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Articles by Mark C. Leake in JoVE
JoVE General
単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて
1Biochemistry, University of Oxford, 2Physics, University of Oxford
ここでは、機能性分子複合体を追跡し、定量、検出できるようにするために細菌細胞を生きて単一分子蛍光顕微鏡を実行するためのプロトコルを示す。
Other articles by Mark C. Leake on PubMed
二ビーズレーザーピンセットアッセイを使用して単一のKettin分子の弾性
KettinはZディスクに細いフィラメントとα-アクチニンに関連付けられている昆虫の筋肉の高分子量蛋白質である。それは受動的なサルコメア剛性に大きく貢献し、そのC末端に向かって細いと太いフィラメントの間のリンクを形成すると考えられています。ここで弾性特性は150 pNのに力を発揮することができる2つの独立した光学トラップを用いた単一分子の抗体で区切られた領域上での機械的ストレッチによって特徴付けられた。ステップのようなイベントは、適度な力でのIgドメインの展開と関連するモジュール式のタンパク質が観察されているよりも有意に高い力で、これらのドメインのリフォールディングと一致して強制的に拡張子の関係が観察された。
ヒト心筋の筋原繊維のタイチン春の減衰弾性反跳
巨大タンパク質タイチンの筋肉の分子バネとして機能し、心筋の受動的な緊張の中で最も責任がある。タイチンスプリングが拡張ストレッチ中に拡張されているので、収縮時の弾性反跳され、潜在的に心臓の筋肉の全体的な短縮動作に影響を与える可能性があります。ここでは、タイチン弾性反跳は、高速電荷結合デバイスラインカメラとnanonewtonrange力センサを使用して、単一の人間の心臓の筋原線維で定量した。 （i）の最初のサルコメアの長さと、（ii）リリース·ステップの振幅、及び（iii）温度：スラックテストプロトコルのアプリケーションが非活性cardiomyofibrilsの受動的な短縮速度（Vp）が依存することを明らかにした。トリプシンの低用量とタイチンの選択的消化は、筋原線維受動的反動を減速し、最終的にそれを停止しました。のCa2 +非依存ゲルゾリン断片とアクチンフィラメントの選択的抽出が大幅にリリース段階の大きさと温度にVpの依存を減少させた。これらの結果は、弱いアクチンタイチンの相互作用によって主に引き起こされる筋原線維の受動反動に反対する粘性力の存在によって説明されています。タイチン弾性収縮力と内部の粘性抵抗力：したがって、Vpは二つの異なる要因によって決定されます。リコイルは、独立したワームのような鎖からなる減衰エントロピー春のそれとしてモデル化することができます。筋原線維の弾性反跳の機能的重要性はdemembranated、完全にCa2 +の活性化、人間の心臓の繊維で測定された無負荷短縮速度に瞬時にVpを比較することによって対処されています。タイチン·ドリブン·パッシブ反動は等張性収縮の初期段階に積極的にアンロードされた短縮速度よりもはるかに高速だった。減衰筋原線維弾性収縮力は、早期収縮期短縮時のヒト心筋の加速アクティブな収縮速度を助けることができる。
心筋におけるタイチンとシャペロンAlphaB-クリスタリン協会
alphaB-クリスタリンは、脊椎動物のレンズの主要なコンポーネントは、小さな熱ショックタンパク質のファミリーに属するシャペロンである。これらのタンパク質は、部分的に基板を展開するために結合し、変性を防止するオリゴマーを形成しています。 alphaB-クリスタリンは、心筋虚血の条件下で筋原線維に結合し、以前の作品は、タンパク質が心臓の線維のI帯（Golenhofen、N.、Arbeiter、A.、Koob、R.でタイチンに結合することが示されており、 Drenckhahn、D.（2002）J.モル細胞。Cardiol 34、309から319）。