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Articles by Mark C. Leake in JoVE
JoVE General
단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여
1Biochemistry, University of Oxford, 2Physics, University of Oxford
여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.
Other articles by Mark C. Leake on PubMed
2 비드 레이저 족집게 분석 결과 사용 하 여 단일 Kettin 분자의 탄성
Kettin 얇은 필 라 멘 트 및 알파-actinin Z 디스크에 관련 된 곤충 근육의 높은 분자 질량 단백질 이다. 그것은 그것의 C-말단, 수동 sarcomere 강성에 크게 기여를 향해 얇고 두꺼운 필 라 멘 트 사이 링크를 생각. 여기 탄성 속성은 두 개의 독립 광학 트랩 150 pN 최대 힘을 발휘 할 수를 사용 하 여 단일 분자의 항 체 구분 된 지역에 기계적 뻗어 특징 이다. 단계와 같은 이벤트는 적당 한 힘과 관련된 모듈 단백질에 대 한 관찰 보다 상당히 높은 세력에서 이러한 도메인 refolding Ig 도메인의 전개와 일치 강제로 확장 관계에서 관찰 되었다.
인간의 Myocardium Myofibrils Titin 스프링의 탄성 반동 Damped
거 대 한 단백질 titin 근육에서 분자 스프링 기능을 하며 심근의 수동 긴장의 대부분에 대 한 책임 이다. Titin 봄 확장기 스트레칭 하는 동안 확장 때문에 systole는 동안 탄력적 반동 것 이다 하 고 잠재적으로 심장 근육의 단축 전반적인 동작을 영향을 미칠 수 있습니다. 여기, titin 탄성 반동 전 하 결합 소자 초고속 카메라와 nanonewtonrange 포스 센서를 사용 하 여 단일 인간의 마음 myofibrils의 계량 했다. 여유 시간 테스트 프로토콜의 응용 프로그램 nonactivated cardiomyofibrils의 속도 (Vp)를 단축 하는 수동에 따라 공개: (i) 초기 sarcomere 길이, (ii) 릴리스 단계 진폭 및 (3) 온도. 트립 신의 낮은 복용량과 titin의 선택적 소화 myofibrillar 수동 반동 가감 하 고 결국 중단 되었습니다. Ca2 +와 말라 필 라 멘 트의 선택적 추출-독립 gelsolin 조각 크게 출시 단계 크기 및 온도에 부사장의 종속성 감소. 이러한 결과 주로 약한 말라-titin 상호 작용 하 여 발생 하는 점성 myofibrillar 수동 반동 반대 세력의 존재에 의해 설명 했다. 따라서, 부사장은 두 가지 요인에 의해 결정 됩니다: 점성 끌어서 내부 titin 탄성 반동 세력. 반동 감쇠 엔트로피 봄 독립적인 웜 같은 체인으로 구성 된의로 모델링할 수 있습니다. Myofibrillar 탄성 반동의 기능적 중요성 즉각적인 부사장 demembranated, Ca2 + 완벽 하 게 측정는 언로드된 단축 속도를 비교 하 여 해결-활성화, 인간의 심장 섬유. Titin 구동 수동 반동이 했다 활성 보다 훨씬 빠르게 isotonic 수축의 초기 단계에서 속도 단축 하는 언로 드. 탄성 반동 감쇠 myofibrillar 초기 수축 기 단축 하는 동안 인간의 심근의 수축 활성 속도 가속 수 있습니다.
