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Articles by Mario Brameshuber in JoVE
JoVE General
마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지
Institute of Biophysics, Johannes Kepler Universitat Linz
이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.
Other articles by Mario Brameshuber on PubMed
살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용의 정량 분석에 대 한 Micropatterning
식별 하 고 특성을 fluorophore 라는 단백질 ('먹이')와 라이브 포유류 세포에 있는 막 단백질 ('미끼') 간의 상호 작용 하는 방법을 소개 합니다. 셀 미끼 세포 외 도메인에 항 체와 functionalized micropatterned 표면에 도금 됩니다. 미끼 먹이 상호 작용 형광 먹이의 재분배를 통해 분석 됩니다. 인간의 CD4, T 세포 활성화의 주요 co-receptor 인간의 Lck, 초기 T 세포 시그널링을 위한 필수적인 단백질 tyrosine kinase의 상호작용 특성을 메서드를 사용 했습니다. 우리 Lck 재배포 CD4 micropatterns 측정 하 여 평형 단체를 측정 하 고 photobleaching 실험 및 단일 분자 이미징 하 여 상호 작용 역학을 공부 했다. 알려진된 아연 걸쇠 구조 뿐만 아니라 Lck 막 앵커 특히 직접 바인딩 및 추가 다른 Lck 도메인 상호 작용을 안정 시키는 중재 Lck CD4 상호 작용에 큰 영향을 주었다. 총, 멤브레인 앵커리지 상호 작용 수명 두 배나 증가.
플라즈마 멤브레인 유동성 후속 통풍 관을 위한 Endocytotic 사이트에서 산화 인지질 과도 Immobilization에 영향을 줍니다
혈 청에 산화 인지질 atherogenesis의 과정에서 심한 pathophysiological 응답을 시작합니다. 세포 수준에서 이러한 지질; apoptosis 유도 알려져 있다 그러나, 통풍 관 메커니즘 수수께끼의 남아 있습니다. 우리 여기의 동작 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine 형광 산화 인지질 (PGPE-Alexa647) 다양 한 세포의 원형질 막에 조사. 프로브는 대상이 caveolae 또는 구 덩이 clathrin 코팅을 통해 세포에 의해 채택 되었다. 흥미롭게도, 폐품 수용 체 클래스 B 타입 나 고감도 현미경; 단일 분자 수준에서 이해 과정에 따라 우리가 overexpression에 의해 촉진에 글귀를 찾았습니다. 우리가 관찰 기간이 약 0.9의 일시적인 중단에 의해 중단 플라즈마 멤브레인 PGPE alexa647의 급속 한 보급에 스 endocytotic 사이트에서. 폐품 수용 체 클래스 B 타입 overexpression 나왔고 뚜렷한 증가 단일 분자 이동성 및 결과 immobilization 빈도가 증가 합니다. 또한, 플라즈마 막 유동성 또한 레이블이 없는 산화 인지질 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine; 높은 수준의 치료 세포에 의해 증가 수 있습니다. 이 경우 또한 PGPE Alexa647 immobilization 주파수 증가 concomitantly 했다. 데이터 산화 인지질의 통풍 관을 위한 플라즈마 멤브레인 속성의 관련성을 입증 하 고 endocytosis 제어를 위한 새로운 간접 메커니즘을 나타냅니다.
TCR-펩타이드-MHC 상호 작용 원래의 장소에 가속된 속도 론 및 선호도 증가 보여 줍니다
T 림프 톨에 의해 외국 항 원 인식 가장 적응 면역 반응에 필수적 이다. 다른 셀에 있는 분자 조직 항 원 펩 티 드-전공 적합성 복합물 (pMHC)에 바인딩 특정 T 세포 항 원 수용 (TCRs)에 의해 구동 됩니다. 경우 생산성, 이러한 상호 작용 면역 시 냅 스의 형성을 촉진 합니다. 여기 우리가 시 냅 스 TCR pMHC 바인딩 역학 솔루션에서 바인딩 TCR-Pmhc에서에서 크게 차이가 보여 줍니다. 단일 분자 현미경 및 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 사이 놓여있는지 태그 TCRs 및 그들의 동족 pMHC ligands TCR pMHC 바인딩 현장에서 속도 측정을 사용 했습니다. 솔루션 측정에 비해,이 복잡 한의 분리 현저 하 게 증가 했다 (4-12 배). 중단 말라 고분자의 이러한 효과 직접 또는 간접적으로 cytoskeletal 역학이이 작용 불안정을 나타내는 반전. 그럼에도 불구 하 고, 협회 요금, 상호 보완적인 분자 방향 및 클러스터링의 가능성이 결과에 큰 결과 (약 약) 증가 함에 따라 Pmhc에 대 한 TCR 선호도 크게 상승 된 했다. 보조 T 세포의 CD4 분자 협력 복잡 한 동일한 pMHC TCR에 바인딩하려면 제안 되었습니다. 그러나, CD4 봉쇄 했다 시 냅 스 TCR 선호도에 영향을 주지도 않았다 그것은 TCR pMHC 단지, TCR 바인딩합니다 CD4 별도로 pMHC 나타내는 불안정.