タイチンのこの部分は筋肉が引き伸ばされており、免疫グロブリンのようなモジュールと全くよく定義された二次構造を持たない2、拡張可能な領域（N2BとPEVK）で構成されている拡張されています。我々はタイチンの配列の知られている部分への相対的なストレッチ心臓線維のalphaB-クリスタリンの位置を続いている。 alphaB-クリスタリンは、サルコメアが拡張されたとして、Z-ディスクから離れるI-バンドの離散的な領域にバインドされています。サルコメアの長さの生理学的な範囲で、alphaB-クリスタリンはタイチンのN2B領域の位置にバインドされているが、PEVKするものではない。疲弊筋原繊維には、N2BとZ-ディスク間でのIg領域でもありました。 alphaB-クリスタリンとN2Bとの間の結合は、組換えタイチンの断片を確認した。 8ドメインのフラグメントのIgドメインはalphaB-クリスタリンで安定した、原子間力顕微鏡は、高いストレッチ力がシャペロンの存在下でドメインを展開するために必要なことを示した。 alphaB-クリスタリンとの可逆的会合は、条件は、ネイティブの状態にリフォールディングに有利になるまで展開ドメインを生ずるストレスからI-バンドタイチンを守るだろう。
発達規制周産期ハートでタイチンのサイズを変化させる筋原繊維剛性の切り替え
出生前に、心臓のコンプライアンスは心外制約によって主に制限されています。出生時にこの制約の減少は、心筋コンプライアンスが主に心臓の独自の成分によって決定されている必要があります。タイチンは心室受動的張力（PT）に主要な貢献者であるため、周産期のラット心臓の開発中に心臓タイチンアイソフォームの発現と力学を研究した。ゲル電気泳動とイムノブロット法は、単一の3.7-MDA、6日の誕生前に存在するN2BAアイソフォームおよび未知のも、追加を明らかにし、3.5から3.6 MDAのN2BAアイソフォームは、短期的な胎児で表されます。これらの大規模なアイソフォームは、急速に出生後に消え、1週齢と成体ラットの小さなN2Bアイソフォーム（3.0 MDA）が優勢に置き換えられます。さらに、新生児ブタの心は大人のブタ心筋に存在するものとは異なる大N2BA-タイチンのアイソフォームを示した。定量的逆転写酵素 - ポリメラーゼ連鎖反応によって、発達表明タイチン-mRNAの種はラットの心臓で検出された。タイチンベースのPTは、成体ラットの心筋細胞よりも、胎児に（約15倍）はるかに低かった、測定PTレベルは、ワームのようなチェーンタイチン弾力性のモデルと容易に予測可能であった。免疫蛍光顕微鏡検査法は、単離されたラットcardiomyofibrilsの胎児/新生児のタイチンのアイソフォームの差スプライシング分子バネ領域の拡張を示した。 700 kDaのでタイチン·アイソフォームシフトが生後心臓の筋原繊維の高い受動的剛性を確保し、一方、特定の新生児/胎児の心臓タイチンアイソフォームの発現はまた、周産期の心の中の収縮特性、筋原線維アセンブリまたは売上高、および心筋シグナリングに重要な機能を持つことが開発。
二ビーズ光ピンセットアッセイを用いた単一タイチン分子の弾性
タイチンは、筋サルコメアの受動的な弾力性に責任があります。骨格筋および心筋のタイチンの機械的性質は、新規デュアル光ピンセットアッセイを使用して、単一の分子に特徴づけられた。抗体のペアは、ビーズに結合し、分子全体、I-バンド、バンド、タンデム免疫グロブリン（Ig）セグメント、およびPEVK領域を選択するために使用された。フルレングスの骨格筋アイソフォームの> 25％を表現PEVK領域から構造は、ビーズに化学的に結合させたと同様に特徴とする。さまざまな地域の弾力性を解明することによって、我々は2つのエントロピー成分が、骨格筋タイチンI-バンド（前の憶測を確認）に直列にタンデム免疫グロブリンドメインに関連付けられているかを行動していること、我々の知る限り、初めて直接示したそれぞれ2.9 nmおよび0.76 nmの持続性の長さ、（150 mMのイオン強度、22℃）で、PEVK領域と他の。イオン強度の増加に伴ってPEVKコンポーネントバラ（0.4から2.7 nm）を（15から300 mM）を持続長と温度上昇（10-60℃）で（3.0から0.3 nm）に落ちた;新しい知見であった10から12 nmのステップでの応力緩和は、ネイティブPEVK地域のPEVK構築およびヒステリシスが観察された。領域は、以前に考えられていたとして、純粋なランダムコイルであるが、おそらく疎水性相互作用により、構造化された要素が含まれていない場合があります。
