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Articles by Mario J. Borgnia in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Determinación de estructuras moleculares de glicoproteínas de la envoltura del VIH con Cryo-tomografía electrónica y automatizada promedio Sub-tomografía
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9University of Notre Dame, 10Washington University in St. Louis, 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
El protocolo describe un método de alto rendimiento para la determinación de estructuras de proteínas de membrana con la crio-tomografía electrónica y procesamiento de imágenes 3D. Que cubre los detalles de la preparación de muestras, la recopilación de datos, procesamiento e interpretación de datos, y concluye con la producción de un objetivo representante para la aproximación, la pandemia del VIH-1 glicoproteína de la envoltura. Estos procedimientos de cálculo han sido diseñados de una manera que permite a los investigadores y estudiantes para trabajar a distancia y contribuir al tratamiento de los datos y el análisis estructural.
Other articles by Mario J. Borgnia on PubMed
Un Método De Ajuste Básico Ponderado Para El Atraque De Las Estructuras Atómicas En Mapas De Baja Resolución: Aplicación a La Crio-microscopía Electrónica
Crio-microscopía electrónica de "partículas individuales" es un poderoso método para analizar las estructuras de las asambleas macromoleculares de gran tamaño que no son susceptibles de investigación por parte de los métodos tradicionales de cristalografía de rayos-X. Un paso clave en estos estudios es la obtención de las interpretaciones de los complejos atómicos multiproteicos mediante el ajuste de las estructuras atómicas de los componentes individuales en mapas obtenidos a partir de los datos electrónicos microscópicos. Aquí, nos informe el uso de un "núcleo de ponderación" método, combinado con una rejilla-threading de Monte Carlo (GTMC) enfoque para este propósito. El "núcleo" de una estructura individual se define para representar a la parte donde la distribución de la densidad es de al menos probabilidades de ser alterada por otros componentes que conforman el conjunto de macromoléculas de interés. El rendimiento del método ha sido evaluado por su capacidad para determinar el ajuste correcto de (i) la cadena alfa del dominio del receptor de células T variable en un mapa simulado del complejo alphabeta a resoluciones de entre 5 y 40 A, y ( ii) el dominio catalítico E2 de la piruvato deshidrogenasa en un mapa determinado experimentalmente, a 14 A, resolución del complejo icosaédrica formada por 60 copias de esta enzima. Uso de las estructuras de rayos X de los dos casos de prueba como referencia, nos demuestran que, en contraste con los métodos más tradicionales, la combinación del método básico de ponderación y el enfoque de la red-threading de Monte Carlo puede identificar el tamaño correcto de forma fiable y rápida de los mapas de baja resolución que son típicas de las estructuras determinadas con el uso de una sola partícula microscopía electrónica.
Adquisición De Imágenes Y Tratamiento Automatizado De Uso De Una Nueva Generación De Cámaras 4K X 4K CCD De Cryo Estudios Con Microscopio Electrónico De Las Asambleas Macromoleculares
Hemos informado anteriormente el desarrollo de AutoEM, un paquete de software para la semi-automáticos de adquisición de datos de un microscopio electrónico de transmisión. Al continuar los esfuerzos para mejorar la velocidad de la determinación de la estructura de las asambleas macromoleculares mediante microscopía electrónica, se presenta aquí en la realización de una nueva generación de cámaras CCD de 4 K para su uso en aplicaciones de microscopía electrónica de crio. Se demuestra que a 120 kV, y con un aumento nominal de 67000 x, espectros de energía y de señal a ruido para la nueva cámara 4 K CCD son comparables a los valores obtenidos para las imágenes de película escaneadas usando un escáner Zeiss a resoluciones tan altas como aproximadamente 1/6.5A (-1). El área espécimen fotografiado para cada exposición en el CCD 4 K es aproximadamente un tercio del área que puede ser grabado con una exposición similar en la película. La cámara CCD también sirve al propósito de la grabación de imágenes a bajo aumento desde el centro del agujero para medir el espesor del hielo vitrificado en el agujero. El rendimiento de la cámara es satisfactorio en las condiciones de baja dosis utilizadas en crio microscopía electrónica, como se demuestra aquí por la determinación de un mapa tridimensional a 15 A para el núcleo catalítico del Bacillus stearothermophilus 1,8 MDa complejo icosaédrica piruvato deshidrogenasa, y su comparación con el modelo atómico ya se ha informado de esta compleja obtenida por cristalografía de rayos X.