라이브 세포 원형질 막에서 단백질 단백질 상호 작용의 시간적 해상도
우리가 최근에 막 단백질 ("미끼")와 라이브 세포 원형질 막에서 직접 fluorophore 표시 된 단백질 ("먹이") 간의 상호 작용을 측정 하는 방법을 고안 (Schwarzenbacher 외. 자연 방법 5:1053-1060 2008). 아이디어, 미끼의 exoplasmic 도메인에 대 한 항 체 마이크로 패턴을 포함 하는 표면에 시드 셀 이며 형광 현미경 검사 법을 통해 형광 먹이의 co-patterning를 모니터링. 여기, 우리가 미끼의 시간 과정 특징 및 micropattern 형성 마이크로 바이오 칩에 셀 시드를 따라 먹이. 패턴 셀 서피스와 접촉 직후 형성 되었다. 셀 시간 동안 일정 하 게 유지 하는 micropattern 대비에 영향을 주지 않고 칩 표면에 마이그레이션할 수 있었습니다. 단일 셀에 미끼 대비 미끼에서 발표 하는 micropatterns에 생포 나타내는 변동 될 수 있습니다. 우리는 어떤 시간 포인트에서에서까지 5 분 시드 몇 시간 게시물에서 상호 작용 연구를 수행할 수 있습니다 결론 지었다. 모니터링 시간 상호 토론 섹션에서 간단 하 게 스케치 된 새로운 분석 실험에 대 한 가능성을 엽니다.
미끼 Micropatterning 따라 먹이 재배포를 측정 하 여 살아있는 세포 원형질 막에 있는 단백질 단백질 상호 작용의 검출
복잡 한 생물 학적 시스템에 대 한 우리의 이해 병렬화 탐지 및 정량화 단백질 상호 작용의 높은 품질 proteomics 도구를 기반으로 합니다. 그러나 현재 상영 플랫폼, 단백질 상호 작용 결과 생체 조건 상황에 부여 하기 어려운 렌더링 오히려 인공 시스템에 측정에 의존. 여기 디자인과 감지 하 여 fluorophore 라는 단백질 ("먹이")와에서 살아있는 세포 막 단백질 ("미끼") 간의 상호 작용을 계량 시스템의 건설에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 셀 미끼 exoplasmic 도메인에 항 체와 functionalized micropatterned 표면에 도금 됩니다. 미끼 먹이 상호 작용 형광 먹이의 재분배를 통해 분석 됩니다. 메서드는 약한 상호 작용 및 해당 심사 도구로 만드는 높은 처리량을 감지 하는 기능이 단일 분자의 수준 높은 감도 의해 특징입니다. CD4, T-세포 신호에 주요 coreceptor Lck, 초기 T 세포 시그널링을 위한 필수적인 단백질 티로신 키 간의 상호 작용에 대 한 개념 증명을 보여 줍니다.