筋肉繊維に受動応力緩和の複数の情報源
非活性化、筋肉のストレッチ中に開発力はベロシティ·センシティブ（粘性/粘弾性）および速度と小文字を区別しない（弾性）のコンポーネントで構成されています。筋原線維レベルでは、弾性力の成分は、巨大なタンパク質タイチンのエントロピーばね特性の観点から説明されていますが、エントロピー弾性は、応力緩和などの粘弾性特性、を説明することはできません。ここでは、ゲルゾリン処理によってアクチン枯渇ラット摘出心臓の筋原線維の受動的な応力緩和にタイチンの寄与を調べます。モンテカルロシミュレーションは、最大約5秒にストレッチした後、応力緩和の時間経過がタイチン分子あたり1-2免疫グロブリンドメインの展開と仮定して説明することができ、ことを示している。応力緩和の長期間、シミュレーションはその場で、タイチン-Igドメインは、以前の単一分子原子間力顕微鏡、研究で予測よりも安定であることを示唆し、正しく筋原データを記述するために失敗しました。この発見の背後にある理由は不明のまま、単純にドメインの縮小展開可能性を想定して - 効果はここでシャペロン、α-Bクリスタリンの存在下でタイチン-Igドメイン上のAFM力分光法による発見 - 正しくシミュレートする助けにはならなかった応力緩和の時間経過。我々は、筋原線維応力緩和可能性が高い複数の情報源を持っていると結論付けている。証拠が提供されていることをそのまま筋原線維で、アクチンフィラメントの存在に起因する粘性抵抗から応力緩和の結果、初期の急激な相。
細菌べん毛モーターの回転のステップの直接観察
細菌べん毛モーターは、水泳の細菌の多くの種を推進らせんフィラメントを回転する回転分子機械である。ローターは、最大細胞膜に直径45 nmのリングのセットです。ステータは、ロータの周囲に細胞壁に固定さ約10トルク生成単位を含んでいます。モータの自由エネルギー源は、それぞれ細胞膜を横切るイオンの内向きの電気化学的勾配、H +駆動型とNa +駆動型モーターのprotonmotive力やナトリウム原動力です。ここでは、低ナトリウム原動力でとトルクを発生するユニットの少数の制御式を持つ大腸菌のNa +駆動型キメラべん毛モーターのステップ運動を示しています。我々はFliGタンパク質、ローターのトルク生成の提案されたサイトのリングの周期と一致している回転あたり26ステップを観察。鞭毛のスイッチングタンパク質チェの不在にもかかわらず、下位の手順は、単一のイオン輸送のそれに類似し、ステップごとの自由エネルギーの小さな変化を示しています。
シングル大腸菌細胞における細胞内ナトリウム濃度の蛍光測定
細菌のエネルギー伝達細胞膜は、ポンプと膜電位とイオン勾配を維持しantiportsが含まれています。我々は、ナトリウムイオン蛍光指示薬、ナトリウムグリーンを使用して大腸菌の内部のナトリウム濃度の急速な、単一細胞計測（[NA（+）]（IN））の方法を開発した。細菌べん毛モーターは、鞭毛の回転に、カップル、イオンの膜貫通の流れを、いずれかのプロトン（H（+））またはナトリウムイオン（NA（+））その分子機械である。我々は、H（+）とキメラべん毛モーターを含む大腸菌株を使用 - およびNa（+）駆動型コンポーネントはナトリウムモーターとして機能します。外部のナトリウム濃度を変更する（[Naは（+）]（EX））の範囲で1から85 mMのは、内部のナトリウム濃度の部分的な恒常性を示す、5-14 mMの間に[NA（+）]（IN）の変化をもたらした。 [NA（+）]（）と[NA（+）]（EX）、細胞の内部のナトリウム濃度は、キメラべん毛モーターは2-3倍低かった発現していない、ことを示すこととの間の関係の重要なセル間のばらつきがあったこれらのモータを介してナトリウムフラックスは、セルへの総ナトリウムフラックスの重要な部分です。
昆虫の飛行筋肉タンパク質ProjectinとKettinの分子弾性
