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Articles by Martin Distel in JoVE
JoVE Neuroscience
組み合わせることを使用してターゲットと嗅球の神経細胞インビボでのエレクトロポレーションとGAL4ベースエンハンサートラップゼブラフィッシュの行
1Department of Biology, Pace University, 2Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Division of Cell Biology and Cell Physiology, Zoological Institute, Braunschweig University of Technology
遺伝子操作の時間的および空間的分解能は、彼らがかき乱すことができる生命現象のスペクトルを決定します。ここでは、時間的空間的に離散的な使用
Other articles by Martin Distel on PubMed
多色の in Vivo タイムラプス イメージング実体による細胞の分解能。
生体タイムラプス イメージングの生物学的メカニズムの大幅に多くの長年の規則を変えたが、装置激しいと骨の折れるされて、タイムラプス イメージング主専門のラボに制限されて残った。私達は最近導入された、完全に自動化された蛍光生理動的イベントの詳細な組織再編成と in vivo 圧延高速血球に数日以上の胚発生の観察からに至るまでのイメージングの費用対効果が強力な意味を表すことを示します。デコンボリューションのアプローチを組み合わせると、いくつかの色でさえ細胞レベル下の解像度を実現できます。3次元画像の記録を用いて, 発現パターンの空間復元を示します。軸索の草分けに解決できるようさらに、後続のデコンボリューション解析を時間をかけて録音三次元画像を組み合わせることにより、我々 その細胞内動態を実証します。これらの調査結果は、実体顕微鏡によるタイムラプス イメージング生物学の多くの分野における表現型解析のハンズオンの標準の方法になるだろうと約束します。
ゼブラフィッシュ胚の in Vivo のタイムラプス イメージング。
INTRODUCTIONIntravital タイムラプス イメージングは、重要なイベントを逃すことがなく連続的な発達過程を調査するために強力な手法です。急速な胚では、外部の開発、およびゼブラフィッシュ胚の透明性のため、生きている有機体のコンテキストにおけるコマ撮り研究の発達過程を視覚化できます。次のプロトコルはゼブラフィッシュ胚の生体のタイムラプス イメージングを用いた共焦点または化合物の生理の数日間を実行する方法について説明します。
Tauopathy ゼブラフィッシュ神経細胞死と薬評価の in Vivo イメージングできます。
高齢化社会は特定前頭側頭型痴呆とアルツハイマー病を含めるタウオパチーから苦しんでいる患者の劇的な増加に直面しています。これらの疾患は、タウとタウ蛋白と神経細胞死の後続の集計を含む典型的な神経病理学的病変によって特徴付けられます。現在、利用可能なメカニズム ベースの治療法はありません。我々 は人間のタウ蛋白リン酸化と構造変化を含むタウオパチーの急速に recapitulated キー病理学的機能形成、神経昆布蛍光に分類されたタウ トランスジェニックゼブラフィッシュと行動障害と細胞死を生成しました。彼らの光透過性と小さなサイズのために、ゼブラフィッシュの幼虫は in vivo イメージングや医薬品開発のために適しています。タイムラプス顕微鏡法による in vivo タウ性神経細胞死をイメージしました。さらに、このゼブラフィッシュ モデル タウ キナーゼ グリコーゲン合成酵素キナーゼ 3 β ターゲット化合物を識別するために使用される (GSK3beta)。我々 は、新開発の高活性の GSK3beta 阻害剤識別 AR-534 合理的な薬剤設計によって。AR 534 リン酸化タウ タウ トランスジェニックゼブラフィッシュの削減。このトランスジェニックゼブラフィッシュ モデルは認知症の神経病理学のさらなる研究のための貴重なツールになる可能性があります。
狂気フリンジ側抑制の神経新生を促進します。
以前の研究 notch の変調の役割フリンジ同族体境界形成と脊椎動物の胸腺細胞とショウジョウバエ グリア細胞分化の調節によって同定しました。脊椎動物の神経管における神経新生の中に狂気フリンジ （Lfng） 式の役割を調べた。Lfng の神経因性領域の前駆細胞と神経分化を開始した細胞における downregulated によるゼブラフィッシュの逃避で、単位があることを見つけます。Lfng は、必要なセル自律神経上皮細胞神経新生の量を制限し、前駆細胞を維持するのです。対照的に、Lfng が介在ニューロンの運命選択におけるノッチの役割は必要ありません私たちを示す Notch1a によって媒介されます。Lfng の発現 Notch の活性を必要としないが、むしろ下流に規制されて広く神経前駆細胞によって表現される proneural 遺伝子の。Lfng は、ノッチの活性化を促進することによって側抑制する前駆細胞の感度を維持するフィードバック ループで下流の proneural 遺伝子の機能し、制限 proneural のアップレギュレーションにさらに示唆されました。