심장 근육에 Titin와 함께 보호자 편지가 Crystallin의 협회
편지가-crystallin, 척추 렌즈의 주요 구성 요소는 작은 열 충격 단백질의 가족에 속한 보호자. 이러한 단백질 형성 올리고 부분적으로 펼친된 기판에 바인딩하고 변성을 방지 하는. 편지가-crystallin, 심장 근육에 허 혈의 조건 하에서 myofibrils에 바인딩하고 이전 작업 단백질 I-밴드에서 심장 섬유의 titin에 바인딩합니다 보이고 있다 (Golenhofen, 북 아 일, Arbeiter 대답, Koob, 인민, 그리고 Drenckhahn, D. (2002) J. Mol. 셀. Cardiol입니다. 34, 309-319)입니다. Titin이이 부분 근육이 뻗어으로 확장 하 고 면역 글로불린 같은 모듈과 2 개의 확장 가능한 영역 (N2B PEVK) 보조 없는 잘 정의 된 구조가 구성 됩니다. 우리는 titin 시퀀스의 알려진된 부분을 기준으로 뻗어 심장 섬유에서 편지가 crystallin의 위치를 따라. 편지가 crystallin I-밴드의 sarcomeres 확장 된 Z 디스크에서 이동 하는 개별 영역에 바인딩된. Sarcomere 길이 생리 적 범위에서 편지가 crystallin PEVK 하지 titin, 하지만 N2B 영역의 위치에 바인딩된. 물체 myofibrils의 Ig 지역 N2B Z 디스크 사이에서 또한 이었다. 편지가 crystallin와 N2B 간의 바인딩은 재조합 titin 파편을 사용 하 여 확인 되었다. 8-도메인 조각에 Ig 도메인 편지가-crystallin;에 의해 안정 된 원자 힘 현미경 높은 스트레칭 세력 존재는 보호자 도메인 전개 필요 했다 보여주었다. 편지가 crystallin 가역 연관 스트레스 도메인 펼쳐진 원시 상태로 refolding 유리한 조건이 될 때까지 발생 책임에서-밴드 titin 보호 하는 것.
발달 Titin의 스위칭 레 귤 레이트 된 크기 Perinatal 심장 Myofibrillar 강성을 변경 합니다
출생 전에 심장의 준수 extracardiac 제약 조건에 의해 주로 제한 됩니다. 출생 시이 제약의 감소 심근 준수 주로 심장의 성분에 의해 결정 됩니다 해야 합니다. Titin 심 실 수동 긴장 (PT)를 주 기여자 이므로 식과 심장 titin isoforms 역학 perinatal 쥐 심장 개발 하는 동안 공부 우리. 젤 전기 이동 법 및 immunoblotting 밝혀 단일, 3.7 MDa, N2BA isoform 탄생과 단기적 태아에 표현 된 3.5 3.6 Mda의 추가, 또한 이전에 알 수 없는 N2BA isoform 현재 6 일. 이러한 큰 isoforms 빠르게 출산 후 사라지고 1 주 오래 된 및 성인 쥐에 predominating 작은 N2B isoform (3.0 MDa)으로 대체 됩니다. 또한, 신생아 돼지 마음 보여 큰 N2BA titin isoforms 그 현재 다른 성인 돼지 심근에. 정량 역전사 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 발달 표현된 titin mRNA 종 쥐 심장에서 발견 되었습니다. Titin 기반 PT는 훨씬 낮은 (약 15 시간) 성인 쥐 cardiomyocytes 보다 태아에 측정 된 체력 수준을 쉽게 웜 같은 체인 titin 탄성 모델 예측 했다. 면역 형광 검사 현미경 검사 법 격리 된 쥐 cardiomyofibrils 태아/신생아 titin isoforms의 차동 접합된 분자 봄 영역의 확장성을 보였다. 700 Kda에 의해 titin isoform shift 출생 후 심장 myofibrils의 수동 고강성, 보장 하는 반면 특정 태아/신생아 심장 titin isoforms 식 수축 성의 속성, myofibril 어셈블리 또는 회전율, 및 심근 perinatal 심장 개발 하는 동안 신호에 대 한 중요 한 기능을 가질 수도 있습니다.
2 비드 광학 핀셋 분석 결과 사용 하 여 단일 Titin 분자의 탄성
Titin 수동 근육 sarcomere 탄력성에 대 한 책임 이다. 골격과 심장 근육 titin의 기계적 특성은 광학 핀셋 소설 듀얼 분석 결과 사용 하 여 단일 분자에 특징입니다. 항 체 쌍 구슬에 연결 되었고 전체 분자, 난 밴드, A 밴드, 탠덤 면역 글로불린 (Ig) 세그먼트 및 PEVK 지역 선택 하는 데 사용 됩니다. PEVK 지역 표현에서 구문 > 전체 길이 골격 근육 isoform의 25% 화학적으로 구슬에 활용 되었고 비슷한 것이 특징. 다른 영역의 탄성 elucidating 여 살펴본 직접 처음으로 대 한 우리의 지식에는 두 엔트로피 구성 요소 행동 시리즈는 골격 근 titin 나 밴드 (이전 추측 확인)에서 탠덤 면역 글로불린 도메인 및 지 속성 길이 2.9의 PEVK 영역에 다른 연관 nm와 0.76 nm, 각각 (150mm 이온 세기, 22도 C). 소설 발견 했다: PEVK 구성 요소의 지 속성 길이 증가 (0.4 2.7 nm) 이온 강도 (15-300 m m)와 떨어진 증가 (3.0 0.3 nm) 온도 증가 (10-60 섭씨); 스트레스-휴식 10 12 nm 단계에서 PEVK 건설 기본 PEVK 영역에서 히스테리시스에 관찰 되었다. 이전에 생각, 하지만 소수 성 상호 작용을 가능 하 게 구조화 된 요소를 포함 지역 순수 랜덤 코일 되지 않을 수도 있습니다.