Projectinとkettinは、飛行中の振動作業を生成するために必要とされる昆虫の間接飛翔筋の高い受動的剛性、主に担当タイチンのような蛋白質である。ここでは、単一分子間力分光法によるkettinとprojectinの機械的性質を報告します。タガメ属projectinとショウジョウバエの遺伝子組換えprojectinまたはkettinフラグメントから得られた力の拡張と力クランプカーブはprojectinのフィブロネクチンタイプIIIドメインは機械的に弱いことが明らかになった（力を広げて、F（u）は約50から150 PN）のIgドメインより（F （u）は約150から250 PN）。 SLS / kettinのIgドメインのうち、N末端に近い領域では、C末端付近に比べて少なく安定しています。 Projectinドメインは[15歳で85パーセントの（-1）（25℃）]非常に高速なリフォールディングも大きな力（15-30 PN）の下で。リフォールディングの速度は、おそらく折り畳み機構の協力の性質を反映して、2-3のQ（10）を有していたのに対し、温度は、1.3のQ（10）展開力に影響を与えた。 projectinとkettinの高い曲げ剛性は、タンパク質を矯正すると、低い力を必要とすることが示された。我々の結果は、間接飛翔筋におけるタイチンのようなタンパク質は折りたたみ式ベーススプリングメカニズムに従って機能することができることを示唆している。
単一分子の原子間力分光法による心臓のタイチンN2B領域の機械的特性
タイチンは、筋サルコメアの受動張力世代の責任の巨大な蛋白質である。ここでは、どちらかの側の2つの免疫グロブリン（Ig）ドメインに挟まれた572残基の固有のシーケンスを抱く人間の心臓特異的N2B領域から組換え構築物の機械的特性を調査するための単一分子AFMフォーススペクトロスコピーを使用していました。 N2B-コンストラクトの力拡張曲線はタイチンの遠位のIg領域（I91-98）からの組換えフラグメントの場合と同様のIgドメインの部隊を展開意味を明らかにした。 N2B固有のシーケンスの平均輪郭長は120nmであったが、約95ナノメートル（主要ピーク）と180 nmの（マイナーピーク）を中心とした二峰性分布があった。 N2B固有のシーケンスがあった場合、これらの値は予想よりも低くなって恒久的にエントロピー春を広げますが、孤立したストレッチcardiomyofibrilsで測定され、そのセグメントの約100 nmの最大の拡張子と一致している。 N2B固有のシーケンスがなど、いくつかのジスルフィド接続予測アルゴリズムによって提案されたジスルフィド架橋によって安定化された場合は200 nm以下の輪郭の長さは、しかし、合理的であろう。 N2B固有のシーケンスがタイチンベースの剛性を低下させるプロテインキナーゼ（PKA）によってリン酸化することができるので、我々は、PKAの加算（+ ATP）は、N2B、構造物の機械的特性に影響を与えますが、変更が見つかりませんかどうかを指定します。研究N2B-タイチンでPKAの軟化効果は心筋細胞内に存在し、特定の条件/要因が必要な場合があります。
大腸菌の鞭毛モーターのトルク発生ユニットの最大数は少なくとも11である
トルクがペプチドグリカン細胞壁に固定ステータユニットを転位イオンによる細菌の鞭毛の基部に回転モーターで生成されます。ステータユニットは、プロトン駆動型モーターのタンパク質モタとMotBの構成され、それらはナトリウム駆動型モーターのPomAとPomBで構成されています。機能的なステータタンパク質を欠く大腸菌の菌株は回転しない鞭毛を生産し、不足しているタンパク質の誘導発現は、離散速度の増分として知られるプロセスでモータの回転の回復につながる "復活"初期の作品は、8ユニットの最大を示唆した。 WTモーターが中断モータの回復に基づいて、8台以上を含むことがより最近の兆候が、決定的なものではない。ここでは、モータのユニットの最大数は少なくとも11であることを決定的に示しています。鞭毛に接続されている1お母さんポリスチレンビーズのバックフォーカルプレーン干渉を用いて、大腸菌でタンパク質固定の3つの異なる組み合わせで復活中に少なくとも11の異なる速度増分を観察した。単一ユニットと完全に誘導されるモータで発生する平均トルクは前回予想よりも低かった。台の高い数値での速度増分が完全に誘導されるモータのすべての単位が同等であることを示し、低い数字で、それより小さくなります。
