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Articles by Martin Distel in JoVE
JoVE Neuroscience
Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra
1Department of Biology, Pace University, 2Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Division of Cell Biology and Cell Physiology, Zoological Institute, Braunschweig University of Technology
La resolución temporal y espacial de las manipulaciones genéticas determina el espectro de los fenómenos biológicos que puedan perturbar. Aquí usamos temporal y espacialmente discretos
Other articles by Martin Distel on PubMed
Imágenes De Time-lapse En Vivo Multicolor En Resolución Celular Por Estereomicroscopio
Proyección de imagen de time-lapse intravital ha alterado significativamente muchas reglas de larga data de mecanismos biológicos, pero ser aparatos-intenso y laborioso, proyección de imagen de time-lapse sobre todo permaneció restringido a laboratorios especializados. Mostramos que recientemente introducido, totalmente automatizada de la fluorescencia Estereomicroscopio representa rentables pero poderosos medios de proyección de imagen dinámicas eventos que van desde la observación de embriogénesis durante varios días a reordenamientos de tejido detallada y rápido del glóbulo balanceo in vivo. Cuando se combina con enfoques de deconvolución, se logra la resolución incluso subcelular en varios colores. Usando la grabación de imagen tridimensional, mostramos la reconstrucción espacial de patrones de expresión. Además, combinando la imagen tridimensional de grabación con el tiempo con análisis posterior deconvolución, demostramos eso dinámica subcelular como axonal pathfinding puede resolverse. Estos resultados prometen que time-lapse proyección de imagen usando un Estereomicroscopio se convertirá en un práctico método estándar para el análisis del fenotipo en muchos campos de la biología.
Imagen in Vivo De Time-lapse De Desarrollo Embrionario Del Pez Cebra
INTRODUCTIONIntravital proyección de imagen de Time-Lapse es una técnica poderosa para investigar los procesos de desarrollo continuos sin falta acontecimientos cruciales. Debido a la rápida embriogénesis, desarrollo externo y transparencia de embriones de pez cebra, sus procesos de desarrollo pueden visualizarse en time-lapse estudios en el contexto de un organismo vivo. El siguiente protocolo describe un método para realizar imágenes de time-lapse intravital de embriones de pez cebra durante varios días con Estereomicroscopio confocal o compuesto.
Un Modelo De Pez Cebra De Tauopathy Permite Imagen in Vivo De La Evaluación De Muerte Y De La Droga De Células Neuronales
Nuestra sociedad que envejece se enfrenta a un dramático aumento de pacientes que sufren de tauopatías, que incluyen la enfermedad de Alzheimer y ciertas demencias frontotemporales. Estos trastornos se caracterizan por lesiones neuropathological típicas incluyendo hiperfosforilación y posterior agregación de la proteína TAU y muerte celular neuronal. Actualmente, no hay curas basado en mecanismos están disponibles. Generamos fluorescencia etiquetada zebrafish transgénico TAU, que rápidamente recapitulated características patológicas principales de tauopatías, incluyendo fosforilación y cambios conformacionales de la proteína TAU humana, enredan formación, neuronal y disturbios del comportamiento y muerte celular. Debido a su transparencia óptica y tamaño pequeño, las larvas de pez cebra están bien adaptadas para la imagen in vivo tanto en el desarrollo de fármacos. Muerte celular neuronal inducida por TAU era reflejada por microscopia time-lapse en vivo. Además, utilizamos este modelo de pez cebra para identificar compuestos contra el TAU quinasa glucógeno sintasa quinasa 3beta (GSK3beta). Identificamos un inhibidor de GSK3beta altamente activo desarrollado recientemente, AR-534, por diseño racional de medicamentos. AR-534 redujo la fosforilación del TAU en el pez cebra transgénico TAU. Este modelo de pez cebra transgénico puede convertirse en una valiosa herramienta para estudios posteriores de la neuropatología de la demencia.
Lunático Promueve La Inhibición Lateral De La Neurogénesis
Estudios previos han identificado papeles de la modulación de la activación de la muesca por homólogos de Fringe en formación de límites y en la regulación de la diferenciación de los timocitos vertebrados y Drosophila glía. Hemos investigado el papel de expresión lunático (Lfng) durante la neurogénesis en el tubo neural vertebrado. Encontramos que en el cerebelo de pez cebra, Lfng se expresa por progenitores en regiones neurogénicas y regulada en las células que han iniciado la diferenciación neuronal. Lfng es necesaria célula autónomamente en células epiteliales neurales para limitar la cantidad de la neurogénesis y mantener progenitores. Por el contrario, no se requiere para el papel de la muesca en la elección de destino interneuronal, el Lfng que les mostramos es mediada por Notch1a. La expresión de Lfng no requiere actividad Notch, pero algo se regula aguas abajo de los genes proneurales que expresan ampliamente por progenitores neuronales. Estos resultados sugieren que Lfng actúa en un circuito de retroalimentación aguas abajo de los genes proneurales, que, al promover la activación de la muesca, mantiene la sensibilidad de los progenitores a inhibición lateral y así límites más upregulation proneurales.
