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Articles by Mario Brameshuber in JoVE
JoVE General
マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出
Institute of Biophysics, Johannes Kepler Universitat Linz
このビデオでは、マイクロパターン化表面を使用することにより、タンパク質 - タンパク質相互作用のその後の分析と実験を示しています。アプローチは、生きた細胞でタンパク質間相互作用を検出する可能性を提供し、定量的な情報を抽出する可能性が高いスループット能力を兼ね備えています。
Other articles by Mario Brameshuber on PubMed
生細胞におけるタンパク質 - タンパク質相互作用の定量的分析のためのマイクロパターニング
我々は、蛍光標識タンパク質（ '獲物'）、ライブ、哺乳動物細胞における膜タンパク質（ '餌'）の間の相互作用を識別し、特徴付けるための方法を提示する。細胞は、餌の細胞外ドメインに対する抗体で官能マイクロパターン表面上にメッキされています。餌 - 捕食相互作用は、蛍光獲物の再分配を通して測定しています。我々は、ヒトCD4 T細胞活性化におけるコレセプターメジャー、およびLckが人間の、初期のT細胞のシグナル伝達に必須のタンパク質チロシンキナーゼとの間の相互作用を特徴付けるための方法を使用していました。我々は、CD4の微細パターンへの再分配Lckを定量化することによって均衡の関連付けを測定し、実験と単一分子イメージングを光退色による相互作用のダイナミクスを調べた。既知の亜鉛クラスプの構造に加えて、特に膜アンカーLckが直接結合し、さらにドメインLckの他の相互作用を安定化を媒介する、Lckが-CD4の相互作用に大きな影響を与えた。合計では、膜の停泊は2桁の相互作用の寿命を増加させた。
プラズマ膜の流動性は、後続の取り込みのためにエンドサイトーシス々な機能が使用できるように酸化リン脂質の過渡固定化に影響を与える
血清中の酸化リン脂質はアテローム発生の過程で深刻な病態生理学的応答を開始します。細胞レベルではこれらの脂質は、アポトーシスを誘導することが知られていますが、取り込み機構は謎のままです。ここでは蛍光酸化リン脂質のさまざまな細胞株の細胞膜の1 - パルミトイル-2 - グルタロイル-sn-グリセロ-3 - ホスホ-N-Alexa647-エタノールアミン（PGPE-Alexa647）の振る舞いを調べた。プローブは、カベオラやクラスリン被覆ピットを介した非特異的に細胞に取り込まれました。我々は、細胞膜にPGPE-Alexa647の急速な普及を観察し、興味深いことに、我々は、スカベンジャー受容体クラスBタイプI超高感度の顕微鏡の過剰発現によって促進されるの取り込みは、私たちは単一分子レベルでの取り込みプロセスに従うことを許されました、エンドサイトーシスのサイトで約0.9秒の期間の一時的停止したことによって中断されました。スカベンジャー受容体クラスBタイプIの過剰発現は、単一分子の移動度の顕著な増加をもたらした、と固定化の結果で増加した周波数。また、細胞膜の流動性は、非標識の酸化リン脂質1-パルミトイル-2 - グルタロイル-sn-グリセロ-3 - ホスホコリンの高いレベルで細胞を処理することによって増加させることができ、この場合も、PGPE-Alexa647の固定周波数であった付随して増加した。データは、酸化リン脂質の取り込みのために細胞膜特性の妥当性を実証し、エンドサイトーシスを制御するための新たな間接的なメカニズムを示しています。
上皮内TCR-ペプチド-MHCの相互作用は加速動力学と親和性の増加を表示する
Tリンパ球による外来抗原の認識は、ほとんどの適応免疫応答に不可欠である。それは他の細胞上の抗原ペプチド主要組織適合遺伝子複合体（pMHC）分子に結合する特異的T細胞抗原受容体（TCR）によって駆動されます。生産性の高い場合は、これらの相互作用は、免疫学的シナプスの形成を促進する。ここでは、そのシナプスのTCR-pMHC結合ダイナミクスは溶液中でTCR-pMHCの結合とは大きく異なる表示されます。我々は単一分子顕微鏡、in situでTCR-pMHCの結合の動態を測定するために蛍光標識するTCRとその同族pMHCリガンドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を使用します。ソリューションの測定値と比較すると、この複合体の解離は、（4から12倍）が有意に増加した。アクチン重合体の破壊は細胞骨格のダイナミクスが直接または間接的にこの相互作用を不安定化することを示す、この効果を逆転させた。それにもかかわらず、pMHCためのTCRの親和性は、アソシエーション率の大きい（100倍程度）増加し、相補的な分子配向とクラスタリングの可能性が高い結果の結果として、大幅に上昇した。ヘルパーT細胞は、CD4分子は同じpMHC複合体をTCRと協調的に結合することが提案されている。しかし、CD4の封鎖は、シナプスTCRの親和性に影響を及ぼさなかった。また、TCR-pMHC複合体を不安定でしたが、TCRはCD4から独立してpMHC結合することを示しています。