シングル、機能膜タンパク質複合体の化学量論と売上高
多くの重要な細胞プロセスは、細胞膜に位置して複雑な生物学的マシンによって行われている。細菌べん毛モーターは、イオン駆動回転モーターとして機能する液体培地を介して細胞を推進することに大きな膜貫通タンパク質複合体である。モーターの中で、MotBは、カップルは細胞壁への生成とアンカーステータトルクのフローをイオンというステータのコンポーネントです。ここでは、大腸菌の細菌べん毛モーターの機能で、単一分子の精度でタンパク質の化学量論、力学とMotBの売上高を調べた。我々は、つながれた細胞体の回転によって運動機能を監視すると同時に、内部全反射蛍光顕微鏡によるモータに緑色蛍光タンパク質（GFP-MotB）で標識しMotBの分子数とダイナミクスを測定した。単一GFP分子の段階的な退色によってカウント蛍光体は、それぞれのモータは約11ステータをそれぞれ含む2 MotBの分子との一貫性のあるGFP-MotBの約22のコピーが含まれていることが示された。我々はまた、約0.008 microm2 S（-1）で拡散さ約200 GFP-MotBの分子の膜プールを観察した。退色の退色後蛍光回復し、蛍光損失は0.04秒（-1）のオーダーの速度定数と膜のプールとモータの間にGFP-MotBの売上高を示した：モータ内の指定されたステータの滞留時間は約0.5です。分。これは数や機能分子機械内でのタンパク質サブユニットの急速な売上高の最初の直接測定である。
低負荷で細菌べん毛モーターの駆動力として、膜電位とイオン勾配の非等価
多くの細菌種は鞭毛を使って泳ぐ。回転に細胞膜を横切ってべん毛モーターのカップルのイオンの流れ。イオンの流れが膜電位（V（M））と貫通濃度勾配の両方によって駆動されます。細菌べん毛運動機能との関係を調べるために、我々は、色素テトラメチルローダミンメチルエステルを用いて、単一細胞でV（m）を測定する蛍光技術を開発しました。我々は、細胞と細胞内の色素濃度の画像の蛍光強度との関係を決定するためにコンボリューションモデルを使用し、V（m）は細胞外/細胞内の色素濃度の比を用いて算出。我々が見つかりましたV（M）= -140 + / - 外部のpH 7.0（pH値（EX））での大腸菌の14 mVの、-85に減少+ / - のpH（EX）5.0で10 mVです。また、V（m）と細胞内のナトリウム濃度の単一細胞の測定を組み合わせることにより、ナトリウム原動力（SMF）を推定した。我々は、-187の間でSMFを変更することができました+ / - 15 mVおよび-53 + / - 範囲1から85 mMで7.0から5.0の範囲と細胞外ナトリウム濃度のpH（例）を変化させることにより15 mVです。回転のレート0.35マイクロモルとNaに接続される1-マイクロモル径ビーズ（+）駆動型キメラべん毛モーターは、V（m）で直線的に変化した。大きいビーズのために、SMFの2つのコンポーネントは、与えられたSMFで小さなビーズのに対し、速度はナトリウム勾配と外部のナトリウム濃度とともに増加し、同等であった。
細胞膜内の専門ゾーンに集中大腸菌OXPHOS錯体は何ですか？
ほとんどの生物はOXPHOS（酸化的リン酸化）によってATPを合成することができます。細胞膜は原核生物で使用されているのに対し、真核生物のミトコンドリアは、ミトコンドリア内膜にOXPHOSを実行します。 OXPHOS生化学的レベルでよく理解プロセスであるのに対しただし、比較的少ないがwhole-organelle/cellのレベルで、その動作についてはほとんど知られていない。我々は、蛍光標識されたターミナルオキシダーゼ、シトクロムbdの複合体は、不均一大腸菌細胞膜に分布していることを観察した。この観察は、大腸菌の細胞膜（ 'respirazones'）のパッチは、隣接する膜に相対し、これらのゾーンでOXPHOSコンポーネントの高濃度で呼吸機能に特化していることを作業仮説の基礎を形成します。この仮説の形成と生理的意義は、このホワイト·ペーパーで説明されています。
生体1分子蛍光イメージングでによって観測されたツインアルギニンタンパク質輸送システムのタタ·コンポーネントの変数の化学量論
