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Articles by Martin Distel in JoVE
JoVE Neuroscience
Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien
1Department of Biology, Pace University, 2Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Division of Cell Biology and Cell Physiology, Zoological Institute, Braunschweig University of Technology
Die zeitliche und räumliche Auflösung von genetischen Manipulationen bestimmt das Spektrum der biologischen Phänomene, die sie stören. Hier haben wir zeitlich und räumlich diskreten Einsatz
Other articles by Martin Distel on PubMed
Multicolor Zeitraffer In-vivo Bildgebung Bei Zellulären Auflösung Von Stereomikroskopie
Intravital Zeitraffer Bildgebung verändert erheblich viele langjährige Regeln der biologischen Mechanismen, aber der Apparat-intensive und aufwändige, Zeitraffer Bildgebung blieb meist auf spezialisierte Labors beschränkt. Wir zeigen, dass die kürzlich eingeführte, vollautomatischen Fluoreszenz Stereomikroskop kostengünstige aber mächtige Mittel der dynamische Ereignisse, die reichen aus der Beobachtung der Embryogenese über mehrere Tage detaillierte Gewebe Umlagerungen und schnelle Blutkörperchen Rollen in-vivo imaging darstellen. In Kombination mit Entwindung Ansätze kann sogar subzellulare Auflösung in mehreren Farben erzielt werden. Mit dreidimensionales Bild aufzeichnen, zeigen wir die räumliche Rekonstruktion der Muster. Darüber hinaus durch die Kombination von dreidimensionalen Bildes Erfassung im Zeitverlauf mit nachfolgenden Entwindung Analyse, beweisen wir, dass subzellulare Dynamik wie axonale Pathfinding aufgelöst werden kann. Diese Ergebnisse Versprechen, dass Time-Lapse Bildgebung mit einem Stereomikroskop wird eine praktische Standardmethode zum Phänotyp-Analyse in vielen Bereichen der Biologie.
Zeitraffer In-vivo Bildgebung Zebrafish Embryonale Entwicklung
INTRODUCTIONIntravital Time-Lapse Imaging ist eine leistungsfähige Technik für kontinuierliche Entwicklungsprozesse ohne fehlende entscheidende Ereignisse untersucht. Wegen der raschen Embryogenese, externe Entwicklung und Transparenz der Zebrafisch-Embryonen können ihre Entwicklungsprozesse im Zeitraffer Studien im Zusammenhang mit der lebende Organismus visualisiert werden. Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode zur Durchführung intravital Zeitraffer Bildgebung Zebrafish Embryos über mehrere Tage mit konfokale oder zusammengesetzte Stereomikroskope.
Ein Zebrafisch-Modell Der Tauopathie Kann In-vivo Bildgebung Neuronale Zelle Tod Und Drug Evaluation
Unsere alternde Gesellschaft ist mit einen dramatischen Anstieg von Patienten Tauopathien, die Alzheimer-Krankheit und bestimmte Frontotemporale Demenzen leiden konfrontiert. Diese Störungen sind charakterisiert durch typische Neuropathologische Läsionen einschließlich Hyperphosphorylation und anschließende Aggregation von TAU-Protein und neuronalen Zelltod. Derzeit sind keine Heilmittel Wirkmechanismen zur Verfügung. Wir generierten Leuchtstoff beschriftetem TAU transgene Zebrafisch, welche rasch Beteiligungsverfahren wichtigsten pathologischen Merkmale der Tauopathien, einschließlich Phosphorylierung und verändert sich die Form des menschlichen TAU-Protein, Bildung, neuronale verwickeln und Verhaltens Störungen und Zelltod. Zebrafisch-Larven eignen sich aufgrund ihrer optischen Transparenz und klein gut für in-vivo Bildgebung und Arzneimittelentwicklung. TAU-induzierte neuronalen Zelltod wurde durch in-vivo-Zeitraffer Mikroskopie abgebildet. Darüber hinaus wir dieses Zebrafisch-Modell verwendet, um Verbindungen gezielt die TAU Kinase Glykogen-Synthase Kinase 3beta identifizieren (GSK3beta). Wir identifiziert einen neu entwickelten hochaktiven GSK3beta-Hemmer, AR-534, durch rationale Wirkstoffdesign. AR-534 reduziert TAU Phosphorylierung in TAU transgene Zebrabärbling. Diese transgenen Zebrafisch-Modell kann ein wertvolles Instrument für weitere Studien von der Neuropathologie Demenz werden.