Visualización De La Alfa-helicoidales Características En Un Mapa De Densidad Construido a Partir De 9 Imágenes Moleculares De La Core 1.8 MDa Icosaédrico De La Piruvato Deshidrogenasa
Estrategias para lograr las más altas resoluciones en las estructuras de complejos de proteínas determinadas por crio-microscopía electrónica en general, implican un promedio de la información de un gran número de imágenes individuales moleculares. Sin embargo, importantes limitaciones se plantean por la heterogeneidad en la calidad de imagen y en la conformación de proteínas que son inherentes a grandes conjuntos de datos de imágenes. Aquí, nos demuestran que la combinación de refinamiento iterativo y la clasificación molecular estricto es un método eficaz para lograr mejoras sustanciales en la calidad del mapa de la base 1.8 MDa icosaédrica catalítica del complejo piruvato deshidrogenasa de Bacillus stearothermophilus. De un conjunto inicial de 42,945 imágenes del complejo núcleo, nos muestran que el uso de sólo los mejores 139 partículas en el conjunto de datos produce un mapa que es superior a las construidas con un mayor número de imágenes, y que la ubicación de muchos de los alfa- hélices en la estructura puede ser visualizada de forma inequívoca en un mapa construido a partir de tan sólo 9 partículas.
Estructura Molecular De Un 9-MDA Subcomplejo Icosaédrico Piruvato Deshidrogenasa Que Contiene Las Enzimas E2 Y E3 Mediante Microscopía Criomicroscopía Electrónica
Los complejos piruvato deshidrogenasa multienzimáticos se encuentran entre las más grandes máquinas multifuncionales catalíticos en las células, que cataliza la producción de acetil-CoA a partir del piruvato. Hemos informado anteriormente de la arquitectura molecular de un subcomplejo 11-MDA que comprende la dihidrolipoil 60-mer icosaédrica acetiltransferasa (E2), decorado con 60 copias de la heterotetrameric (alfa (2) beta (2)) 153-kDa piruvato descarboxilasa (E1) de Bacillus stearothermophilus (Milne, JLS, Shi, D. Rosenthal, PB, Sunshine, JS, Domingo, GJ, Wu, X., Brooks, BR, Perham, RN, Henderson, R., y Subramaniam, S. (2002) EMBO J. 21, 5587-5598). Un espacio anular de aproximadamente 90 Un separa los dominios catalíticos de la acetiltransferasa E2 de una capa exterior formada de tetrámeros E1. Usando microscopía criomicroscopía electrónica, presentamos aquí una reconstrucción tridimensional del núcleo E2 decorado con 60 copias de la homodimérica 100-kDa dihidrolipoil deshidrogenasa (E3). El complejo E2E3 tiene una brecha similar anular de aproximadamente 75 A entre el conjunto interior icosaédrica de dominios acetiltransferasa y la carcasa exterior de homodímeros E3. Accesorio automatizado de las coordenadas E3 en el mapa sugiere correspondencia excelente entre la densidad de la hoja de cubierta exterior y las posiciones de los mejores dos orientaciones de montaje del E3. Como en el caso de E1 en el complejo E1E2, la central de 2-pliegue eje del homodímero E3 es aproximadamente orientadas a lo largo de la periferia de la carcasa, haciendo que los sitios activos de la enzima accesible desde el espacio anular entre el núcleo E2 y exterior del concha. Las similitudes en la arquitectura de los E1E2 y E2E3 complejos indican similitudes fundamentales en el mecanismo de acoplamiento sitio activo involucrado en las dos etapas clave que requieren el movimiento oscilante del dominio lipoil a través del espacio anular, es decir, la síntesis de acetil-CoA y la regeneración del anillo ditiolano del dominio lipoil.
