TATA-binding Protein-libre TAF Complexe Contenant (TFTC) Et P300 Sont Tous Deux Nécessaires Pour L'activation Transcriptionnelle Efficace

The Journal of Biological Chemistry. Sep, 2002  |  Pubmed ID: 12107188

Initiation de la transcription des gènes codant des protéines par l'ARN polymérase II a été pensé pour exiger facteur de transcription TFIID, un complexe comprenant la protéine de liaison TATA (TBP) et TBP-facteurs associés (TAF). En présence de TBP-libre TAF complexe (TFTC), l'initiation de la transcription de la polymérase II peut se produire en l'absence de TFIID. TFTC contient plusieurs sous-unités qui ont été montrés à jouer le rôle de co-activateurs transcriptionnels, y compris l'acétyltransférase GCN5 histone (THA), qui acétyle l'histone H3 dans un contexte nucléosomale. Ici, nous analysons la fonction coactivateur de TFTC. Nous montrons directes des interactions physiques entre TFTC et les deux régions distinctes d'activation (H1 et H2) du domaine d'activation VP16, tandis que les coactivateurs HAT contenant, p300/CBP (CREB-binding protein), interagir uniquement avec le sous-domaine H2 de VP16. En conséquence, des expériences de transfection de cellules de démontrer l'exigence à la fois p300 et TFTC pour l'activation transcriptionnelle maximale par le GAL-VP16. En accord avec cette conclusion, nous montrons que in vitro sur un modèle de médiation chromatinized TFTC l'homme de l'activité transcriptionnelle du domaine d'activation VP16 de concert avec p300 et d'une manière acétyl-CoA-dépendante. Ainsi, nos résultats suggèrent que ces deux-HAT contenant des co-activateurs, P300 et TFTC, ont des rôles complémentaires plutôt que redondants pendant le processus d'activation de la transcription.

Les Sous-unités Du Complexe Nouveaux TATA Protéine Libre De Transcription Liant TAFII Contenant Identifié Par Matrix-assisted Laser Desorption / Ionisation Temps De Spectrométrie De Masse Vol Après électrophorèse Sur Gel à Une Dimension

Proteomics. Feb, 2003  |  Pubmed ID: 12601814

Initiation de la transcription des gènes codant des protéines par l'ARN polymérase II a été pensé pour exiger que le facteur de transcription II D (TF (II) D), un complexe comprenant la TATA binding protein (TBP) et TBP-facteurs associés. Cependant, un autre complexe multiprotéique isolé, plus récemment, et a appelé TFTC (TBP-libre TAF (II) contenant le complexe), a été montré à la médiation d'initiation de l'ARN polymérase II (Pol II) la transcription en l'absence de TF (II) D ainsi que spécifique acétylation de l'histone H3 dans un contexte nucléosomale. Plusieurs sous-unités du complexe TFTC ont déjà été identifiés en utilisant des méthodes classiques telles que Edman base microséquençage et Western blot. Dans cet article nous présentons une approche basée sur la spectrométrie de masse protéomique pour confirmer les résultats précédents et d'identifier d'autres sous-unités possibles du complexe TFTC. Le complexe TFTC a été séparé sur une dimension du sulfate de sodium dodécyl polyacrylamide électrophorèse et analysés par désorption laser assistée par matrice / ionisation temps de spectrométrie de masse vol et empreinte de masse peptidique. Identifications ont été réalisées après des recherches de banque de données. Cette nouvelle caractérisation des TFTC complexe a confirmé la présence de sous-unités déjà décrites (TRRAP, GCN5, SAP130/KIA0017, TAF (II) 150, TAF (II) 135, TAF (II) 100, TAF (II) 80, TAF (II) 20, SPT3 et PAF65beta). En outre, une bonne couverture de ces séquences a été obtenu. Fait intéressant, TAF (II) 32 et PAF6alpha ont également été déterminés comme des sous-unités nouvelles potentielles de TFTC. Ces résultats montrent ensemble la pertinence et le grand potentiel de cette méthode et offrir de nouvelles perspectives dans les études fondamentales des complexes de facteurs de transcription.