Lunatic Fringe Fördert Die Laterale Hemmung Der Neurogenese
Frühere Studien haben Rollen die Modulation der Notch-Aktivierung von Fringe Homologen Grenze Bildung und bei der Regulierung der Differenzierung der vertebrate Thymozyten und Drosophila Gliazellen identifiziert. Wir haben die Rolle der Lunatic Fringe (Lfng) Ausdruck während der Neurogenese in der vertebrate Neuralrohr untersucht. Wir finden, dass in der Zebrafisch-Hinterhirn Lfng ausgedrückt wird, von Vorläuferzellen in neurogene Regionen und Downregulated in Zellen, die neuronale Differenzierung eingeleitet haben. Lfng ist erforderlich Zelle autonom in neuronalen Epithelzellen die Begrenzung der Neurogenese und Vorläuferzellen instandzuhalten. Im Gegensatz dazu Lfng ist nicht erforderlich für die Rolle der Kerbe im interneuronales Schicksal Wahl, die wir zeigen werden vermittelt durch Notch1a. Der Ausdruck der Lfng erfordert keine Kerbe-Aktivität, sondern eher stromabwärts geregelt ist der Proneural-Gene, die weithin von neuronalen Vorläuferzellen exprimiert werden. Diese Forschungsergebnisse legen nahe, dass Lfng in einer Feedback-Schleife stromabwärts von Proneural Genen, die fungiert, durch die Förderung von Notch-Aktivierung, die Empfindlichkeit der Vorfahre, laterale Hemmung verwaltet und somit Grenzen Proneural Fehlregulation weiter.
Optimierte Gal4-Genetik Für Ständige Gen-Ausdruck-Zuordnung in Zebrafisch
Kombinatorische Genetik für bedingte Transgene Aktivierung ermöglicht Studium der Genfunktion mit zeitlichen und Gewebe spezifische Kontrolle wie das Gal4-UAS-System, das anspruchsvolle genetische Studien in Drosophila aktiviert hat. Vor kurzem wurde dieses System für Zebrafisch und vielversprechende Anwendungen eingeführt worden. Hier berichten wir eine konsequente Optimierung der Gal4-UAS Zebrafischgenetik durch die Einrichtung eines optimierten Gal4-Aktivator (KalTA4). Wir bieten quantitative Daten für Transgene KalTA4-vermittelte Aktivierung in Abhängigkeit von der UAS Kopie Zahlen zu ermöglichen die Untersuchung Dosierung Effekte von Transgenexpression. Einsatz eines Tol2 Transposon-vermittelte KalTA4 Vergrößerer Trap Bildschirms voreingenommen für zentrale Nervensystem Ausdruck, präsentieren wir eine Sammlung von Selbstauskunft rot fluoreszierende KalTA4 Aktivator Stämme. Diese Sorten transactivate UAS-abhängige transgene zuverlässig und können homozygot gerendert werden. Ferner haben wir die Transactivation-Kinetik der Gewebe-spezifischen KalTA4-Aktivierung gekennzeichnet führte zu die Entwicklung einer Wartung Effektor-Stamm "Kaloop." Diese Sorte betrifft vorübergehende KalTA4 Ausdruck während der Embryogenese über einen KalTA4-vermittelte Autoregulatory Erwachsene Strukturen zu leben. Wir zeigen, dass seine Verwendung zeigt, dass der sekundäre bestechen Kern in den Erwachsenen Hinterhirn wahrscheinlich von egr2b Ausdrücken Zellen in RH2 5 Stufen der frühen Embryogenese abgeleitet. Diese Daten zeigen verlängerte und gepflegt Ausdruck von Kalooping, eine Technik, die für permanente raumzeitliche genetische Schicksal Zuordnung genutzt werden und gezielte Transgenexpression im Zebrafisch.
Globale Unterdrückung Der Krebs-Gen-Ausdrucks in Einem Zebrafisch-Modell Des Melanoms Ist Mit Epigenetischen Verordnung Verbunden
Wir haben ein Modell der Melanom-Verlauf beim Zebrafisch durch die Erzeugung von transgenen Linien speziell Ausdrücken Onkogene menschlichen HRAS in der melanozytischer Linie etabliert. In diese Tumoren haben wir quantitative Expressionsanalyse von mehreren vermeintlichen Krebs-Genen aus bekannten und vorhergesagten Krebs gen Listen durchgeführt. Insbesondere analysierten wir 39 von 101 vermeintlichen Krebs-Gene identifiziert mit einem Bioinformatik-Ansatz und für die Niederfrequenz von Doppelarbeit und die hohe Konnektivität in Protein-Netzwerken ausgewählt. Daten, die von Real-Time Polymerase-Kettenreaktion-Analyse von Zebrafisch Melanom Gewebe zeigt, dass die Expression von vielen Krebs-Genen Downregulated in Zebrafisch Melanome, während nur Zellzyklus Gene herraufreguliert sind. Zu verstehen, ob dieser Trend aufgrund globaler Unterdrückung der Genexpression, die mit einem repressiven Chromatin-Zustand ist, wir untersucht, ob Änderungen der Histon-Methylierung in unserem Melanom-Modell nachweisbar waren. Wir fanden erhebliche Unterschiede bei der Höhe der H3K9me3, H4K20me2, H3K27me3, H3K4me3 und H3R2me2a Immunfärbung in Melanom-Gewebe im Vergleich zu normaler Haut. Unserer Analyse zufolge somit in unserem Modell, wie in menschlichen Melanom, wichtige Änderungen der Methylierung Status der Histone auftreten. Obwohl das Ergebnis dieser Änderungen noch unbekannt ist, könnte sie verantwortlich für die weltweite Unterdrückung der Genexpression durch epigenetische Regulierung, die in dieser Studie gezeigt.