Las Imágenes Tridimensionales De La Arquitectura De Alta Inclinación De Bacteriovorus Bdellovibrio Mediante Tomografía Crioelectrónica
Bdellovibrio bacteriovorus células son pequeñas células deltaproteobacterial que se alimentan de otras bacterias gram-negativas, incluyendo patógenos humanos. Utilizando la crio-tomografía electrónica, hemos demostrado que las células B. bacteriovorus son capaces de flexibilidad sustancial y deformación local de las membranas exteriores e interiores sin pérdida de la integridad celular. Estos cambios en la forma puede ocurrir en menos de 2 minutos, y el análisis de la arquitectura interna de células altamente dobladas mostró que la distribución general de máquinas moleculares y el nucleoide es similar a la de las células moderadamente dobladas. Células de B. bacteriovorus parecen contener una amplia red interna de estructuras filamentosas cortas y largas. Proponemos que reordenamientos de estas estructuras, en combinación con las propiedades únicas de la envoltura celular, puede ser la base de la notable capacidad de células de B. bacteriovorus para encontrar y entrar presa bacteriana.
Evaluación De Algoritmos De Eliminación De Ruido Para Biológica Tomografía Electrónica
Las tomografías de las muestras biológicas obtenidas utilizando microscopía electrónica de transmisión puede ser intrínsecamente ruidosa debido a la utilización de dosis bajas de electrones, la presencia de una "cuña perdido" en la mayoría de los sistemas de recogida de datos, y las inexactitudes que surgen durante la reconstrucción del volumen 3D. Antes tomogramas puede interpretarse de forma fiable, por ejemplo, por segmentación 3D, es esencial que los datos de forma adecuada denoised utilizando procedimientos que pueden ser individualmente optimizadas para conjuntos de datos específicos. En este sentido, poner en práctica un procedimiento sistemático para comparar diferentes técnicas de eliminación de ruido no lineales en las tomografías registrados a temperatura ambiente ya temperaturas criogénicas, y establecer criterios cuantitativos para seleccionar un enfoque de eliminación de ruido que es más relevante para una tomografía dado. Se demuestra que el uso de un algoritmo de eliminación de ruido adecuada facilita la segmentación robusta de tomografías de los macrófagos infectados por el VIH y bacterias Bdellovibrio obtenidos de las muestras a temperatura ambiente y criogénicos, respectivamente. Nos validar esta estrategia de segmentación automatizada de tomografías de manera óptima denoised comparando su rendimiento con la extracción manual de las características clave de las tomografías mismos.
Arquitectura Molecular De Los Nativos Del VIH-1 Gp120 Trímeros
Las glicoproteínas de la envoltura (Env) de virus de la inmunodeficiencia humana y de simio (VIH y VIS, respectivamente) median la unión del virus a las células CD4 del receptor de superficie celular en las células diana para iniciar la infección. Env es un heterodímero de una glicoproteína transmembrana (gp41) y una glicoproteína de superficie (gp120), y forma trímeros en la superficie de la membrana viral. Utilizando la crio-tomografía electrónica combinada con la clasificación de la imagen tridimensional y promediado, se presenta las estructuras tridimensionales de trimérica Env nativo mostrado en VIH-1 en el estado unliganded, en el complejo con los anticuerpos ampliamente neutralizantes b12 y en un complejo ternario con CD4 y el anticuerpo 17b. Mediante el ajuste de las estructuras cristalinas conocidas de la gp120 monoméricas central en la conformación b12 y CD4/17b-bound en los mapas de densidad obtenidas por tomografía electrónica, que se derivan de modelos moleculares para el nativo de la gp120 del VIH-1 en los Estados trímero unliganded y CD4 determinado con el . Se demuestra que las células CD4 unión provoca una gran reorganización de la trímero Env, provocando una rotación externa y el desplazamiento de cada monómero gp120. Esto parece ser acoplado con un reordenamiento de la región gp41 lo largo del eje central del trímero, dando lugar a un contacto más estrecho entre las membranas celulares virales y de destino. Nuestros resultados dilucidar los cambios en la estructura y conformación de trimérica gp120 del VIH-1 correspondiente a la neutralización de anticuerpos y adhesión a las células diana.