Genética De Gal4 Optimizado Para El Mapeo De Expresión Del Gen Permanente En Pez Cebra
Combinatoria genética para la activación del transgen condicional permite estudiar la función del gen con temporal y control específico de tejido como el sistema Gal4-UAS, que ha permitido sofisticados estudios genéticos en Drosophila. Recientemente, este sistema fue adaptado para el pez cebra y aplicaciones prometedoras se han introducido. Aquí, Divulgamos una optimización sistemática de pez cebra Gal4-UAS genética mediante el establecimiento de un Gal4 optimizado-activador (KalTA4). Proporcionamos datos cuantitativos para la activación mediada por KalTA4 transgen en dependencia de la UAS números de copia para permitir estudiar los efectos de dosis de la expresión del transgén. Empleando una Tol2 mediada por transposones KalTA4 potenciador trampa pantalla predispuesta para la expresión del sistema nervioso central, presentamos un activador de KalTA4 fluorescente colección de autoinforme rojo cepas. Estas cepas confiablemente transactivate transgenes UAS-dependiente y pueden pensarse homocigóticas. Además, hemos caracterizado la cinética de la transactivación de la activación de la KalTA4 de tejidos específicos, que condujo al desarrollo de una cepa de efector disponibilidad "Kaloop." Esta variedad refiere a la expresión transitoria de KalTA4 durante la embriogénesis mediante un mecanismo mediado por KalTA4 hay vivir estructuras adultos. Demostramos su uso mostrando que es probable que el núcleo octaval secundario en el cerebelo adultos derivados de células egr2b-expresión en rhombomere 5 durante las etapas de la embriogénesis temprana. Estos datos demuestran la expresión prolongada y mantenida por Kalooping, una técnica que puede ser utilizada para la asignación de destino genético espacio-temporal permanente y dirigido la expresión del transgén en pez cebra.
Represión Global De La Expresión Génica De Cáncer En Un Modelo De Pez Cebra Del Melanoma Está Relacionada Con La Regulación Epigenética
Hemos establecido un modelo de progresión de melanoma en el pez cebra a través de la generación de líneas transgénicas expresando específicamente HRAS humanos oncogénicos en el linaje melanocítico. Hemos realizado análisis de la expresión de varios genes putativos de cáncer, de listas de gen de cáncer conocidos y previstos en estos tumores. En particular, se analizaron 39 de 101 genes putativos cáncer identifican con un enfoque de Bioinformática y seleccionaron para la baja frecuencia de la duplicación y la alta conectividad en redes de proteínas. Datos obtenidos por el análisis de la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real de tejido de pez cebra melanoma demuestran que la expresión de muchos genes de cáncer es regulada en los melanomas de pez cebra, Considerando que sólo genes del ciclo celular se alza. Para entender si esta tendencia se encuentra en represión global de la expresión génica asociado a un estado represivo de la cromatina, investigamos si cambios de metilación de histonas eran perceptibles en nuestro modelo de melanoma. Encontramos diferencias sustanciales en los niveles de inmunotinción H3K9me3, H4K20me2, H3K27me3, H3K4me3 y H3R2me2a en tejido de melanoma en comparación con la piel normal. Por lo tanto, nuestro análisis sugiere que en nuestro modelo, como en melanoma humano, importantes cambios en el estatus de metilación de histonas. Aunque el resultado de estos cambios es todavía desconocido, podrían ser responsables de la represión global de la expresión génica a través de la regulación epigenética que se muestra en este estudio.
El Centrosoma Persistentemente Conduce Migración Ni Determina El Sitio De Axonogenesis En La Migración De Neuronas En Vivo
La posición del centrosoma por delante el núcleo ha sido considerada crucial para coordinar la migración neuronal en situaciones más desarrollo. La proximidad del centrosoma también se ha correlacionado con el sitio de axonogenesis en ciertas neuronas diferenciadoras. A pesar de estas correlaciones positivas, acumulando resultados experimentales parecen negar un papel universal del centrosoma en determinar donde la forma de un axón, o en la dirección de la migración de neuronas. Para seguir examinando esta controversia en un ambiente in vivo, hemos generado células específicas del tipo multi-cistrónicos genes para monitorear subcelular dinámica en el cerebelo de pez cebra en desarrollo. Demostramos que la migración de neuronas derivadas de labio rómbicas se caracteriza por un centrosoma que no lleva persistentemente el núcleo, pero en su lugar que regularmente es superado por el núcleo. Además, axonogenesis se inicia durante el inicio de la migración neuronal y ocurre independientemente de la proximidad del centrosoma. Estos datos in vivo revelan una nueva orquestación temporal de dinámica de organelas y proporcionan penetraciones importantes en la variación de procesos intracelulares durante la diferenciación del cerebro de vertebrados.
