cryo Delle Assemblee Macromolecolare
In precedenza abbiamo segnalato lo sviluppo di AutoEM, un pacchetto software per semi-acquisizione dei dati da un microscopio elettronico a trasmissione. In continui sforzi per migliorare la velocità di determinazione della struttura delle assemblee macromolecolare di microscopia elettronica, riportiamo qui sulle prestazioni di una nuova generazione di K 4 telecamere CCD per uso nelle applicazioni microscopiche cryo electron. Dimostriamo che a 120 kV e a un ingrandimento nominale di 67000 x, spettri di potenza e rapporto segnale-rumore per la fotocamera nuova K 4 CCD è paragonabili ai valori ottenuti per film immagini digitalizzate tramite scanner Zeiss risoluzioni alto come circa 1/6.5A(-1). L'area campione fotografato per ciascuna esposizione sul CCD 4 K è circa un terzo dell'area che può essere registrato con una simile esposizione su pellicola. La telecamera CCD serve anche lo scopo di registrare immagini a basso ingrandimento dal centro del foro per misurare lo spessore del ghiaccio vetrificata nel foro. Le prestazioni della fotocamera sono soddisfacente alle condizioni basse dosi utilizzate in microscopia elettronica di cryo, come dimostrato qui la determinazione di una mappa tridimensionale a 15 A per il nucleo catalitico del 1,8 MDa Bacillus stearothermophilus icosahedral complesso piruvato deidrogenasi, e il suo confronto con il modello atomico precedentemente riportato per questo complesso ottenuto dalla cristallografia a raggi x.
Visualizzazione Delle Caratteristiche Alfa-elicoidale in Una Mappa Di Densità Costruito Utilizzando 9 Immagini Molecolari Del Core Icosaedrica MDa 1,8 Della Piruvato Deidrogenasi
Strategie per ottenere le risoluzioni più alte nelle strutture dei complessi della proteina determinate da crio-microscopia elettronica in genere comportano una media di informazioni da un gran numero di singole immagini molecolari. Tuttavia, limitazioni significative sono poste dalla eterogeneità nella qualità dell'immagine e nella conformazione della proteina che sono inerenti a grandi insiemi di dati di immagini. Qui, ci dimostrano che la combinazione di raffinatezza iterativo e rigoroso ordinamento molecolare è un metodo efficace per ottenere miglioramenti sostanziali in qualità di mappa di 1,8 MDa icosahedral nucleo catalitico del complesso della piruvato deidrogenasi da Bacillus stearothermophilus. Da un set iniziale di 42.945 immagini del nucleo complesso, mostriamo che utilizzando solo le migliori 139 particelle nel set di dati produce una mappa che è superiore a quelli costruiti con un numero maggiore di immagini, e che la posizione di molte delle alfa-eliche nella struttura può essere visualizzata senza ambiguità in una mappa costruita da come pochi come 9 particelle.
Struttura Molecolare Di Una Subcomplex Deidrogenasi Del Piruvato Icosahedral 9-MDa Contenente Gli Enzimi E2 Ed E3 Usando Microscopia Di Cryoelectron
Il piruvato deidrogenasi multienzyme complessi sono tra le più grandi macchine catalitiche multifunzionale nelle cellule, di catalizzare la produzione di acetil CoA dalla piruvato. In precedenza abbiamo segnalato l'architettura molecolare di un 11-MDa subcomplex che comprende il 60-mer icosahedral diidrolipoil acetiltransferasi (E2) decorato con 60 copie dell'heterotetrameric (153-kDa alpha(2)beta(2)) decarbossilasi del piruvato (E1) da Bacillus stearothermophilus (Milne, J. L. S., Shi, D., Rosenthal, P. B., sole, J. S., Domingo, G. J., Wu, x., Brooks, B. R., Perham, R. N.Henderson, R. e Subramaniam, s. (2002) EMBO J. 21, 5587-5598). Una fessura anulare di circa 90 separa ai domini catalitici acetiltransferasi della E2 da un guscio esterno costituito da E1 tetrameri. Utilizzando la microscopia di cryoelectron, vi presentiamo qui una ricostruzione tridimensionale del nucleo E2 decorato con 60 copie del ereditaria 100 kDa diidrolipoil deidrogenasi (E3). Il complesso E2E3 ha un simile divario anulare di circa 75 A tra l'Assemblea icosahedral interiore dell'acetiltransferasi domini e la calotta dell'E3 omodimeri. Raccordo automatico delle coordinate nella mappa dell'E3 suggerisce ottima corrispondenza tra la densità della mappa della calotta esterna e le posizioni dei due migliori orientamenti dell'E3 di montaggio. Come nel caso di E1 nel complesso E1E2, l'asse centrale 2 volte dell'omodimero E3 è orientato all'incirca lungo la periferia della shell, rendendo i siti attivi dell'enzima accessibile dalla fessura anulare tra il core E2 e il guscio esterno. Le analogie nell'architettura dei complessi E1E2 ed E2E3 indicano somiglianze fondamentali nel meccanismo del sito attivo accoppiamento coinvolto in due fasi principali che richiedono il movimento di oscillazione lipoyl dominio attraverso la fessura anulare, vale a dire la sintesi di acetil CoA e rigenerazione dell'anello dithiolane del dominio lipoyl.