Arquitecturas Moleculares De Trimérica SIV Y El VIH-1 Sobre Las Glicoproteínas De Virus Intactos: La Cepa-dependiente De Variación En La Estructura Cuaternaria
El paso inicial en la infección de células objetivo por humano, y los estrechamente relacionados con los virus de inmunodeficiencia de simios (VIH y VIS, respectivamente) se produce con la unión de glicoproteínas de la envoltura triméricas (ENV), compuesta de heterodímeros de la glicoproteína transmembrana viral (gp41) y glicoproteína de superficie (gp120) para orientar las células T. El conocimiento de la estructura molecular de trimérica Env el virus intactos es importante tanto para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la interacción virus-célula y para el diseño de eficaces basados en inmunógeno las vacunas para combatir el VIH / SIDA. Previo análisis de VIH-1 intactas viriones Bal ya han dado lugar a estructuras de trimérica Env en los estados unliganded y CD4 liganded-en ~ 20 Å de resolución. Aquí, se muestra que las arquitecturas moleculares de trimérica Env de SIVmneE11S, SIVmac239 y el VIH-1 cepas R3A están estrechamente comparable a la que previamente determinada para el VIH-1 Bal, con la variable V1 y V2 bucles situados en el ápice de la espiga, cerca a la zona de contacto entre el virus y de células. La ubicación de los bucles en V1/V2 trimérica Env fue confirmada definitivamente por análisis estructural de VIH-1 viriones R3A ingeniería genética para expresar Env con supresión de estos bucles. Sorprendentemente, en SIV CP-MAC, una cepa de células CD4-independiente, trimérica Env es en un constitutivamente "abierta" conformación con gp120 trímeros abocinadas hacia fuera en una conformación similar a la observada para el VIH-1 Env BaL cuando se compleja con sCD4 y el CD4i 17b anticuerpos. Nuestros hallazgos sugieren una explicación estructural para el mecanismo molecular de las células CD4-independiente de la entrada del virus y establecer además que la crio-tomografía electrónica se puede utilizar para descubrir distintas, funcionalmente las estructuras pertinentes cuaternarios de Env se muestran en los virus intactos.
Densidad Lateral De Matrices Del Receptor En El Plano De La Membrana Influye En La Sensibilidad De La Respuesta De La Quimiotaxis De E. Coli
En las bacterias quimiotácticas, quimiorreceptores transmembrana, Chea y Chew formar el complejo central de señalización del aparato sensorial quimiotaxis. Estos complejos se organizan en matrices extendidos en la membrana citoplasmática que permitir que las bacterias para responder a cambios en la concentración de ligandos extracelulares a través de una respuesta cooperativa, alostérica que conduce a la amplificación sustancial de la señal inducida por la unión del ligando. Aquí, hemos combinado la crio-electrónica de estudios tomográficos de la arquitectura espacial en 3D de las matrices de quimiorreceptoras intactas en células de E. coli con el modelado computacional para desarrollar un modelo predictivo de la cooperatividad y la sensibilidad de la respuesta de la quimiotaxis. Las predicciones fueron probados experimentalmente, mediante la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) microscopía. Nuestros resultados demuestran que los cambios en la densidad de embalaje laterales de la parcialmente ordenado, las matrices quimiorreceptoras espacialmente extendidos pueden modular la respuesta quimiotaxis bacteriana, y que la información acerca de la organización molecular de los arreglos derivados de la crio-tomografía electrónica de células intactas se puede traducir en comprobables, modelos predictivos de cálculo de la respuesta quimiotaxis.
Trimérica Del VIH-1 Glicoproteína Gp140 Inmunógenos Nativos Y Glucoproteínas Del VIH-1 Sobre De Mostrar La Misma Abiertas Y Cerradas Arquitecturas Moleculares Del Cuaternario
El paso inicial en la infección por VIH-1 se produce con la unión de CD4 de la superficie celular a triméricas glucoproteínas del VIH-1 envoltura (ENV), un heterodímero de una glicoproteína transmembrana (gp41) y una glicoproteína de superficie (gp120). El diseño de las versiones solubles de trimérica Env que mostrar las propiedades estructurales y funcionales similares a los observados en los virus intactos es muy deseable desde el punto de vista de diseñar inmunógenos que podrían ser eficaces como vacunas contra el VIH / SIDA. Usando la tomografía criomicroscopía electrónica combinada con un promedio de volumen secundario, hemos analizado la estructura de la gp140 SOSIP trímeros, que son versiones troceados, solubilizados de la ectodominio de trimérica Env del VIH-1. Se demuestra que unliganded gp140 trímeros adoptar una disposición similar a cuaternario que aparece por nativos trímeros unliganded en la superficie de intactas VIH-1 viriones. Cuando complejado con CD4 soluble, Fab 17b, que se une a la gp120 en su sitio correceptor quimioquinas unión, o ambos CD4 soluble y Fab 17b, la gp140 trímeros mostrar una conformación abierta en la que hay una rotación hacia afuera y el desplazamiento de cada protómero gp120. Se demuestra que los mecanismos moleculares de gp120 trímeros en las conformaciones cerradas y abiertas del trímero solubles son los mismos que los observados para los estados abiertos y cerrados, respectivamente, de la gp120 trimérica sobre intactas viriones de VIH-1 BAL, se establece que los solubles gp140 trímeros puede ser diseñado para simular las transiciones cuaternario estructurales de trimérica nativo Env.