ゼブラフィッシュにおける永久的な遺伝子発現マッピング Gal4 遺伝学を最適化しました。
条件付き transgene の活性化のための組合せの遺伝遺伝子機能と時間を勉強でき、組織の特定のコントロールのようにショウジョウバエの洗練された遺伝学が有効になっている、Gal4 UAS システム。最近このシステムは、ゼブラフィッシュを適応され、の有望なアプリケーションを導入しています。ここでは、我々 ゼブラフィッシュ Gal4 UAS の遺伝学の体系的な最適化、最適化された Gal4 アクティベーター (KalTA4) を確立することによって報告する.導入遺伝子発現の投与効果を勉強するため許可する UAS コピー数依存性の KalTA4 を介した transgene の活性化のための定量的なデータを提供します。中枢神経系の式をバイアス Tol2 トランスポゾンを介した KalTA4 エンハンサー トラップ画面を採用し、系統に自己申告のコレクション赤い蛍光 KalTA4 アクティベーターを提示します。これらの菌株は確実に UA 依存 transgenes transactivate し、ホモにレンダリングすることができます。さらに、我々 の自動メンテナンス エフェクターひずみ"Kaloop"の開発につながった組織固有の KalTA4 活性化は、転写活性化動力学を特徴があります。このひずみ過渡 KalTA4 式胚ライブ大人の構造に多 KalTA4 を介するメカニズムを介して関連しています。我々 初期胚の段階 egr2b 発現細胞内 rhombomere 5 から派生したセカンダリ octaval 核大人の菱脳の可能性があることを示すことによってその使用をデモンストレーションします。これらのデータは、長期、維持式 Kalooping、恒久的な時空間の遺伝学的運命マッピングに使用することができますおよび対象とするゼブラフィッシュ導入遺伝子発現手法によってをデモンストレーションします。
グローバル抑圧悪性黒色腫のゼブラフィッシュ モデルにおける癌遺伝子発現のエピジェネティック制御にリンクされています。
ゼブラフィッシュ具体的に発癌性人間の HRAS メラニン細胞性系統を表現する遺伝子組換えの行の世代を介して悪性黒色腫の進行のモデルを確立しています。これらの腫瘍で知られていると予測癌遺伝子リストからいくつかの推定がん遺伝子の定量的発現解析を行っています。特に、39 のうち 101 推定がん遺伝子バイオインフォマティクス アプローチで識別され、低周波の重複やタンパク質ネットワークの高い接続のために選択を分析しました。のみ細胞周期遺伝子発現亢進があるに対しゼブラフィッシュ悪性黒色腫の組織からのリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応分析によって得られたデータは多くの癌遺伝子発現 downregulated ゼブラフィッシュ黒色腫であることを示しています。この傾向はグローバルの抑圧は抑圧的なクロマチンの状態に関連付けられている遺伝子発現の原因かどうかを理解するには、ヒストンのメチル化の変化が悪性黒色腫モデルで検出されたかどうかを調べた。正常な皮膚と比較するとメラノーマの組織のレベル H3K9me3、H4K20me2、H3K27me3、H3K4me3、および H3R2me2a の免疫染色で実質的な相違を発見しました。したがって我々 の分析モデルでは、ようなひと悪性黒色腫での重要な変更はヒストンのメチル化状態に発生こと示唆しています。これらの変更の結果はまだ不明ですが、彼らは遺伝子発現のエピジェネティック制御研究ではこの表示を通してグローバル抑圧担当する可能性があります。
中心体もしつこく移行につながるも移行する Axonogenesis のサイトを決定します in Vivo でニューロン。
中心体前核の位置は、神経の移行最も発達状況を調整するために重要な考えられています。中心体の近接は、また axonogenesis 差別化ニューロンに特定のサイトと相関しています。これらの肯定的な相関関係にもかかわらず、中心体軸索フォームの場所を決定するまたはニューロンの移行をリードでの普遍的な役割を否定する蓄積実験調査結果が表示されます。さらにこの論争的 in vivo での設定を確認するには、ゼブラフィッシュ小脳における細胞内ダイナミクスを監視するセル型固有のマルチ cistronic 遺伝子発現を生成しています。私達は移行リップ由来のニューロンの菱形の永続的、核を導かない、中心体によって特徴付けられることを示すが、これは代わりに定期的に追い越さによる核。さらに、axonogenesis は神経細胞移動の発症時に開始され中心体近接とは無関係に発生します。これらの in vivo でのデータ オルガネラ ダイナミクスの新しい一時的なオーケストレーションを明らかにし、細胞内のプロセスの変動の脊椎動物の脳の分化過程に重要な洞察を提供します。
早期発症と高浸透黒色腫ゼブラフィッシュ駆動式発癌 HRAS の北に します。