Modifications Dynamiques Complexes De Facteurs De Transcription Pendant La Différentiation érythroïde Révélé Par La Protéomique Quantitative

Nature Structural & Molecular Biology. Jan, 2004  |  Pubmed ID: 14718926

Au cours de la différenciation érythroïde, l'expression du gène bêta-globine est régie par la région de contrôle locus (LCR). Le facteur de transcription se lie NF-E2p18/MafK dans cette région et est essentielle pour la bêta-globine expression dans murins érythroleucémie (MEL) des cellules. Ici, nous utilisons l'isotope-codé étiquette d'affinité (ICAT) technique de spectrométrie de masse quantitative pour comparer les protéines interagissant avec NF-E2p18/MafK cours de la différenciation. Nos résultats définissent en tant que molécule mafque une «double fonction» qui se déplace à partir d'une répression à un mode d'activation au cours de la différenciation érythroïde. L'échange de partenaire de dimérisation mafque de BACH1 à la norme NF-E2p45 est une étape clé dans le commutateur du refoulé à l'état actif. Ce changement est associé à des changements dans l'interaction de mafque avec des co-répresseurs et co-activateurs. Ainsi, nos résultats suggèrent que, en plus de son rôle comme un activateur agissant en cis l'expression des gènes bêta-globine dans les cellules érythroïdes différenciés, la LCR favorise également une répression active de la bêta-globine de transcription dans les cellules engagées avant la différenciation terminale.

Heme Réglemente L'échange Dynamique De BACH1 Et NF-E2-Facteurs Liés Au Réseau Maf Transcription Factor

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Feb, 2004  |  Pubmed ID: 14747657

Les petites protéines Maf servir de facteurs de transcription à double fonction par un échange de leurs partenaires hétérodimérisation. Par exemple, comme des hétérodimères avec hématopoïétique spécifique des cellules p45 NF-E2 ou NF-E2-facteurs liés à l'OTAN (NRF), ils activent la bêta-globine ou le stress antioxydant enzyme hème oxygénase-1 (HO-1) des gènes, respectivement. En revanche, en collaboration avec BACH1, ils répriment ces mêmes gènes. Cependant, les signaux conduisant à cet échange partenaire ne sont pas connus. Utilisant des essais immunoprécipitation de la chromatine dans les cellules NIH 3T3, nous montrons que l'hème, un inducteur de HO-1, favorise le déplacement de BACH1 des mafque occupés par HO-1 amplificateurs, qui est suivie par Nrf2 liaison à ces éléments. Alors que l'histone H3 sur les HO-1 des activateurs et promoteurs est hyperacetylated indépendamment de l'activité des gènes, l'exposition de cellules à des résultats en hème de novo hyperacétylation et hyperméthylation de l'histone H3 dans la région transcrite. Ces données indiquent que, dans des conditions normales, la structure de la chromatine de HO-1 est dans un état de pré-activation, mais la transcription est réprimée par BACH1. Heme induit la commutation de dimères Maf, résultant en ho-1 expression. Heme favorise également le déplacement de BACH1 de la région de la bêta-globine locus de contrôle sans affecter contraignant mafque dans les cellules murines érythroleucémie. Ainsi, les fonctions hème comme une molécule de signalisation pour l'expression des gènes chez les eucaryotes supérieurs.