Imaging Tridimensionale Dell'architettura Altamente Piegata Di Bdellovibrio Bacteriovorus Mediante Tomografia Cryo-elettrone
Bdellovibrio bacteriovorus cellule sono deltaproteobacterial piccole cellule che si nutrono di altri batteri Gram-negativi, tra cui agenti patogeni umani. Utilizzando la tomografia cryo-elettrone, abbiamo dimostrato che le cellule b. bacteriovorus sono capaci di notevole flessibilità e la deformazione locale delle membrane esterne ed interne senza perdita di integrità delle cellule. Questi cambiamenti di forma possono verificarsi in meno di 2 min e analisi dell'architettura interna delle cellule altamente piegate ha dimostrato che la distribuzione globale di macchine molecolari e il nucleoide è simile a quella nelle cellule moderatamente piegate. B. bacteriovorus cellule sembrano contenere un'estesa rete interna di strutture filamentose lunghe e brevi. Proponiamo che riarrangiamenti di queste strutture, in combinazione con le proprietà uniche della busta delle cellule, possono essere alla base la notevole capacità delle cellule di b. bacteriovorus per trovare e immettere preda batterica.
Valutazione Di Denoising Algoritmi Per Tomografia Elettrone Biologica
Tomograms di campioni biologici derivati mediante microscopia elettronica della trasmissione può essere intrinsecamente rumorosa a causa dell'uso di elettrone basse dosi, la presenza di un cuneo"manca" nella maggior parte dei sistemi di raccolta dati e imprecisioni derivanti durante la ricostruzione del volume 3D. Prima di tomograms può essere interpretato in modo affidabile, ad esempio, di segmentazione 3D, è essenziale che i dati siano adeguatamente denoised utilizzando procedure che possono essere ottimizzate individualmente per set di dati specifici. Qui, applichiamo una procedura sistematica per confrontare le varie tecniche di denoising non lineare su tomograms registrati a temperatura ambiente e a temperature criogeniche e stabilire criteri quantitativi per selezionare un approccio denoising che è più rilevante per un determinato tomogramma. Ci dimostrano che utilizzando un algoritmo appropriato denoising facilita la segmentazione robusta di tomograms di macrofagi infettati da HIV e batteri Bdellovibrio ottenuti da campioni a camera e temperature criogeniche, rispettivamente. Noi convalidare questa strategia di segmentazione automatica di tomograms in modo ottimale denoised confrontando le prestazioni con estrazione manuale delle caratteristiche chiave dalla tomograms stesso.
Architettura Molecolare Del Nativi Dell'HIV-1 Gp120 Trimeri
Le glicoproteine busta (Env) del virus dell'immunodeficienza umana e scimmiesca (HIV e SIV, rispettivamente) mediare associazione virus al recettore superficiale delle cellule CD4 su cellule bersaglio per avviare l'infezione. Env è un eterodimero di una glicoproteina transmembrana (gp41), una glicoproteina di superficie (gp120) e trimeri forme sulla superficie della membrana virale. Utilizzando la tomografia cryo-elettrone combinata con classificazione di immagine tridimensionale e una media, si riportano che le strutture tridimensionali di Env trimeric visualizzati su HIV-1 nativo dello stato unliganded, nel complesso con la b12 anticorpo neutralizzante ampiamente e in un complesso ternario con CD4 e l'anticorpo 17b. Montando le strutture di cristallo conosciuto del nucleo nella vitamina b12 - e CD4/17b-bound conformazioni nelle mappe di densità derivate dalla tomografia elettrone gp120 monomerico, deriviamo modelli molecolari per l'HIV-1 gp120 trimero nativo in unliganded e Stati associati a CD4. Dimostriamo che CD4 associazione si traduce in un'importante riorganizzazione del trimero Env, causando una rotazione verso l'esterno e lo spostamento di ogni monomero gp120. Questo sembra essere accoppiato con un riarrangiamento della regione gp41 lungo l'asse centrale del trimero, portando a più vicino contatto tra le membrane delle cellule bersaglio e virali. I nostri risultati delucidare la struttura e i cambiamenti conformazionali di trimeric HIV-1 gp120 pertinenti alla neutralizzazione dell'anticorpo e l'attaccamento alle cellule bersaglio.