콜레스테롤 지원된 지질 Bilayer에 산화 인지질의 측면 이동 속도가 느려집니다
우리는 이동성 및 형광 산화 인지질 아날로그 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647)에서 지원 되는 지질 bilayers의 위상 분할 조사. 기존의 인지질 dihexadecanoylphosphoethanolamine (DHPE)에 비해-Bodipy 우리는 일관 되 게 더 높은 확산 상수를 발견. 움직이기 힘 드는 장애물 bilayer 본질적으로 DHPE Bodipy의 보급을 차단 하지만 거의 PGPE alexa647의 움직임에 영향을 하는에 삽입 된 때 효과 극적인 되었다. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)의 제작 지원된 지질 bilayer, 프로브 이동성의 차이 증가 콜레스테롤 콘텐츠로 평준화. 성긴 분자 역학 시뮬레이션을 사용 하 여 우리가 산화 인지질과 산화 인지질 headgroup 위치에 번역에 수 반하는 막 매트릭스 사이 증가 작용을이 효과 돌리다 수: 제로 콜레스테롤 내용에서 그것의 headgroup 이동 하 게 됩니다 DOPC headgroup 영역의 외부 bilayer 평면에는 headgroup를 끌어 콜레스테롤 농도 증가 하는 반면.
라이브 세포 원형질 막에서 모바일 수명이 긴 Nanoplatforms의 영상
플라즈마 멤브레인 포함 "지질 뗏목" 또는 "막 뗏목"의 맥락에서 설명 하는 전체 지질 플랫폼에 가설 되었습니다. 기반으로 생화학 및 세포 생물학 연구, 뗏목 많은 신호 과정에 중요 한 역할을 할 것으로 추정 된다. 그러나, 거기는 현재 없습니다 그들의 크기, 모양, 안정성, 표면 밀도, 조성, 및이 질에 대 한 많은 정보입니다. 선물이 여기 방법 처음으로 전체 직접 이미징 수명이 긴 플랫폼 라이브 세포 원형질 막에서 확산 뗏목 같은 속성을 가진. 우리의 방법은 초의 시간 간격에 형광 마커 단백질 이나 지질 특성 집합을 구성 하는 그들의 재산에 의해 이러한 플랫폼을 감지 한다. 특별 한 photobleaching 프로토콜을 단일 자리 밝기를 변경 하지 않고 잘 격리 된 회절 제한 된 관광 명소의 수준까지 레이블이 지정 된 모바일 플랫폼의 표면 밀도 줄이기 위해 사용 되었습니다. 플랫폼 당 프로브 분자의 통계 분포 단일 분자 밝기 분석에 의해 결정 되었다. 합의 뗏목 마커 사용 했습니다 데모 monomeric GFP glycosylphosphatidylinositol 고정 및 형광 지질으로 분할 우선적으로 아날로그 BODIPY-G(M1) 액체-주문 단계. 두 표식에 대 한 우리 생활의 원형질 막에서 콜레스테롤 종속 호모 협회를 발견 함으로써이 프로브를 포함 하는 작은, 모바일, 수명이 긴 플랫폼의 존재를 입증 하는 휴식 상태에서 조과 Jurkat T 세포. 우리는 더 열이 형 열 충격 중 플라즈마 멤브레인의 주소 구조 변화에 기술을 적용: 높은 온도에서 glycosylphosphatidylinositol 고정 monomeric GFP 호모-협회 사라졌다, 작은 열 충격 단백질 Hsp27 식의 증가 함께.
양이온 Amphipathic 펩 티 드 Sialylated 단백질 및 호스트 진 핵 세포의 원형질 막에 있는 지질 축적
부정 청구 지질과 정전기 상호 작용에 의해 선택적으로 대상 세균 세포 막으로 양이온 항균 성 펩 티 드 (캠프). 알고 보 니 높은 캠프 막 농도 미생물 성장의 억제에 대 한 필요, 그는 펩 티 드 내의 소수 그룹의 설립에 의해 실현 될 수 있다. 그러나 hydrophobicity를 증가 함으로써 해로운 부작용의 위험을 발생 하는 진 핵 호스트 세포 막에 세균에 대 한 캠프 선택도 감소. 이 연구에서 우리는 펩 티 드-에 특정 리 신 Lysine과 캠프 반복 (불린된 KLK) 어떻게 양이온 amphipathic를 해결-지역화와 진 핵 세포 막에 있는 분자의 역학에 영향을 줍니다. 선택적으로 electrostatically 부정 청구 sialic 산 moieties 상호 작용에 의해 막 단백질 및 지 질의 하위 그룹 endocytosis를 억제 하는 KLK를 찾았습니다. Ultrastructural 특성화 분열 또는 융합 중간체, sialylated 단백질 및 지질 움직일 했다 나타내는 막 invaginations의 형성을 공개 했다. 구조적으로 다른 양이온 amphipathic 펩 티 드 (KLK, 6-모-LF11-322, NK14-2)에 대 한 실험 표시 선택적으로 sialylated 멤브레인 성분 체포 정전기 및 소수 세력의 협력.