Utilisation Des Isotopes Stables De L'étiquetage Et La Spectrométrie De Masse Pour Caractériser Les Complexes Protéiques Et Pour Détecter Des Changements Dans Leur Composition

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2007  |  Pubmed ID: 17484108

Un des principaux objectifs de la protéomique est la description de la composition, la dynamique, et les connexions des modules multiprotéiques qui catalysent une large gamme de fonctions biologiques dans les cellules. La spectrométrie de masse (MS) s'est avéré être un outil extrêmement puissant pour la caractérisation de la composition des complexes purifiés. Cependant, parce que MS n'est pas une technique quantitative, l'utilité des données est limitée. Par exemple, sans mesures quantitatives, il est difficile de détecter les changements dynamiques de la composition complexe, et il peut être difficile de distinguer de bonne foi des composants complexes de manière non spécifique copurifying protéines. Dans ce chapitre, nous décrivons une stratégie pour caractériser la composition des complexes de protéines et de leurs changements dynamiques dans la composition en combinant des approches de purification par affinité avec un marquage isotopique stable et MS. L'utilisation d'outils logiciels pour l'analyse statistique des données est également décrite.

Activateur Médiée Par Le Recrutement Du Complexe MLL2 Methyltransferase Au Locus Bêta-globine

Molecular Cell. Aug, 2007  |  Pubmed ID: 17707229

MLL-complexes contenant méthyler histone H3 lysine à 4 (H3K4) et ont été impliqués dans la régulation de la transcription. Cependant, il est difficile de savoir comment complexes MLL sont destinés à des loci génétiques spécifiques. Ici, nous montrons que les MLL2 associés complexes avec le système hématopoïétique activateur de NF-E2 dans les cellules érythroïdes et est important pour H3K4 triméthylation et les niveaux maximaux de la transcription au niveau du locus bêta-globine. En outre, le recrutement du complexe MLL2 au locus bêta-globine dépend NF-E2 et coïncide spatio-temporellement, à la norme NF-E2 contraignant au cours de la différenciation érythroïde. Ainsi, un activateur de l'ADN lié est important d'abord pour guider MLL2 à une localisation génomique particulière. Fait intéressant, alors que la sous-unité ASH2L MLL2-associé est limitée à la région de bêta-globine locus de contrôle 38 kb en amont de la version bêta (maj)-globine, les écarts de protéines à travers le locus MLL2 bêta-globine, suggérant un mécanisme précédemment non défini par ce qui un activateur de la transcription et influe H3K4 triméthylation à une distance.

Nucléosome Et Activateur De La Transcription De L'homme Au Antagonisme Sites Locus De Contrôle Région DNase I Bêta-globine Hypersensibles

Nucleic Acids Research. 2007  |  Pubmed ID: 17720709

Régions de contrôle de locus sont des éléments de réglementation qui activent des gènes lointaines et se composent généralement de plusieurs sites de DNase I hypersensibles qui coïncident avec les clusters de sites activateurs de transcription contraignantes. Pour ce qui nucléosomes mesure et des activateurs occupent ces sites ensemble ou a exclusivement pas été étudiés in vivo. Nous avons analysé la structure de la chromatine de l'homme des sites locus bêta-globine la région de contrôle hypersensibles à cellules érythroïdes exprimant des gènes de globine embryonnaire et fœtal. Nucléosomes ont été appauvri variable à des sites hypersensibles HS1-HS5 HS4 et au qui flanque l''5 du locus. Au lieu de nucléosomes, les activateurs étaient différentiellement associée à ces sites. Érythroïde-spécifique GATA-1 résidait à HS1, HS2 et HS4, mais la norme NF-E2 hétéro-dimère a été limitée à HS2 où nucléosomes ont été les plus gravement appauvri. Les histones H3 et H4 et H3 ont été hyperacetylated était di-méthylé en K4 à travers la LCR, cependant, le H3 K4 MLL composante méthyltransférase histone acétyltransférases Ash2L et CBP et p300 occupé essentiellement que HS2 et le motif NF-E2 dans HS2 a été exigé pour le recrutement Ash2L . Nos résultats indiquent que chaque site hypersensible à la bêta-globine humaine LCR a des caractéristiques structurelles distinctes et suggèrent que HS2 joue un rôle pivot dans l'organisation LCR au stade embryonnaire et fœtale de l'expression des gènes de globine.