Das Zentrosom Anhaltend Migration Führt Weder Bestimmt Die Seite Des Axonogenesis Bei Der Migration Neuronen In-vivo
Die Position des Zentrosom vor den Zellkern ist entscheidend für die Koordination der neuronalen Migration in die Entwicklungsbiologie Situationen betrachtet worden. Die Nähe der Zentrosom hat auch mit dem Gelände des Axonogenesis in bestimmten differenzierten Neuronen korreliert wurden. Trotz dieser positiven Korrelationen scheinen anzusammeln Experimentelle Befunde eine universelle Rolle der das Zentrosom in bestimmen, wo ein Axon-Formen oder in die Migration der Neuronen führt zu negieren. Um diese Kontroverse in eine in-vivo-Einstellung weiter zu untersuchen, haben wir die Zelle typspezifische Multi-cistronic Genexpression zum Überwachen der subzellulären Dynamik im entwickelnden Zebrafisch Kleinhirn generiert. Wir zeigen, dass die Migration von rhombische Lippe abgeleitete Neuronen ist gekennzeichnet durch ein Zentrosom, die nicht anhaltend des Zellkerns, führt aber die ist stattdessen regelmäßig von den Zellkern überholt. Darüber hinaus Axonogenesis initiiert wird, während der Beginn der neuronalen Migration und tritt unabhängig von Zentrosom Nähe. Diese in-vivo-Daten offenbaren eine neue zeitliche Orchestrierung Organell Dynamik und bieten wichtige Einblicke in die Variation im intrazellulären Prozesse während Wirbeltier-Gehirn-Differenzierung.
Kita Getrieben Ausdruck Der Onkogene HRAS Führt Zu Frühem Beginn Und Höchst Eindringprüfung Melanom Im Zebrafisch
Das Melanom ist die aggressivsten und tödlichen Form von Hautkrebs. Durch die zunehmende Häufigkeit und hoher Letalität von Melanom, Tiermodelle für die ständige Beobachtung der Melanom-Entstehung und Progression sowie für Tests pharmakologische Agenten benötigt werden.
Die Lange Abenteuerliche Reise Rhombische Lippe Zellen in Jawed Wirbeltiere: Eine Vergleichende Analyse Der Entwicklungsbiologie
Diesen Bericht fasst vertebrate rhombische Lippe und zerebelläre Werdegang über klassische Ansätze bis zu modernen Entwicklungsgenetik, die identifiziert die relevanten differenzielle Gen-Ausdruck-Domains und ihre Nachkommen. Die meisten dieser Informationen wird von Amnioten abgeleitet. Jedoch wurden in Anamniotes, insbesondere in der Zebrafisch, vor kurzem Fortschritte erzielt. Das aktuelle Bild zufolge rhombische Lippe und zerebelläre Entwicklung in jawed Wirbeltiere (Gnathostomes) viele Gemeinsamkeiten teilen. Zerebelläre Entwicklung, dazu gehören eine ptf1a Ausdruck ventralen zerebelläre Verbreitung (VCP) die zu Purkinje-Zellen und andere hemmende zerebelläre Zelltypen und ein atoh1 Ausdruck Ober rhombische Lippe zu einer externen Körnerschicht (EGL, d.h. exzitatorischen Untermodul Zellen) und eine frühe ventralen Migration in die vorderen Rhombencephalon (cholinergen Kernen). Wie bei der rhombischen Unterlippe (LRL) gehören Gnathostome Gemeinsamkeiten wahrscheinlich die Bildung von precerebellar Kernen (moosigen Faser Herkunft) und teilweise primären auditorischen Kerne (wahrscheinlich um entwickelt) aus der atoh1 auszudrücken-dorsal-Zone. Das Schicksal der ptf1a Ausdruck ventralen LRL-Zone, welche Ölrenten (exzitatorischen Zellen) der minderwertigen Olive (Klettern Faser Herkunft) und (hemmenden Zellen) cochlear Kerne in Amnioten, nicht in Anamniotes festgestellt wurde. Besondere für die Zebrafish im Vergleich zu Amnioten vorherrschende stammt aus Anamniote exzitatorischen tief zerebelläre Kerne UCP1 (d.h., Eurydendroid Zellen) von ptf1a Ausdrücken VCP Zellen, die sequenzielle Aktivität der verschiedenen atoh1-Paralogs und die unvollständige Berichterstattung der Subpial zerebelläre Platte mit proliferativen Zellen der EGL. Dennoch, der Abschluss, den eine rhombische Lippe und seine wichtigsten Derivate mit Gnathostome Wirbeltiere nur entwickelt und sind daher nicht, dass ein uralte craniate Charakter komplexe durch das Fehlen einer Kleinhirn (und wahrscheinlich fehlen die afferente und efferente Kerne) unterstützt wird in den Neunaugen Fischen.