ツインアルギニン転座（TAT）システムは、細菌の細胞膜と植物の葉緑体のチラコイド膜を横切って折り畳まれたタンパク質を輸送する。タット経路の必須成分は、膜タンパク質はTATA、TATB、とTatCです。タタは、TAT系のタンパク質転位素子を形成すると考えられています。タット輸送のための現在のモデルでは、タタのオリゴマー状態の詳細およびかどうかを予測する方法、および、この状態変化の輸送サイクル中にします。我々は、個々の黄色蛍光タンパク質で標識したTATA錯体の光物理的解析により、生きた細胞での発現のネイティブレベルで直接タタのオリゴマー状態を決定した。タタは、複雑な当たり約25タタ·ユニットの平均と化学量論の広い範囲を示す複合体を形成します。化学量論分布のフーリエ解析は、複合体は四量体単位から組み立てられていることを示唆する。複合体の拡散挙動をモデリングするタタプロトマーリングではなく、バンドルとして関連付けることを示唆している。各セルは、約15の携帯タタ複合体と細胞膜に多くの分散した状態で約100 TATA分子のプールを含んでいます。タット輸送を駆動protonmotive力の消費はタタ複雑な化学量論に影響はありません。タタ錯体はTatBCは、タタのオリゴマー状態を制御することを示唆し、TatBCを欠いている細胞で形成されません。我々のデータは、Tat輸送のメカニズムのタタ重合モデルをサポートしています。
クラスタリングおよびin Vivoでの大腸菌形質膜中のシトクロムBD-I複合体のダイナミクス
大腸菌のチトクロムBD-I複合体は呼吸末端酸化酵素と細胞膜の不可欠なコンポーネントです。その他の呼吸器系のコンポーネントと同様に、生きている膜の組織とこの複合体の力学は不明である。我々は、in vivoでこの複合体の分布とダイナミクスを可視化するために設定してください。大腸菌染色体上にcydB-gfpgcn4ためcydBを交換することによって、我々は、野生型遺伝子の制御下で機能的なGFPタグ付きシトクロムBD-I端子オキシダーゼ複合体を表す株（YTL01）を生成する。我々は、光退色後の蛍光回復との組み合わせでビデオレート落射蛍光と全反射蛍光（全反射）顕微鏡を使ってライブYTL01細胞をイメージング（FRAP）やプラズマ膜でGFP蛍光のモバイルスポットを見ました。スポットごとにGFP分子の数は、シトクロムBD-Iは大腸菌の細胞膜でのモバイルのパッチに集中していることを示す、約76の平均値との広範な分布を与えるステップワイズ退色により定量した。私たちは、呼吸は私たちが 'respirazones "と呼ぶモバイル膜パッチで発生したと仮定した。
分子ブレーキ、クラッチはありませんが、ロドsphaeroidesのべん毛モーターを停止します。
多くの細菌種は、そのパワーヘリカルフィラメントの回転イオン駆動型分子モーターを採用して泳ぐ。信号は、走化性経路を介して外部環境からモータに送信されます。双方向のモータで、モータへのリンチェ（チェ-P）の結合は別の方向に回転で生じる立体構造変化の異なるローターステータインターフェイスでその結果を、扇動と推定される。このスイッチが発生したときに制御することにより細菌は生き残りのために有利な場所に蓄積することができます。双方向のモーターと一緒に泳ぐほとんどの種とは異なり、ロドsphaeroidesのは、単一の停止·開始するべん毛モーターを採用しています。ここで、我々は尋ねた、崔-Pの結合は、R. sphaeroidesのでモータをどのように停止していない - クラッチやブレーキを使用していますか？粘性流れや光ピンセットで外力を印加することにより、我々はR. sphaeroidesのモータがブレーキを使用して停止していることを示しています。モータは、比較的高トルクによって所定の位置にロックされている27から28離散的な角度は、約2-3倍のストールトルクで停止します。
大腸菌のアクティブなDNA複製機構の化学量論とアーキテクチャ