悪性黒色腫皮膚癌の最も積極的で致命的な形態です。増加率のため、高致死性黒色腫、悪性黒色腫の形成とに関しては、薬理学的エージェントをテストするための進行を継続的に観察のための動物モデルが必要です。
菱形唇顎脊椎動物のセルの長い冒険の旅: 発達の比較分析。
このレビューでは、脊椎動物の菱形リップと古典的なアプローチ関連の差動遺伝子発現ドメインと彼らの子孫を識別する現代の発生遺伝学までをカバーする初期の小脳開発をまとめたものです。この情報のほとんどは羊膜から派生します。しかし、進歩、ゼブラフィッシュでは特に anamniotes では最近なされました。現在の画像菱形リップと脊椎動物 （gnathostomes） における小脳の開発多くの特性を共有することを示唆しています。小脳の開発に関するこれらプルキンエ細胞と他抑制性小脳のセルタイプに上昇を与えて、ptf1a 表現する腹側小脳増殖 (VCP) や atoh1 表現する菱形上唇が外顆粒層 (EGL、すなわち、興奮性顆粒細胞） に上昇を与えていると、早期の腹側移行前方菱脳 (コリン作動性核） に。菱形下唇に関しては （LRL）、gnathostome 共通点可能性が高い precerebellar 核 （苔状線維起源） と （おそらく convergently 進化） 部分的に一次聴覚核の形成 atoh1 表現する背側ゾーンからがあります。（興奮性の細胞) に生じ腹側の LRL ゾーンを表現する、ptf1a の運命 （登山） 繊維の起源下オリーブと羊膜で （の抑制性細胞） 蝸牛神経核が決定されていない anamniotes で。ゼブラフィッシュ羊膜と比較して （すなわち、キンギョ細胞） ptf1a からホモログ anamniote の興奮性深い小脳核の優勢の起源のために特別な VCP 発現細胞、様々 な atoh1 パラログのシーケンシャル アクティビティと軟小脳プレート増殖 EGL のセルとの不完全な報道。それにもかかわらず、結論は菱形の唇とその主要誘導体 gnathostome の脊椎動物でのみ進化しこうして、先祖代々 の craniate 文字の複雑なは小脳の不在 (とその求心性および遠心性核の可能性がないこと) によってサポートされて無顎魚類のではないです。
Gal4 を介した多色細胞レベル下のゼブラフィッシュ ラベリングを用いた in Vivo の細胞生物学。
セルの動作は、その細胞内のコンポーネントの相互作用によって決定されます。したがって、同時にいくつかのオルガネラ細胞生物の生活の自然のコンテキスト内で内部を可視化することは大きく発達過程の理解を高めることができます。私達は透明ゼブラフィッシュ胚における Gal4 ベースのシステムが同時に、複数の細胞レベル下のラベルの細胞型特異的発現を確立しました。このシステムは共焦点蛍光タイムラプス顕微鏡によるライブ脊椎動物の生物の細胞内の発達過程に従ってする機会を提供しています。我々 は最近中心体もしつこく移行につながるも移行する axonogenesis のサイトを決定することを示したこのアプローチを使用する in vivo でのゼブラフィッシュ小脳におけるニューロン。ここでは神経管の初期段階での細胞分裂の劈開中上皮細胞の細胞の centrosomal および微小管ダイナミクスについての追加の in vivo 所見を提示します。
In Vivoで自動化されたレポーターの定量化：ゼブラフィッシュにおけるレポーターベースのアッセイのためのハイスループットスクリーニング法
レポーターベースのアッセイは、多くのハイスループットスクリーニング（HTS）プラットフォームの根底にあるが、ほとんどは、in vitroアプリケーションでに制限されています。ここでは、in vivoで呼ばれる、自動化されたレポーターの定量（ARQiv）時間をかけて個々のゼブラフィッシュのレポーター強度の変化を定量化するための簡単な全体の生物HTS法を報告します。 ARQivは、スループットの著しい改善が得られる純粋に定量的なデータ収集のアプローチを提供することにより、現在の "高含有量"（例えば、共焦点イメージングベース）の全生物のスクリーニング技術は異なります。 ARQivは、in vivoレポーター信号の堅牢な定量化のために必要な特異的検出の機能と蛍光マイクロプレートリーダーを使用しています。このアプローチは、次のとおりです。1）迅速、再現性の真のHTS容量（すなわち、一日あたり> 50,000台）、2）を達成、HTS-互換性のあるアッセイの品質を達成する（すなわち、≥のZ'-因子0.5）、3）柔軟な、従順ゼブラフィッシュ胚、幼虫、または少年のほぼすべてのレポーターベースのアッセイに。 ARQivは変化を定量化するためにここで使用されます：1）細胞数、2つの異なる蛍光標識細胞型（膵β細胞と桿体）の損失と再生、2）細胞シグナリング、トランスジェニックノッチシグナリングレポーターの相対活性、および3 ）細胞の代謝、活性酸素種の蓄積。要約すると、ARQivは、in vivo HTS創薬プラットフォームの最初の層を提供することによって、現在の "高コンテンツ"全生物のスクリーニング方法を補完する生活ゼブラフィッシュの遺伝的および/または化学的操作の評価を容易にする汎用性と容易にアクセス可能なアプローチです。