生細胞形質膜中のタンパク質 - タンパク質相互作用の時間分解能
我々は最近、膜タンパク質（ "餌"）と直接生細胞形質膜（Schwarzenbacherら、Nature方法5:1053-1060、2008年に蛍光標識タンパク質（ "獲物"）との間の相互作用を定量化する方法を考案しました。）アイデアは、餌のexoplasmicドメインに対して、マイクロパターン化された抗体を含有する表面上の種子の細胞にあり、蛍光顕微鏡を介して蛍光獲物の共同パターニングを監視します。ここでは、マイクロバイオチップの上に細胞を播種時に餌と獲物微細形成の経時変化を特徴とする。パターンは表面と細胞の接触の直後に形成された。細胞は時間にわたり一定であった微細なコントラストを、影響を与えることなく、チップ表面上に移行することができました。単一細胞では、餌のコントラストが餌をから放出され、微細パターンで奪還できることを示し、変動の影響を受けるかもしれません。我々は相互作用の研究は、5分から数時間後播種までの任意の時間の時点で実行できることを結論付けている。時間との相互作用を監視することは簡単に議論のセクションでスケッチされた新しいアッセイの可能性を開きます。
ベイトパターニング時には獲物の再配布を定量することにより生細胞形質膜中のタンパク質 - タンパク質相互作用の検出
複雑な生物系の我々の理解は、タンパク質相互作用の並列化検出および定量化のための高品質なプロテオミクスツールに基づいています。現在のスクリーニング·プラットフォームは、しかし、in vivoの状況での協議が困難な結果をレンダリングではなく、人工的なシステムでタンパク質間相互作用の測定に依存しています。ここではデザインと蛍光標識タンパク質（ "獲物"）と、生きた細胞の膜タンパク質（ "餌"）との間の相互作用を検出し、定量化するシステムを構築するための詳細なプロトコルを記述します。細胞は餌exoplasmicドメインに対する抗体で官能マイクロパターン表面上にメッキされています。餌 - 捕食相互作用は、蛍光獲物の分配により分析されています。方法は、スクリーニングツールとしてそれが適用されながら、単一分子のレベル、弱い相互作用を検出する機能、高スループットに至るまで高感度が特徴である。概念実証は、CD4 T細胞のシグナル伝達の主要なコレセプター、およびLckが、初期のT細胞のシグナル伝達に必須のタンパク質チロシンキナーゼとの間の相互作用を実証しています。
コレステロールはサポートされている脂質二分子膜における酸化リン脂質の横方向の移動を遅くする
我々は、サポートされている脂質二重層の流動性、蛍光酸化リン脂質アナログ1-パルミトイル-2 - グルタロイル-sn-グリセロ-3 - ホスホ-N-Alexa647-エタノールアミンの相パーティショニング（PGPE-Alexa647）を検討した。従来のリン脂質dihexadecanoylphosphoethanolamine（DHPE）BODIPYに比べて我々は一貫して高い拡散定数を発見しました。動かない障害物が本質的にDHPE-BODIPYの拡散を阻止しますが、ほとんどPGPE-Alexa647の動きに影響を与えない二重層に挿入されたときの効果は劇的となりました。 1,2 - ジオレオイル-sn-グリセロ-3 - ホスホコリン（DOPC）で作られたサポートされている脂質二重層では、プローブの移動の違いは、増加、コレステロール含有量で横ばい。粗視化分子動力学シミュレーションを用いて、酸化リン脂質の極性基の位置の翻訳との併用、酸化リン脂質と膜マトリックスの間に増加した相互作用にこの効果を帰することもできます。ゼロコレステロール含量では、その極性基が外側にシフトされDOPC極性基領域の、コレステロール濃度を増加させる一方、二重層平面に極性基を取得します。
生細胞の形質膜のモバイル長期性Nanoplatformsのイメージング
細胞膜は "脂質ラフト"やの文脈で議論されるナノ脂質のプラットフォームが含まれていると仮定されている "膜ラフトを。"生化学的および細胞生物学研究に基づいて、ラフトは多くのシグナル伝達過程において重要な役割を果たすと考えられている。しかし、そのサイズ、形状、安定性、表面密度、組成、均質性に関する多くの情報は現在ありません。我々はここで初めて生細胞の形質膜に拡散いかだのような特性を持つナノスケールの寿命の長いプラットフォームのダイレクトイメージングを可能にする手法を提案する。我々の手法を感知秒の時間スケールで蛍光マーカータンパク質や脂質の特性セットをアセンブルするためにそれらのプロパティで、これらのプラットフォーム。特殊な光退色プロトコルは単一のスポットの明るさを変更することなく、よく隔離された回折限界のスポットのレベルに標識されたモバイルプラットフォームの面密度を低減するために使用されていました。プラットフォームごとのプローブ分子の統計的分布は、単一分子の明るさの分析によって決定した。デモでは、我々は液体秩序相にBODIPY-G（M1）、優先的にパーティションのコンセンサスラフトのマーカーグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型単量体GFP、蛍光脂質アナログを使用していました。両方のマーカーのために、私たちは、それによってこれらのプローブを含む、小型モバイル、寿命の長いプラットフォームの存在を実証し、静止状態で生きているCHOおよびJurkat T細胞の細胞膜にコレステロール依存性のホモ関連を発見した。我々はさらに発熱型熱ショック時の細胞膜の構造変化に対処するための技術を応用：高温で、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型単量体のGFPホモ協会は、小さな熱ショックタンパク質HSP27の発現の増加を伴って、消失した。