근육 섬유에 수동 스트레스 이완의 여러 소스
Nonactivated 근육의 스트레칭 하는 동안 개발 세력 속도 민감한 (점성/점 탄성)의 구성 및 속도 구분 하지 않는 (탄성) 구성 요소. Myofibrillar 수준에서 거 대 한 단백질 titin의 엔트로피 봄 속성 측면에서 탄성 포스 구성 요소를 설명 하지만 엔트로피 탄성 스트레스 이완 등의 지니는 속성에 대 한 계정 수 없습니다. 여기에 우리가 조사 titin gelsolin 치료에 의해 말라의 고갈 격리 된 쥐 심장 myofibrils의 수동 스트레스 완화에 기여. 몬테카를로 시뮬레이션, 약 5 보여주는 스트레칭 후 s, 스트레스 이완의 시간 과정 titin 분자 당 1-2 면역 글로불린 도메인의 전개 가정 기술 될 수 있다. 스트레스 이완의 연장된 기간에 대 한 올바르게 제안 하는 현장에서 titin Ig 도메인 수 있습니다 보다 더 안정 된 myofibril 데이터를 설명 하는 데 실패 하는 시뮬레이션 이전 단일 분자 원자 힘 현미경 연구에서 예측 했다. 이 발견의 뒤에 이유를 알 수 없는; 남아 단순히 도메인-보호자, 존재 titin Ig 도메인에 AFM 힘 분광학에 의해 여기를 발견 효과의 감소 펼쳐진 확률을 가정 알파-B-crystallin-도움이 되지 않았다 제대로 스트레스 이완의 시간 과정을 시뮬레이션 합니다. 우리는 가능성이 myofibrillar 스트레스 이완에는 여러 소스 결론. 증거 그대로 myofibrils 스트레스 이완의 초기, 빠른 단계 말라 필 라 멘 트의 존재로 인해 점성 저항에서 발생 하는.
세균 Flagellar 모터의 회전의 단계에의 직접 관찰
세균 flagellar 모터 수영 박테리아의 많은 종류를 추진 나선형 필 라 멘 트를 회전 하는 로터리 분자 기계 이다. 로 터는 최대 45 반지 세트 세포질 막;에 직경이 nm 고정자 회전자의 주변에서 세포 벽에 고정 약 10 토크 생성 단위를 포함 되어 있습니다. 모터에 대 한 무료 에너지 소스 세포질 막, protonmotive 힘 또는 나트륨 동기 힘에 대 한 H + 이온의 안쪽으로 이동 전기 그라디언트는 이다-구동 및 Na +-구동 모터, 각각. 여기의 Na + 스테핑 모션 시연-낮은 나트륨 동기 힘과 토크를 생성 하는 작은 수의 제어 식으로 대장균에서 chimaeric flagellar 모터 구동 장치. 우리는 FliG 단백질로 터에 토크 생성의 제안 된 사이트의 링 주기와 일치 하는 혁명 당 26 단계 관찰. 거꾸로 flagellar 스위칭 단백질 Chey의 부재에도 불구 하 고 단계 단계, 단일 이온 교통 비슷한 당 자유 에너지의 작은 변화를 나타냅니다.