Estructuras Tridimensionales De Células CD4 Solubles Con Destino Estados Trimérica De La Inmunodeficiencia Símica Las Glicoproteínas Del Virus De Sobres Determinó Mediante El Uso De Cryo-tomografía Electrónica
Los triméricas envoltura glicoproteína (Env) espigas muestra en las superficies de virus de inmunodeficiencia de simios (SIV) y virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) viriones se componen de tres heterodímeros de las glicoproteínas virales gp120 y gp41. Aunque la unión de gp120 a CD4 de la superficie celular y un receptor de quimioquinas se conoce para provocar cambios conformacionales en la gp120 y gp41, cambios en la estructura cuaternaria de la trímero sólo recientemente se han dilucidado. Para el VIH-1 BaL aislar, los resultados de CD4 de fijación en una reordenación notable de la trimer de una "cerrada" a una "abierta" la conformación. El efecto de CD4 en trímeros SIV, sin embargo, no se ha descrito. Uso de la crio-tomografía electrónica, hemos determinado arquitecturas moleculares de los CD4 soluble (sCD4) enlazados a los estados de SIV trímeros Env para tres cepas diferentes (SIVmneE11S, SIVmac239, y SIV CP-MAC). En marcado contraste con el VIH-1 Bal, SIVmneE11S y Env SIVmac239 mostró cambios conformacionales de poca importancia después de sCD4 vinculante. En SIV CP-MAC, donde trimérica Env muestra un constitutivamente "abierta" la conformación similar a la observada para el VIH-1 Env BaL en el estado sCD4 de complejo, nos muestran que no hay cambios significativos en la conformación de más sobre el enlace de cualquiera de las sCD4 o 7D3 anticuerpo. Los mapas también muestran que la densidad de epítopos anticuerpos 7D3 y 17b de destino en la gp120 que se encuentran en lados opuestos del sitio co-receptor vinculante. Estos resultados aportan nuevos conocimientos sobre la diversidad estructural de SIV Env y demostrar que hay tensión dependientes de las variaciones en la orientación de sCD4 obligados a trimérica Env SIV.
Separación Computacional De La Heterogeneidad Conformacional Usando Cryo-tomografía Electrónica Y 3D Volumen Sub-Promedio
Hemos utilizado anteriormente crio-tomografía electrónica combinada con sub-volumen promediado y clasificación para obtener estructuras 3D de ensamblados macromoleculares en los casos en que una especie dominante individuales estaba presente, y aplica estos métodos para el análisis de una variedad de trimérica VIH-1 y SIV glicoproteínas de la envoltura (env). En este sentido, extender estos estudios al demostrar automatizado y repetitivo, la falta de cuña corregir la alineación de imágenes en 3D y los métodos de clasificación para distinguir múltiples conformaciones que están presentes de forma simultánea. Se presenta un método para medir la distribución espacial de los elementos vectoriales que representan distintos estados conformacionales de Env. Identificamos las estrategias de procesamiento de datos que permiten una separación clara de las conformaciones previamente caracterizadas cerrados y abiertos, así como los estados y el anticuerpo unliganded liganded de Env-cuando están presentes en las mezclas. Se demuestra que la identificación y eliminación de los picos más bajos con los de señal a ruido mejora la precisión global de armonización entre los distintos Env sub-volúmenes, y que la exactitud de la alineación, a su vez, determina el éxito de la clasificación de imágenes en la evaluación de la heterogeneidad conformacional en mezclas heterogéneas . Nos validar estos procedimientos para la separación de cómputo con éxito la separación y reconstrucción de las distintas estructuras en 3D de las conformaciones unliganded y el anticuerpo liganded, así como apertura y cierre de Env presentar simultáneamente en las mezclas.