P38 MAPK Réglemente Le Recrutement Des Ash2L Complexes Contenant Methyltransferase à Des Gènes Spécifiques Cours De La Différenciation

Nature Structural & Molecular Biology. Dec, 2007  |  Pubmed ID: 18026121

Cell-spécifiques des modes d'expression des gènes sont mis en place à travers les fonctions antagonistes du groupe trithorax (TrxG) et groupe Polycomb (PcG) protéines. Plusieurs gènes spécifiques du muscle a déjà été démontré à des fins de répression épigénétique marquée par PcG protéines dans les cellules progénitrices musculaires. Ici, nous démontrons que ces gènes régulés par le développement deviennent épigénétiquement marqué pour l'expression des gènes (triméthylée sur l'histone H3 lysine 4, H3K4me3) au cours de la différenciation musculaire par le biais de recrutement spécifique de Ash2L complexes contenant méthyltransférase. Le ciblage des Ash2L à des gènes spécifiques est médiée par le MEF2D régulateur transcriptionnel. En outre, cette interaction est modulée lors de la différenciation par l'activation de la voie p38 MAPK via la phosphorylation de MEF2D. Ainsi, nous apportons la preuve que les voies de signalisation de réglementer le ciblage des TrxG médiation modifications épigénétiques à des promoteurs spécifiques au cours de la différenciation cellulaire.

Analyse Des Modifications épigénétiques De La Chromatine à Des Loci Génétiques Spécifiques Par Immunoprécipitation De La Chromatine Native De Nucléosomes Isolé Par Chromatographie En Phase D'hydroxyapatite

Nature Protocols. 2008  |  Pubmed ID: 18323811

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est couramment utilisée pour examiner la modification épigénétique des histones au niveau des emplacements génomiques. Toutefois, des modifications covalentes de queues d'histones peuvent servir de sites d'amarrage pour la chromatine facteurs réglementaires. En tant que tel, l'association de ces facteurs de régulation avec la chromatine pourrait provoquer un encombrement stérique pour la reconnaissance d'anticorps, ce qui entraîne une sous-estimation de l'enrichissement relatif d'une modification donnée histone à des loci spécifiques. Pour surmonter ce problème, nous avons développé un protocole natif ChIP pour étudier la modification covalente des histones qui tire parti de l'hydroxyapatite (HAP) chromatographie pour laver la chromatine des protéines associées avant l'immunoprécipitation des nucléosomes. Cette procédure simple et rapide se compose de cinq étapes: l'isolement des noyaux de cellules de culture; la fragmentation de la chromatine en utilisant MNase; purification des nucléosomes en utilisant HAP; immunoprécipitation des nucléosomes modifiés, et l'analyse de l'ADN qPCR associé avec les histones modifiées. Nucléosomes préparés de cette manière sont libres de protéines contaminantes et permettre une évaluation exacte de l'abondance relative des différents covalents modifications des histones au loci génomiques spécifiques. La réalisation de ce protocole nécessite environ 1,5 d.

Chromodomaine Médiée Par épandage Sur Les Gènes Actifs

Nature Structural & Molecular Biology. Jan, 2009  |  Pubmed ID: 19125168

Double Rôle Pour La G9a Methyltransferase Dans Le Maintien De La Transcription Génique Bêta-globine Dans Les Cellules érythroïdes Adultes

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Oct, 2009  |  Pubmed ID: 19822740