단일 병원 성 대장균 세포에서 세포내 나트륨 농도의 형광 측정
박테리아의 에너지 transducing 세포질 막 펌프 및 antiports 막 잠재력을 유지 하 고 이온 그라디언트를 포함 합니다. 우리는 신속 하 게, 단일 셀 내부 나트륨 농도 (나트륨 이온 형광 표시기, 나트륨 녹색을 사용 하 여 대장균에 [Na(+)](in)) 측정 방법 개발. 세균 flagellar 모터는 이온, 중 양성자 (H(+)) 또는 나트륨 이온 (Na(+)), flagellar 회전 막 횡단 흐름 커플 분자 기계. H(+)-및 Na (+) chimeric flagellar 모터 포함 된 대장균 스트레인을 사용 했습니다-나트륨 모터로 작동 하는 구성 요소를 제어 합니다. 외부 나트륨 농도 변경 ([Na(+)](ex)) 범위에서 변화 [5-14 m m, 내부 나트륨 농도의 부분 항상 성을 나타내는 사이 na(+)](in)에 귀착되 었 다 1-85 mM. 중요 한 intercell 변화 사이의 관계에 있었다 [na(+)](in)와 [Na(+)](ex), 그리고 하지 chimeric flagellar 모터를 표현 하는 셀의 내부 나트륨 농도 2-3 번 더 낮은,이 모터를 통해 나트륨 플럭스 셀으로 총 나트륨 플럭스의 중요 한 일부분 임을 나타냅니다.
곤충 비행 근육 단백질 Projectin 및 Kettin의 분자 탄력
Projectin와 kettin는 titin와 같은 단백질 주로 비행 중 진동 작업을 생성 하는 데 필요한 곤충 간접 비행 근육의 높은 동적 강성에 대 한 책임. 여기 우리는 kettin 및 단일 분자 힘 분광학에 의해 projectin의 기계적 특성을 보고 합니다. 포스 확장과 포스 클램프 곡선 Lethocerus projectin 그리고 초파리 재조합 projectin 또는 kettin 조각 밝혔다 fibronectin 유형 III 도메인 projectin에 기계적으로 약한 (힘, f(u)에 펼쳐진 약 50-150 pN)에서 얻은 Ig-도메인 (pN F(u) 약 150-250) 보다. Sls/kettin에서 Ig 도메인 중에서 N 말단 근처 도메인은 C 종점 근처의 것 보다 덜 안정적입니다. 매우 refolded projectin 도메인 빨리 15 s(-1) (25 ° C)에서 [85%] 그리고 높은 세력 (pN 15-30). 온도 1.3, Q(10)와 함께 펼쳐지는 세력의 영향을 받는 반면 refolding 속도 했다 아마 접는 메커니즘의 공동 특성을 반영 하는 2-3, Q(10). 높은 굽 projectin와 kettin의 rigidities 단백질 스트레이트 작은 힘이 필요 함을 나타냅니다. 우리의 결과 간접 비행 근육에 titin 같은 단백질 폴딩-기반-스프링 메커니즘에 따라 작동할 수 것이 좋습니다.
심장 Titin N2B-지역 단일 분자 원자의 기계적 특성 분광학을 강제로
Titin 거 대 한 단백질 근육 sarcomeres의 수동 장력 생성에 대 한 책임 이다. 여기, 인간의 심장 관련 N2B-지역에서 양쪽에 두 개의 면역 글로불린 (Ig) 도메인에 의해 형벌 572 잔류물 고유 시퀀스를 비호 하는 재조합 형 구성의 기계적 특성을 조사 하기 위해 단일 분자 AFM 힘 분광학을 사용 했습니다. N2B 구문 강제 확장 곡선 Ig-titin (I91-98)에서 원심 Ig 영역에서 재조합 단편의 것과 유사한 도메인에 대 한 의미 전개 세력을 공개 했다. N2B 고유 시퀀스의 말은 컨투어 길이 120 nm, 약 95 중심으로 모달 배포 했지만 nm (주요 피크)와 180 nm (사소한 피크). 이러한 값 N2B 고유 시퀀스 영구적으로 펼친된 엔트로피 봄 경우 예상 보다 낮은 하지만 격리 된 연장된 cardiomyofibrils 단위로 측정 해당 세그먼트의 약 100 nm의 최대 확장명이 일치 하는. 그러나 컨투어 길이 200 nm 합리적인, 것, N2B 고유 시퀀스 여러 disulphide 연결 예측 알고리즘에 의해 제안 된 disulphide 브리지에 의해 안정 된 경우. N2B 고유 시퀀스는 단백질 키 니 아 제 A (PKA), titin 기반으로 강성을 절감 하 여 phosphorylated 수 이후 우리 여부 PKA (+ ATP)의 추가 N2B 생성자의 기계적 성질에 영향을 공부 하지만 아무런 변화를 발견. N2B titin에서 PKA의 연 화 효과 특정 조건/요소는 cardiomyocytes 안에 존재 해야 합니다.