Architetture Molecolari Di Glicoproteine Busta Trimeric SIV E HIV-1 Su Virus Intatto: Ceppo-dipendente Dalla Variazione Nella Struttura Quaternaria
Il passo iniziale per infezione delle cellule bersaglio da umani e il virus dell'immunodeficienza delle scimmie strettamente correlate (HIV e SIV, rispettivamente) si verifica con l'associazione di glicoproteine busta trimeric (Env), composto da eterodimeri della glicoproteina transmembrana virale (gp41) e superficie glicoproteina (gp120) a bersaglio le cellule T. Conoscenza della struttura molecolare di Env trimeric su virus intatto è importante per comprendere i meccanismi molecolari sottostanti le interazioni virus-cellula e per la progettazione di vaccini basati su immunogen efficaci combattere l'HIV/AIDS. Analisi precedenti di virioni di HIV-1 BaL intatte già hanno portato a strutture di Env trimeric in unliganded e CD4-liganded afferma a risoluzione Å ~ 20. Qui, ci mostra che le architetture molecolari di Env trimeric da SIVmneE11S, SIVmac239 e l'HIV-1 R3A ceppi sono strettamente paragonabili a quella determinata in precedenza per BaL di HIV-1, con la V1 e V2 cicli variabile si trovano all'apice del picco, vicino alla zona di contatto tra virus e cellula. La posizione delle anse V1/V2 in Env trimeric fu definitivamente confermata dall'analisi strutturale dei virioni di HIV-1 R3A ingegnerizzato di Env espressa con eliminazione di questi cicli. Sorprendentemente, in SIV CP-MAC, un ceppo di CD4-indipendente, Env trimeric è in una conformazione costitutivamente "aperta" con gp120 trimeri strombate in una conformazione simile a quello visto per Env di HIV-1 BaL quando è complessato con sCD4 e il CD4i anticorpo 17b. I nostri risultati suggeriscono una spiegazione strutturale per il meccanismo molecolare di entrata virale CD4-indipendente e ulteriormente stabilire che tomografia del cryo-elettrone può essere utilizzata per scoprire distinte, funzionalmente rilevanti strutture quaternarie di Env visualizzati su virus intatto.
Densità Laterale Delle Matrici Del Ricevitore Nel Piano Della Membrana Influenza Sensibilità Della Risposta Chemiotassi E. Coli
Nei batteri chemiotattiche, chemocettori transmembrane, CheA e masticare formano il nucleo segnalazione complesso dell'apparato sensoriale di chemiotassi. Questi complessi sono organizzati in array esteso nella membrana citoplasmatica che permettere che i batteri di rispondere ai cambiamenti nella concentrazione di ligandi extracellulari tramite una cooperativa, allosterica risposta che conduce alla notevole amplificazione del segnale indotto dal legame del ligando. Qui, abbiamo abbinato studi tomografici cryo-elettrone dell'architettura spaziale 3D di matrici chemoreceptor nelle cellule intatte e. coli con la modellazione computazionale per sviluppare un modello predittivo per la cooperatività e la sensibilità della risposta chemiotassi. Le previsioni sono state testate sperimentalmente utilizzando la microscopia di fluorescenza resonance energy transfer (FRET). I nostri risultati dimostrano che cambiamenti nella densità di compressione laterale del parzialmente ordinato, spazialmente estesi matrici chemoreceptor possono modulare la risposta di chemiotassi batterica, e che le informazioni relative all'organizzazione molecolare delle matrici derivate da tomografia cryo-elettrone delle cellule intatte possono essere tradotte in modelli computazionali testabile, predittivi della risposta chemiotassi.