カチオン性両親媒性ペプチドは、真核生物宿主細胞の細胞膜にシアル化タンパク質と脂質を蓄積する
カチオン性抗菌性ペプチド（キャンプ）を選択負に帯電した脂質との静電相互作用によって細菌の膜をターゲットとしています。それは、ペプチド内に疎水基を組み込むことによって実現することができる、微生物の増殖の阻害のための高CAMP膜の濃度が必要であることが判明した。疎水性の増加、しかし、それによって有害な副作用の危険性を引き起こし、真核生物宿主細胞膜上の細菌のためのキャンプの選択を減らすことができます。本研究では、カチオン性両親媒性ペプチド-内の特定のリジンCAMP - ロイシン - リジン反復（と呼ばれるKLK）とは、真核生物膜内の分子の局在とダイナミクスをどのように影響するかを取り上げた。私たちはKLKが選択的に静電的に負に荷電したシアル酸残基と相互作用することにより、膜タンパク質や脂質のサブグループのエンドサイトーシスを阻害することがわかった。超微細構造のキャラクタリゼーションは、シアル酸、タンパク質や脂質が固定化された核分裂や核融合中間体を表す膜陥の形成を明らかにした。構造的に異なるカチオン性両親媒性ペプチドの実験（KLK、6-MO-LF11-322とNK14-2）は選択的にシアル酸膜成分を逮捕電と疎水性力の協力を示した。
動作時の膜脂質療法：改造プラズマ膜ラフトによってHSP共誘導BGP-15をアクティブにストレスシグナル伝達経路
老化および病態生理学的条件は、調節不全の熱ショックタンパク質（HSP）の発現を引き起こし、膜制御分子スイッチを調節する細胞膜の変化にリンクされています。彼らが優先的にストレスを受けた細胞に影響を与えそう主要な副作用を持っているのでそのようなBGP-15とHSPの共誘導ヒドロキシルアミンは、多くの疾患のための高度な治療薬候補を提供しています。試験管内分子動力学シミュレーションでは本研究では、脂質単分子膜と生体と超高感度蛍光顕微鏡での実験では、BGP-15を変化させるコレステロールに富む膜ドメインの組織することを示した。グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型単量体緑色蛍光タンパク質生チャイニーズハムスター卵巣（CHO）の拡散細胞の形質膜ラフトのマーカーを用いたナノスケールの寿命の長いプラットフォームのイメージングは、BGP-15は、発熱タイプの熱ストレスにより誘導されるラフトの一時的な構造の崩壊を防止することが明らかに。また、BGP-15は、これらの観察され、以前、以下の非致死的熱プライミングや膜応力を彷彿とさせる改造コレステロールに富む脂質プラットフォームすることができましたし、ストレス信号の生成と送信のために真正であることが示された。 B16-F10マウスメラノーマ細胞におけるHSP発現のBGP-15の活性化はコレステロールは膜にRac1の標的に影響を与えることが以前の観察に従って、Rac1のシグナル伝達カスケードを伴います。最後に、ヒト胚腎臓細胞株で我々はそれによって感電の要素を加熱するためのHSF1の結合の長期持続を促進し、BGP-15は、熱ストレスの初期段階で監視急速熱ショック因子1（HSF1）アセチル化を阻害することであることを示している。一緒に、我々の結果は、BGP-15は、加齢に伴う多くの様々なタンパク質折り畳みの病気と闘うための "膜脂質療法"で使用するための医薬品の新しいクラスになる可能性があることを示す。
単一分子顕微鏡を用いた生細胞の検出と生体協会の定量化
彼らのランダムな動きの間に、生体分子は一過性、そのパスを等位結合させる相互作用のマニホールドをご体験ください。それが直接生きている細胞のコンテキスト内でそのような結合事象を測定することは極めて困難である：相互作用が住んでいた、彼らは分子の少数分画に影響を与える可能性、またはそれらが肉眼的に観察可能な効果につながることはできません短いかもしれません。ここでは携帯電話の分子の関連付けを検出および定量を可能にする新しい単一分子イメージング法を説明します。 （TOCCSL） "の標識の保全化学量論ながら、クラスタを間引き"によって、我々は事実上、単一のクラスターの蛍光標識に影響を与えることなく、セルに直接プローブを希釈することができます。本質的に、解析領域が退色することによって細胞内に作成され、この領域は、アクティブ·プローブを欠いている。ブラウン拡散や他のトランスポートプロセスは、解析領域にアクティブ·プローブの突入につながる。リカバリ·プロセスの開始時に、単一のスポットがよくで区切られた、回折限界の信号として解決することができます。標準的な単一分子顕微鏡は、その組成、およびモビリティの面でのスポットを特徴付けるためになります。