토크를 생성 하는 최대 단위 대장균의 Flagellar 모터에는 적어도 11
토크는 세균성 신설의 기지에서 로터리 모터 peptidoglycan 세포 벽에 고정 하는 고정자 단위 translocating 이온 생성 됩니다. 고정자 단위는 양성자 구동 모터 단백질 Mota와 MotB 구성 되며 Poma와 PomB 나트륨 구동 모터의 구성. 기능성 고정자 단백질 부족 한 대장균의 변종 flagella 회전 하지 않습니다 생산 하 고 누락 된 단백질의 유도 식 개별 속도 단위로 모터 회전의 복원 프로세스 "부활." 라고 리드 초기 작품에는 최대를 8 명의 단위 제안 했다. 더 최근의 징후 WT 모터 교란된 모터의 복구에 따라 8 개 이상의 단위 포함 될 수 있습니다 결정 되지 않습니다. 여기 우리가 모터에 단위의 최대 수는 적어도 11 결정적으로 보여. Flagella 연결할 1 엄마가 폴리스 티 렌 구슬의 뒤로 초점 비행기 간섭계를 사용 하 여, 대장균에 있는 전계 단백질의 3 가지 조합으로 부활 하는 동안 적어도 11 가지 속도 증가 관찰 합니다. 단일 장치에 의해 생성 된 평균 토크와 완벽 하 게 유도 모터 이전 예상 보다 낮은 되었습니다. 높은 숫자 단위 속도 증가 완전히 유도 모터에서 모든 단위는 동일 나타내는 낮은 숫자 보다 작습니다.
Stoichiometry 및 단일, 기능 막 단백질 복합물에서 회전율
많은 필수 세포질 프로세스는 세포 막에 있는 복잡 한 생물 학적 기계에 의해 수행 됩니다. 세균 flagellar 모터 큰 막에 걸친 단백질 이다 복잡 한 액체 매체를 통해 세포를 추진 하는 이온 중심 로터리 모터로 작동. 모터 내 MotB 토크 생성을 이온 흐름 커플 하 고 세포 벽을 고정자를 고정 하는 stator의 구성 요소입니다. 여기 우리가 단백질 stoichiometry, 역학 및 대장균에서 작동 세균 flagellar 모터에 단일 분자 정밀 Motb의 회전율을 조사 했습니다. 우리 곁된 셀 바디의 회전에 의해 모터 기능을 모니터링 하 고 동시에 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법에 의해 모터의 번호와 녹색 형광 단백질 (GFP MotB) 셔 서 MotB 분자 역학 측정. Fluorophores 각 모터 포함 약 22 보여준 단일 GFP 분자의 stepwise photobleaching에 의해 계산 각 포함 2 MotB 분자 GFP MotB, 약 11 stators와 일치의 복사 합니다. 우리는 또한 약 0.008 microm2 s(-1)에서 확산 하는 약 200 GFP MotB 분자의 막 풀을 관찰 했다. Photobleaching에서 photobleaching 및 형광 손실 후 형광 복구 보여준 막 풀 0.04 s(-1) 순서의 속도 상수와 모터 사이 GFP Motb의 회전율: 모터에 주어진된 stator의 지속 시간 약 0.5 분만 이다. 이것은 수와 단백질 소 단위 기능 분자 컴퓨터 내에서 급속 한 매출의 첫 직접 측정입니다.