Trimeric HIV-1 Glicoproteina Gp140 Immunogeni E Nativo Dell'HIV-1 Busta Glicoproteine Visualizza Lo Stesso Chiuso E Aperto Quaternarie Architetture Molecolari
Il primo passo nell'infezione da HIV-1 si verifica con l'associazione di superficie delle cellule CD4 a trimeric delle glicoproteine busta HIV-1 (Env), un eterodimero di una glicoproteina transmembrana (gp41) e una superficie glicoproteina (gp120). Il design delle versioni solubili di Env trimeric che visualizzano le proprietà strutturali e funzionali simili a quelli osservati sul virus intatto è altamente auspicabile dal punto di vista della progettazione immunogeni che potrebbero essere efficace come i vaccini contro l'HIV/AIDS. Mediante tomografia cryoelectron combinata con subvolume media, abbiamo analizzato la struttura dei trimeri gp140 SOSIP, che sono scissi, solubilizzato versioni del ectodomain di trimeric Env di HIV-1. Mostriamo che unliganded gp140 trimeri adottano una disposizione quaternaria simile a quello visualizzato dal nativo unliganded trimeri sulla superficie dei virioni di HIV-1 intatti. Quando complessato con CD4 solubile, 17b Fab, che associa alla gp120 al suo sito di legame delle chemochine coreceptor, o sia solubile CD4 e 17b Fab, trimeri gp140 visualizzano una conformazione aperta in cui c'è una rotazione verso l'esterno e lo spostamento di ogni protomer gp120. Dimostriamo che il regime molecolare di gp120 trimeri nelle conformazioni aperte e chiuse di trimero solubile sono le stesse di quelle osservate per gli stati aperti e chiusi, rispettivamente, di gp120 trimeric su intatti virioni di HIV-1 BaL, stabilendo che trimeri gp140 solubile possono essere progettati per imitare le transizioni strutturali quaternarie visualizzati dal nativo trimeric Env.
Strutture Tridimensionali Degli Stati Associati a CD4 Solubili Di Glicoproteine Di Busta Del Virus Dell'immunodeficienza Delle Scimmie Trimeric Determinate Mediante Tomografia Computerizzata Cryo-elettrone
Le punte di glicoproteina (Env) trimeric busta visualizzate sulla superficie del virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) e virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) virioni sono composte da tre eterodimeri di glicoproteine virali gp120 e gp41. Anche se il legame di gp120 di cellule CD4 superficiale e un recettore delle chemochine è noto per provocare alterazioni conformazionali gp120 e gp41, cambiamenti nella struttura quaternaria di trimero solo di recente sono state chiarite. Per isolare il BaL di HIV-1, CD4 attaccamento provoca un riarrangiamento colpisce il trimero da un "chiuso" ad una conformazione "aperta". L'effetto di CD4 su trimeri SIV, tuttavia, non è stata descritta. Utilizzando la tomografia cryo-elettrone, ora abbiamo determinato architetture molecolari del CD4 solubile (sCD4)-Stati di SIV Env trimeri per tre diversi ceppi (SIVmneE11S, SIVmac239 e SIV CP-MAC) legati. In netto contrasto con l'HIV-1 BaL, SIVmneE11S e SIVmac239 Env ha mostrato solo lievi cambiamenti conformazionali seguendo sCD4 associazione. In SIV CP-MAC, dove Env trimeric Visualizza una conformazione costitutivamente "aperta" simile a quello visto per Env di HIV-1 BaL nello stato sCD4-complessato, ci mostra che non ci sono cambiamenti significativi ulteriori nella conformazione dell'associazione del sCD4 o 7 3 anticorpo. Le mappe di densità mostrano anche che gli anticorpi 3 7 e 17b target epitopi su gp120 che sono su lati opposti del sito Associazione coreceptor. Questi risultati forniscono nuove intuizioni della diversità strutturale di SIV Env e mostrano che ci sono dipendenti dal ceppo variazioni nell'orientamento di sCD4 associato a trimeric SIV Env.
Separazione Computazionale Di Eterogeneità Conformazionale Mediante Tomografia Cryo-elettrone E Sub-volume 3D in Media
In precedenza abbiamo usato tomografia cryo-elettrone, combinata con una media di sub-volume e classificazione per ottenere strutture 3D delle assemblee macromolecolare in casi dove era presente una sola specie dominante e applicato questi metodi per l'analisi di una varietà di trimeric HIV-1 e SIV busta glicoproteine (Env). Qui, noi estendere questi studi dimostrando automatizzati, iterativi, manca di metodi di allineamento e classificazione Cuneo-correzione immagine 3D per distinguere molteplici conformazioni che sono presenti contemporaneamente. Vi presentiamo un metodo per misurare la distribuzione spaziale degli elementi vettoriali che rappresentano stati conformazionali distinti di Env. Noi identificare strategie di elaborazione dei dati che permettono di chiare separazione di precedentemente caratterizzato chiuso e aprire conformazioni, come pure unliganded e anticorpo-liganded stati di Env quando sono presentano in miscele. Mostriamo identificazione e rimozione di picchi con il più basso rapporto segnale-rumore migliora l'accuratezza complessiva di allineamento tra i singoli sub-volumi Env, che tale precisione di allineamento, a sua volta, determina il successo di classificazione di immagine nel valutare conformazionali eterogeneità nei miscugli eterogenei. Noi convalidare queste procedure per separazione computazionale con successo separando e ricostruendo distinte strutture 3D per unliganded e anticorpo-liganded, come pure le conformazioni aperte e chiuse di Env presenti simultaneamente in miscele.