작업에서 막 지질 치료: 플라즈마 멤브레인 뗏목을 리 모델링 하 여 스트레스 신호 전달 경로 활성화 하는 HSP Co-inducer BGP-15
에이징 및 pathophysiological 조건 막 제어 분자 스위치, dysregulated 열 충격 단백질 (HSP) 식 일으키는 변조 막 변화에 연결 됩니다. HSP co-inducer hydroxylamines BGP 15 우선적으로 영향을 미치기 때문에, 많은 질병에 대 한 고급 치료 후보 세포 스트레스를 제공 하 고 하지 않을 수 있습니다와 같은 주요 부작용이 있다. 체 외 분자 동적 시뮬레이션에서 현재의 연구에서 지질 monolayers와 in vivo 磁 형광 현미경 실험 BGP 15 콜레스테롤이 풍부한 막 도메인의 조직 변경 보였다. 전체의 이미징 뗏목 마커 glycosylphosphatidylinositol 고정 monomeric 녹색 형광 단백질 라이브 중국 햄스터 난소 (조) 세포 원형질 막에서 확산을 사용 하 여 수명이 긴 플랫폼 시연 BGP 15 열이 형 열 스트레스에 의해 유도 된 뗏목의 일시적 구조 해체 방지. 또한, BGP 15 리 모델링 지질 콜레스테롤 풍부한 플랫폼 연상 그의 이전 비 치명적인 열 애 벌 칠 또는 막 스트레스에 따라 관찰 하 고 생성 및 스트레스 신호 전송에 대 한 의무 수 표시 했다 수 있었다. B16 F10 마우스 흑색 종 세포에 HSP 표현의 BGP 15 활성화 콜레스테롤 막 Rac1 대상으로 영향을 미치는 이전 관측에 따라 Rac1 신호 모두를 포함 한다. 마지막으로, BGP 15 억제 수 있다 시연 인간 배아 신장 세포 라인에 급속 한 열 충격 요소 1 (HSF1) acetylation 모니터링 함으로써 열 쇼크 요소에 바인딩 hsf1의 머리말 붙인된 기간 홍보 열 스트레스의 초기 단계. 함께 찍은 우리의 결과 나타냅니다 BGP 15는 '막 지질 치료'에 사용 하기 위해 의약품의 새로운 클래스 될 가능성이 많은 다양 한 단백질 misfolding 증 노화와 관련 된.
탐지 및 정량화 바이오 협회 생활 셀 단일 분자 현미경을 사용 하 여
그들의 임의 모션 동안 biomolecules 매니폴드 transiently 그들의 경로 결합 하는 상호 작용의 경험. 그것은 매우 어려운 살아있는 세포의 컨텍스트에서 직접 바인딩 이벤트 등을 측정: 상호 작용 짧은 살 았 수 있습니다, 그들은 분자의 소수 일부만 영향을 줄 수 또는 거시적 관찰할 수 있는 효과를 리드 하지 않을 수 있습니다. 여기 감지 및 모바일 분자의 측정 하는 새로운 단일 분자 이미징 방법을 설명 합니다. "라벨의 stoichiometry를 보존 하는 동안 클러스터 밖으로 숱 이"에 의해 (TOCCSL) 우리 사실상 희석 수 있습니다 셀에 직접 프로브 단일 클러스터의 형광 라벨에 영향을 주지 않고. Photobleaching; 하 여 셀 내에 분석 영역이 만들어진 기본적으로 이 지역은 액티브 프로브 없는 상태입니다. Brownian 보급 또는 다른 전송 프로세스 분석 영역에 액티브 프로브 재입국으로 이어질. 복구 프로세스의 발병에서 단일 관광 명소 well-separated, 회절 제한 신호로 해결할 수 있습니다. 표준 단일 분자 현미경 특성화 그들의 구성과 이동성 측면에서 관광 명소에 대 한 다음 수 있습니다.