L'utilisation d'un écran de la protéomique, nous avons identifié le G9a méthyltransférase comme un partenaire d'interaction de l'hématopoïétique activateur de NF-E2. Nous montrons que G9a est recruté pour le locus bêta-globine d'une manière NF-E2-dépendante et se répand sur le lieu tout entier. Alors que G9a est souvent considéré comme un corépresseur, renversant cette protéine dans la différenciation des cellules érythroïdes adultes conduit à la répression de la version bêta des adultes (maj) gène de la globine et la réactivation aberrante de la bêta-embryonnaire, comme gène de la globine E (y). Alors que dans les cellules adultes G9a maintient E (y) dans un état réprimé par l'intermédiaire diméthylation de l'histone H3 au niveau des lysines 9 et 27, il active beta (maj) transcription d'une manière indépendante méthyltransférase. Fait intéressant, le UTX déméthylase est recruté pour la version bêta (maj) (mais pas le E (y)) où il antagonise promoteur G9a-dépendante H3K27 diméthylation. Collectivement, ces résultats révèlent un double rôle pour le maintien de G9a expression appropriée (à la fois la répression et d'activation) des gènes de globine bêta-à différencier des cellules érythroïdes adultes.

UTX Médiateur Déméthylation Du H3K27me3 à Muscle Gènes Spécifiques De Cours De La Myogenèse

The EMBO Journal. Apr, 2010  |  Pubmed ID: 20300060

Protéines Polycomb (PcG) et Trithorax groupe (TrxG) agissent de manière antagoniste pour établir tissu-spécifiques des modes d'expression du gène. La protéine EZH2 PcG facilite la répression en catalysant l'histone H3-Lys27 triméthylation (H3K27me3). Pour l'expression, H3K27me3 marques sont enlevées et remplacées par des protéines catalysée TrxG histone H3 lysine 4-triméthylation (H3K4me3). Bien que H3K27 déméthylases ont été identifiés, le mécanisme par lequel ces enzymes sont destinés à des régions génomiques spécifiques pour éliminer H3K27me3 marques n'a pas été établie. Ici, nous démontrons un mécanisme en deux étapes pour UTX-médiation déméthylation au niveau des muscles des gènes spécifiques au cours de la myogenèse. Bien que le Six4 transactivateur recrute d'abord UTX à la région régulatrice de gènes musculaires, la perte résultant de la H3K27me3 marques est limitée à la région en amont du site d'initiation de la transcription. Suppression de la répression H3K27me3 marque dans la région codante nécessite alors l'ARN polymérase II (Pol II) allongement. Fait intéressant, le blocage Pol II allongement des gènes transcrits conduit à H3K27me3 augmenté dans la région codante, et la formation de bivalents domaines de la chromatine (H3K27me3/H3K4me3). Ainsi, la suppression de la répression H3K27me3 marques par UTX se fait par recrutement ciblé suivie par la diffusion à travers le gène.

Diaphonie Entre Les Modifications Des Histones Maintient Le Modèle De Développement De L'expression Génique Sur Une Locus Tissu-spécifique

Epigenetics : Official Journal of the DNA Methylation Society. May, 2010  |  Pubmed ID: 20424518

Génome études larges ont fourni une mine d'informations relatives aux modifications des histones. Modifications particulières, qui peuvent englober des régions à la fois larges et discret, sont associés à des éléments génomiques et l'état de certaines expression des gènes. Nous nous concentrons ici sur la façon dont les études sur le cluster de gènes bêta-globine peut compléter l'effort échelle du génome entier à travers la dissection minutieuse de la diaphonie protéine histone modifier. Le locus bêta-globine sert comme un système modèle pour étudier à la fois régulation de l'expression du gène conduit à une distance par des amplificateurs et des mécanismes de commutation des gènes de développement en cluster. Nous étudions des études récentes, qui découvrent que les histones méthyltransférases, recruté à l'amplificateur de la bêta-globine, l'expression des gènes de contrôle par la propagation à longue distance sur la chromatine. Plus précisément, nous nous concentrons sur la façon apparemment antagonistes complexes, tels que ceux dont MLL2, G9a et UTX, peuvent coopérer pour réguler l'expression génique fonctionnellement développemental contrôlée. Enfin, nous nous interrogeons sur les mécanismes de la chromatine modification de propagation complexe sur des domaines génomiques.