DNAを複製する多タンパク質複合体は、広範囲にreplisome in vitroでの特徴が、in vivoで、その組成およびアーキテクチャは不明であるされています。 replisome成分の蛍光誘導体を発現する細胞を生体内でミリ秒の単一分子蛍光顕微鏡を用いて、我々はreplisome化学量論とアーキテクチャを検討した。アクティブ大腸菌replisomes三複製ポリメラーゼの分子ではなく、歴史的に受け入れられて2が含まれています。これらは、タウ、ポリメラーゼをtrimerizesクランプローダーコンポーネントの三分子に関連付けられています。 3スライディングクランプの2つだけは、常にコアreplisomeに関連付けられています。一本鎖結合タンパク質は、replisome当たり5から11量体で、コア·コンポーネントよりも広い空間分布を持っています。このin vivoでのテクニックは、他の分子機械に単分子洞察力を提供することができます。
細菌べん毛スイッチ蛋白質のFLIMの信号に依存売上高
ほとんどの生物学的プロセスは、多タンパク質複合体によって行われます。伝統的に静的なエンティティとして説明したように、証拠は今それらのコンポーネントは、細胞プールを常に交換し、非常に動的であることが浮上している。細菌べん毛モーターは、約13種類のタンパク質が含まれており、機能性分子複合体を研究する理想的なシステムを提供します。それは中央のローターを押しステータ複合体のリングを介して貫通イオンフラックスによって供給されています。大腸菌のモーターはローターのスイッチコンポーネントのFLIMにレスポンスレギュレーターの崔会長の結合に応答して確率的に方向を切り替えます。多くは静的なモータ構造の知られているが、我々は単に個々のコンポーネントのダイナミクスを理解し始めている。ここでは、生理的なレベルでFLIMのゲノムエンコードYPet誘導体を発現する大腸菌の高解像度の蛍光顕微鏡を使用することにより、べん毛モーターの機能にFLIMの化学量論と売上高を測定します。我々は、モータごとに約30 FLIM分子が離散的な集団、しっかりとモータと他の受けている確率の離職率に関連付けられたいずれかに存在することを示している。 FLIM分子のこの売上高は、モータのスイッチングの過程で潜在的な役割を示唆している、アクティブな崔の存在に依存します。多くの点で、細菌べん毛モーターは、原型の高分子アセンブリとしてであり、我々の結果は他の大規模な分子複合体におけるタンパク質の代謝回転の機能的関連性のためにさらに影響を与える可能性があります。
単一分子細胞生物学の新しい科学：機能性分子複合体上でスポットライトを照らす
単一分子の研究は生命科学内で最も急成長している分野の一つとして浮上している。歴史的に、採用技術のほとんどは調査対象の生物系の成分が抽出され、研究の下でだけ重要な要素にそれらを減らすために細胞から精製されていた試験管の世界では主に運営しており、本研究では関与している小説、単一分子の測定を得るための生物物理学の先駆的な方法。何が最近浮上していると、正しく機能するように生きている細胞の単一分子の実験を行うために、ネイティブの生物学的な文脈、すなわち維持しながら、キーの単一分子実験を行うための技術的能力である。これは本質的に現代的な単一分子生物物理学と古典的な細胞生物学のアプローチを組み合わせた "単一分子細胞生物学"の新たな科学を紹介します。ここでは、このフィールドの境界をプッシュバックしている主要な最近の研究では説明されています。
単一分子を用いた生きた細菌でリアルタイムに見られる機能ナノマシンと超解像蛍光イメージング
分子機械は生きている細胞の基本的な生化学を駆動する、 "事前に確立された"ナノテクノロジーの例です。彼らは多くの他の中の化学プロセス用燃料の生成、細胞、細胞の移動性、シグナル伝達と遺伝コードの複製内の分子成分の輸送を含め、機能の巨大な範囲を包含する。多くのそのようなナノメートルの長さスケール機の我々の理解のは、隔離された人工的な条件で行うin vitro試験から来ている。研究者は今彼らのネイティブ環境でナノマシンを研究課題に取り組んでいます。このレビューでは、我々は最先端の単一分子と超解像蛍光顕微鏡を組み合わせた最先端の遺伝子技術を用いてモデル細菌系でナノマシンのin vivo研究の最近の概要を説明します。我々は、単一分子を締結し、超解像蛍光イメージングは、生体ナノマシンの生化学的、構造的および機能的特性評価のための強力なツールを提供しています。蛍光イメージングから同時に得られる統合的、空間的時間的な、単一分子のデータは、システム·レベルの単分子細胞生物物理学およびin vivoでの生化学の道を開きます。