In-vivo-Zellbiologie Mit Gal4-vermittelte Mehrfarbigen Subzellulare Kennzeichnung Im Zebrafisch
Das Verhalten einer Zelle wird durch das Zusammenspiel seiner subzelluläre Komponenten bestimmt. So könnte in der Lage, gleichzeitig mehrere Organellen innerhalb der Zellen im natürlichen Rahmen eines Lebewesens zu visualisieren unser Verständnis der Entwicklungsprozesse erheblich verbessern. Wir haben eine Gal4-basiertes System für die gleichzeitige und Zelle Typ spezifischen Ausdruck mehrere subzellulare Etiketten in den transparenten Zebrafish Embryos festgelegt. Dieses System bietet die Möglichkeit, intrazelluläre Entwicklungsprozesse im Leben vertebrate Organismus mit Zeitraffer konfokale Fluoreszenzmikroskopie zu folgen. Mit diesem Ansatz, wir haben kürzlich gezeigt, dass das Zentrosom anhaltend Migration führt weder die Seite des Axonogenesis bei der Migration bestimmt, Neuronen im Zebrafisch Kleinhirn in-vivo. Hier stellen wir zusätzliche in-vivo-Befunde über die centrosomal und Microtubule Dynamik von Gliazellen Zellen während mitotische Konfliktlinien im Frühstadium Neuralrohr.
Automatisierte Reporter Quantifizierung In-vivo: Hochdurchsatz-screening-Methode Für Reporter Basierende Assays Im Zebrafisch
Reporter-basierte Assays zugrunde liegen viele Hochdurchsatz-screening (HTS) Plattformen, aber die meisten sind auf in-vitro-Anwendungen beschränkt. Hier berichten wir über eine einfache ganz-Organismus-HTS-Methode zur Quantifizierung von Änderungen in der Intensität der Reporter in einzelnen Zebrafisch im Laufe der Zeit genannt, automatisierte Reporter Quantifizierung in-vivo (ARQiv). ARQiv unterscheidet sich von der aktuellen "High-Content" (z.B., konfokale Darstellung-gegründete) ganze-Organismus screening-Technologien durch einen rein quantitativen Daten Akquisition Ansatz, die deutliche Verbesserungen im Durchsatz bietet. ARQiv verwendet ein Fluoreszenz-Mikroplatten mit spezifischen Nachweis Funktionalitäten für robuste Quantifizierung der Reporter Signale in-vivo notwendig. Dieser Ansatz ist: 1) Rapid; wahre HTS-Kapazitäten zu erreichen (d. h. > 50.000 Einheiten pro Tag), 2) reproduzierbare; HTS-kompatiblen Assay Qualität zu erreichen (d. h. Z'-Faktoren von ≥0), und 3) flexibel; Parallelisierung auf nahezu jedem Reporter-gegründeten Probe im Zebrafisch-Embryonen, Larven oder Jungtiere. ARQiv wird hier verwendet, um Änderungen zu quantifizieren: 1) Handy-Nummer; Verlust und Regeneration von zwei verschiedenen Leuchtstoff markiert Zelltypen (pankreatischen Betazellen und Stab Photorezeptoren), 2) Zelle signalisieren; Zellstoffwechsel relative Aktivität von transgenen Notch-Signalisierung Reporter und 3); Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies. Zusammenfassend lässt sich sagen ist ARQiv ein vielseitig und leicht zugänglichen Ansatz, die Bewertung der genetischen und/oder chemischen Manipulationen in lebenden Zebrafisch, das aktuelle "High-Content" ganz-Organismus Screening-Methoden ergänzt durch eine erst-Reihe in-vivo HTS Droge Entdeckung Plattform zu erleichtern.