막 전압과 이온-그라데이션, 낮은 부하에서 세균 Flagellar 모터에 대 한 세력을 운전으로 Nonequivalence
많은 세균성 종은 flagella를 사용 하 여 수영. Flagellar 모터는 회전을 세포질 막에 걸쳐 이온 흐름을 커플. 이온 흐름은 구동 두 막에 의해 잠재적인 (V(m)) 및 막 횡단 농도 그라데이션. 세균 flagellar 모터 기능을 그들의 관계를 조사 염료 tetramethyl rhodamine 메 틸 에스테 르를 사용 하 여 단일 셀의 v(m)를 측정 하는 형광 기술 개발. 세포와 세포내 염료 농도의 이미지에서 형광 강도 및 세포내 세포 외 염료 농도의 비율을 사용 하 여 계산 된 V(m) 사이의 관계를 확인 하려면 회선 모델을 사용 했습니다. 우리는 v(m)을 발견 + 14-140 = 외부 pH 7.0에서 대장균에 mV (pH(ex)), 10 + /-85를 감소 mV pH(ex) 5.0에. 우리는 또한 V(m) 및 세포내 나트륨 농도의 단일 셀 측정을 결합 하 여 나트륨 동기 포스 (SMF)를 추정 했다. 다를 15 ±-187 사이 SMF 수 Mv와 15 7.0 5.0 범위에서 다양 한 Ph(ex)에 의해 뮤직 비디오와 세포 외의 나트륨 농도 범위에서 ±-53 1-85 m m. 0.35 Microm-고 1-microm-직경 구슬의 회전 속도 Na (+)에 연결 된-선형 v(m)와 함께 다양 한 chimeric flagellar 모터를 구동. 큰 구슬에 대 한 특정된 SMF에 작은 구슬에 대 한 속도 나트륨 그라데이션 및 외부 나트륨 농도 함께 증가 하는 반면 SMF의 두 구성 요소는 동일 했다.
병원 성 대장균 OXPHOS 단지 플라즈마 멤브레인 내 전문된 영역에 집중?
대부분의 유기 체는 OXPHOS (산화 인 산화) 하 여 ATP를 합성 수 있습니다. 진핵생물의 미토 콘 드리 아 플라즈마 멤브레인 prokaryotes에서 사용 하는 반면 내부 미토 콘 드 리아 멤브레인의 OXPHOS를 수행 합니다. 그러나, OXPHOS은 생 화 학적 수준에서 개방적된 프로세스, 반면 상대적으로 조금 알려져 전체 트는/세포 수준에서의 작업에 대 한. 놓여있는지 이라는 터미널 산화 효소, 시 토 크롬 bd 복합물은 병원 성 대장균 플라즈마 멤브레인 배포 heterogeneously 관찰 합니다. 이 관찰 OXPHOS 구성 요소가 인접 한 멤브레인을 기준으로 해당이 영역에서의 높은 농도 의해 대장균 플라즈마 멤브레인 ('respirazones')의 호흡 기능을 전용 작업 가설의 기초를 형성 합니다. 수립 하 고이 가설의 생리 적의이 문서에 설명 되어 있습니다.
Vivo에서 단일 분자 이미징에 의해 관찰 된 트윈 아르기닌 단백질 수송 시스템의 타 타 구성 요소 변수 Stoichiometry
트윈-아르기닌 전 (Tat) 시스템 세균 세포질 막과 식물 chloroplasts thylakoid 막 걸쳐 접힌된 단백질을 수송 한다. 문신 통로의 필수 구성 요소는 막 단백질 타 타, TatB, 및 TatC. 타 타 문신 시스템의 요소를 translocating 단백질 형태로 생각 된다. 현재 모델 문신 전송에 대 한 타 타 및 전송 주기 동안이 상태가 변경 여부, 그리고 어떻게, oligomeric 상태에 대 한 예측을 만들. 우리는 개별 노란색 형광 단백질 표시 된 타 타 단지의 photophysical 분석 하 여 살아있는 세포에 있는 식의 네이티브 수준에서 직접 타 타 oligomeric 상태 결정. 타 타 단지 당 약 25 타 타 subunits의 평균 stoichiometries의 광범위 한 범위를 전시 하는 복합물을 형성 한다. Stoichiometry 분포의 푸리에 분석 복합물을 tetramer 단위에서 조립 하는 제안. 단지 확산 동작 모델링 그 타 타 protomers 반지와 하지 번들으로 연결 제안 합니다. 각 셀 포함 약 15 모바일 타 타 단지와 더에서 약 100 타 타 분자의 풀 분산 막의 상태. 문신 전송 드라이브 protonmotive 힘의 소모는 타 타 복잡 한 stoichiometry에 아무런 영향이 없습니다. TatBC, TatBC oligomeric 타 타 상태 제어 제안 부족 한 셀에서 타 타 단지 형성 하지 않습니다. 우리의 데이터 문신 전송 메커니즘에 대 한 타 타 합 모델을 지원 합니다.