Génomique Différentiel De Ciblage De L'TAL1 Facteur De Transcription Dans Autres Lignées Hématopoïétiques

The EMBO Journal. Feb, 2011  |  Pubmed ID: 21179004

TAL1/SCL est un maître régulateur de l'hématopoïèse dont l'expression favorise des résultats opposés selon le type de cellule: différenciation dans la lignée érythroïde ou l'oncogenèse dans la lignée des lymphocytes T. Ici, nous avons utilisé une combinaison de séquençage et de ChIP profil d'expression génique de comparer la fonction de TAL1 dans des conditions normales et leucémiques érythroïde des cellules T. L'analyse des propriétés du génome entier de liaison de TAL1 dans ces deux lignées hématopoïétiques a révélé un nouvel éclairage sur le mécanisme par lequel les facteurs de transcription de sélectionner leurs sites de liaison dans des lignées de substitution. Notre étude montre un chevauchement limité dans le profil TAL1-liaison entre les deux types de cellules avec une préférence inattendu pour ETS et des motifs RUNX adjacentes à E-boxes dans la lignée des lymphocytes T. En outre, nous montrons que TAL1 interagit avec RUNX1 et ETS1, et que ces facteurs de transcription sont requis pour la critique TAL1 contraignant pour les gènes qui modulent la différenciation des cellules T-. Ainsi, nos résultats mettent en évidence un rôle critique de l'environnement cellulaire dans le facteur de transcription de modulation obligatoire, et donner un aperçu du mécanisme par lequel TAL1 inhibe la différenciation conduisant à l'oncogenèse dans la lignée des lymphocytes T.

Quantitative Analyse Protéomique Du Muscle Chien Dystrophique

Journal of Proteome Research. May, 2011  |  Pubmed ID: 21410286

Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par des mutations nulles dans le gène de la dystrophine, entraînant progressive et implacable perte de masse musculaire. Bien que la base génétique de la DMD est bien réglé, les mécanismes cellulaires associés à la physiopathologie restent encore largement inconnus. L'augmentation de la preuve suggère que les mécanismes secondaires, comme la modification de voies de signalisation clés, peut jouer un rôle important. Afin d'identifier des biomarqueurs fiables et cibles thérapeutiques potentielles, et en tirant parti de l'cliniquement pertinente Golden Retriever Dystrophie musculaire modèle canin (DRG), une étude protéomique a été réalisée. Isotope-codé étiquette d'affinité (ICAT) profilage a été utilisé pour compiler des changements quantitatifs dans les profils d'expression des protéines des muscles vastes latéraux de 4 mois vieux chiens vs GRMD sains. Fait intéressant, l'ensemble des sous-exprimés protéines détecté apparaissait principalement composé de protéines métaboliques, dont beaucoup ont été montrés à être réglementés par la transcription des peroxysomes proliferator-activated receptor-gamma co-activateur 1 alpha (PGC-1α). Par la suite, nous avons pu montré que PGC1-α expression est considérablement réduit dans les DRG par rapport à muscle sain. Collectivement, ces résultats fournissent des informations nouvelles dans la pathologie moléculaire du modèle animal cliniquement pertinent de la DMD, et indiquent que le métabolisme énergétique défectueux est une caractéristique centrale de la maladie dans le modèle canin.

Structure Cristalline De La Protéine ASH2L Trithorax Groupe Révèle Un Domaine D'ADN Forkhead-comme Reliure

Nature Structural & Molecular Biology. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21642971

Disques comme Absent, petites ou homéotique 2 (ASH2L) est un groupe trithorax (TrxG) de protéines et une sous-unité régulatrice de la famille des méthyltransférases SET1 lysine. Nous rapportons ici que ASH2L lie à l'ADN en utilisant un forkhead-hélice comme l'aile d'hélice (HWH) de domaine. In vivo, le domaine ASH2L HWH est nécessaire pour lier à la région β-globine locus de contrôle, l'histone H3 lysine 4 (H3K4) triméthylation et d'expression maximale du gène β-globine (HBB-1), la validation de l'importance fonctionnelle de l'ADN ASH2L domaine de liaison.