클러스터링 및 시 토 크롬 Bd의 역학-난 단지 Vivo에서 병원 성 대장균 플라즈마 멤브레인에
시 토 크롬 bd-대장균의 복잡 한 호흡기 터미널 산화 효소 및 세포질 막의 필수 구성 요소입니다. 호흡 다른 구성 요소와 마찬가지로 조직 및 살아있는 세포 막에 있는 복잡 한 역학 알 수 있다. 우리 유통 및 in vivo의 복잡 한 역학 관계를 시각화 밖으로 설정 합니다. CydB cydB-gfpgcn4 대장균 염색체에 대 한 교환 하 여 우리 생산 기능 GFP 태그 시 토 크롬 bd를 표현 하는 스트레인 (YTL01)-난 야생-타입 유전자 제어 터미널 산화 효소 복합물. 우리 photobleaching (FRAP) 후 형광 복구와 함께에서 비디오 속도 epifluorescence 및 총 내부 반사 (TIRF) 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 YTL01 셀을 몇 군데 하 고 플라즈마 세포 막에서 GFP 형광의 모바일 관광 명소를 보았다. 자리 당 숫자의 GFP 분자 주는 광범위 한 분포를 평균으로 약 76의 시 토 크롬 bd를 나타내는 중대형 photobleaching에 의해 계량 했다-모바일 패치 대장균 플라즈마 멤브레인에 집중 된다. 우리는 호흡 'respirazones' 우리가 부르는 모바일 막 패치 발생 가설.
분자 브레이크, 아니 클러치, Rhodobacter Sphaeroides Flagellar 모터를 중지합니다
많은 세균성 종 수영 고용 이온 기반 분자 모터에 의해 그 힘 나선형 필 라 멘 트의 회전. 신호 chemotaxis 통로 통해 외부 환경에서 모터에 전송 됩니다. 양방향 모터에 모터에 phosphorylated CheY (CheY-P)의 바인딩 다른 방향으로 회전에 따른 다른 회전자를 고정자 인터페이스에서 발생 하는 구조적 변화를 추정 됩니다. 이 스위치에 발생 하는 경우을 제어 그들의 생존에 유리한 지역에서 축적 하는 박테리아 수 있습니다. 양방향 모터와 함께 수영을 하는 대부분의 종 달리 Rhodobacter sphaeroides 단일 정지 시작 flagellar 모터를 사용 합니다. 여기, 우리는 물었다, CheY P 중지 R. sphaeroides-클러치 또는 브레이크를 사용 하 여 모터의 바인딩은 어떻게 합니까? 점성 흐름 또는 광학 핀셋으로 외부의 힘을 적용 하 여 우리는 R. sphaeroides 모터 브레이크를 사용 하 여 중지 되었음을 보여줍니다. 모터에 27-28 이산 각도 정차 장소 상대적으로 높은 토크에 의해 약 2-3 번의 스 톨 토크.
Stoichiometry 및 대장균에서 활성 DNA 복제 기계 아키텍처
DNA를 복제 하는 복잡 한 multiprotein replisome 광범위 하 게 특징 되었습니다 체 외, 하지만 그 구성과 아키텍처 vivo에서 알 수 있다. 밀리초 단일 분자 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 형광 유도체 replisome 구성 요소를 표현 하는 살아있는 세포에서 우리 replisome stoichiometry 및 건축 검사 했습니다. 활성 Escherichia의 대장균 replisomes 들어 일차 효소의 세 분자 역사적으로 허용된 2. 이들은 3 분자의 타우, 효소 trimerizes 클램프 로더 구성 요소와 연결 합니다. 3 개의 슬라이딩 클램프의만 두는 항상 코어 replisome 연결 됩니다. 단일 스트랜드 바인딩 단백질은 핵심 구성 요소 replisome 당 5 11 tetramers와 함께 보다 광범위 한 공간적 분포. Vivo에서이 기술을 다른 분자 기계에 대 한 단일 분자 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Flagellar 세균의 신호 종속 회전율 단백질 FliM 전환
대부분의 생물학 프로세스 multiprotein 복합물에 의해 수행 됩니다. 전통적으로 정적 엔터티로 설명, 증거는 지금 신흥 그들의 구성 요소 매우 역동적인 셀룰러 풀과 지속적으로 교환 될 수 있습니다. 세균 flagellar 모터 약 13 다른 단백질 고 기능성 분자 단지 공부 하는 이상적인 시스템을 제공 합니다. 막 횡단 이온 플럭스 중앙 회전자에 고정자 단지의 고리에 의해 구동 됩니다. 병원 성 대장균 모터로 터 스위치 구성 요소 Flim에 바인딩 응답 레 귤 레이 터 Chey의에 대 한 응답 stochastically 방향 전환. 많은 정적 모터 구조 알려져 있지만 우리는 개별 부품의 역학을 이해 하기 시작 합니다. 여기 우리가 FliM 생리 적 수준에서의 genomically 인코딩된 YPet 파생 상품을 표현 하는 대장균의 고해상도 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 stoichiometry 및 작동 flagellar 모터에 Flim의 회전율을 측정. 우리는 모터 당 약 30 FliM 분자 모터와 다른 겪고 stochastic 회전율 밀접 하 게 연결 된 하나의 두 개의 개별 인구에 있는지 보여줍니다. FliM 분자의이 회전율 모터 전환 하는 잠재적인 역할 제안 활성 Chey의 존재 여부에 따라 달라 집니다. 여러 가지에서 상 고분자 어셈블리와 세균 flagellar 모터 이며 우리의 결과에 있을 수 있습니다 추가 단백질의 기능적 관련성에 대 한 의미 다른 큰 분자 단지.
기능성 분자 단지에 스포트 라이트를 빛나는: 단일-분자 세포 생물학의 새로운 과학
단일 분자 연구는 생물 과학 내에서 가장 빠르게 성장 하 고 있는 분야 중 하나로 떠오르고 있다. 역사적으로, 고용 기술 대부분 테스트 튜브는 조사를 받고 생물 학적 시스템의 구성 요소 추출 되었고 연구에서 중요 한 성분으로 그들을 줄이기 위해 셀에서 정화의 세계에서 주로 운영 하 고이 연구 참여 소설, 단일 분자 측정을 얻기 위해 생물 물리학의 개척 방법. 컨텍스트 즉 원시 생물 학적을 유지 하는 동안 지금 키 단일 분자 실험을 수행 하는 기술 능력은 최근에 무슨 나왔다 기능 살아있는 세포에 단일 분자 실험을 할. 이것은 본질적으로 현대 단 분자 생물 물리학과 고전 세포 생물학 접근을 결합 하는 "단일-분자 세포 생물학"의 새로운 과학 선물. 여기에서, 키 최근 연구는이 분야의 경계를 다시 밀어 설명 되어 있습니다.
작동 빠져나가기에 단일 분자 및 슈퍼 해상도 형광 이미지를 사용 하 여 살아있는 박테리아에 실시간
분자 기계 "설립된" 나노기술, 살아있는 세포의 기본적인 생화학 운전의 예입니다. 그들은 기능, 셀, 세포 이동성, 신호 변환 및 유전자 코드의 많은 다른 복제 내의 분자 구성 요소 전송 화학 프로세스에 대 한 연료 생성 등의 거 대 한 범위를 포괄 합니다. 대부분 이러한 나노미터 길이 규모 기계에 대 한 우리의 이해의 절연, 인공 조건에서 수행 하는 체 외 연구에서 왔다. 연구원은 지금 공부의 네이티브 환경에서 빠져나가기도 전에 태 클. 이 리뷰에서 우리는 최첨단 단일 분자 및 슈퍼 해상도 형광 현미경과 함께 하는 최신의 유전학 기술을 사용 하 여 모델 세균성 시스템에 빠져나가기에 최근 생체 조건 조사 개요. 우리는 단일 분자 및 슈퍼 해상도 형광 이미징 생물 학적 지지의 생 화 학적, 구조적 및 기능적 특성 분석을 위한 강력한 도구 제공 결론. 통합 공간적, 시간적, 및 단일 분자 데이터 동시에에서 얻은 형광 이미징 오픈 시스템 수준의 단일 분자 세포 생물 물리학 및 생체 조건 생화학에 대 한도.