Kita Impulsado Por La Expresión De HRAS Oncogénicos Conduce a Inicio Temprano Y Melanoma Altamente Penetrante En Pez Cebra
El melanoma es la forma más agresiva y letal de cáncer de piel. Debido a la creciente incidencia y alta mortalidad del melanoma, modelos animales para observar continuamente la formación de melanoma y progresión así como pruebas de agentes farmacológicos son necesarios.
El Viaje Largo Adventurero De Células Del Labio Rómbico En Vertebrados Jawed: Un Análisis Comparativo Del Desarrollo
Esta revisión resume labio rómbico vertebrado y temprano desarrollo cerebeloso que abarca enfoques clásicos hasta genética del desarrollo moderno que identifica los dominios de expresión génica diferencial relevante y su progenie. La mayoría de esta información se deriva de amniotes. Sin embargo, en Anamniota, particularmente en el pez cebra, recientemente progresos. El cuadro actual sugiere que el labio rómbico y desarrollo cerebeloso en vertebrados jawed (gnathostomes) comparten muchas características. En cuanto a desarrollo cerebeloso, estos incluyen una ptf1a expresando ventral cerebelosa proliferación (VCP) dando lugar a células de Purkinje y otros tipos de células cerebelosas inhibitorio, y dando lugar a una capa granular externa (EGL, es decir, células del gránulo excitatorio) del labio superior expresando atoh1 rombal y una temprana migración ventral en el rombencéfalo anterior (núcleos colinérgicos). En cuanto al labio rómbico inferior (LRL), similitudes gnathostome probable que incluyen la formación de núcleos precerebellar (orígenes de musgo de fibra) y parcialmente principales núcleos auditivos (probablemente convergently evolucionados) de la zona dorsal expresando atoh1. El destino de la ptf1a expresando la zona ventral de LRL que da lugar a (células excitatorias de) la aceituna inferior (escalada el origen de la fibra) y núcleos cocleares (células inhibidoras de) en amniotas, no ha sido determinada en Anamniota. Especial para el pez cebra en comparación con los amniotas es el origen predominante de homólogos de núcleos cerebelosos profundos excitatorio anamniote (es decir, células de eurydendroid) de ptf1a expresando VCP células, la actividad secuencial de varios atoh1 paralogs y la cobertura incompleta de la placa cerebelosa subpial con las células proliferativas de EGL. Sin embargo, la conclusión de que un labio rómbico y sus derivados principales evolucionaron con gnathostome vertebrados sólo y no son así que un carácter ancestral de craniate complejo es apoyado por la ausencia de un cerebelo (y probable ausencia de sus núcleos aferentes y eferentes) en peces agnatos.
Biología De Células in Vivo Usando Mediada Por Gal4 Subcelular Etiquetado Multicolor En Pez Cebra
El comportamiento de una célula es determinado por la interacción de sus componentes subcelulares. Así, pudiendo visualizar simultáneamente varios organelos dentro de las células dentro del contexto natural de un organismo vivo podría mejorar nuestra comprensión de los procesos de desarrollo. Hemos establecido un sistema Gal4 para la simultánea y la expresión específica de tipo de célula de varias etiquetas subcelulares en embriones de pez cebra transparente. Este sistema ofrece la oportunidad de seguir los procesos de desarrollo intracelulares en un organismo vivo de vertebrados con time-lapse de microscopía de fluorescencia confocal. Utilizando este enfoque recientemente demostramos que el centrosoma persistentemente conduce migración ni determina el sitio de axonogenesis en la migración de neuronas en el cerebelo de pez cebra en vivo. Aquí presentamos resultados in vivo adicionales sobre la dinámica centrosómicas y microtúbulos de células neuroepiteliales durante las divisiones mitóticas en las primeras etapas del tubo neural.
La Cuantificación Automatizada De Reportero En Vivo: De Alto Rendimiento Basados en El Método De Detección De Periodista-Los Ensayos En El Pez Cebra
Basados en ensayos de reportero-la base de muchas de cribado de alto rendimiento (HTS) las plataformas, pero la mayoría se limitan a aplicaciones in vitro. Aquí, se presenta un sencillo de todo el organismo, método de HTS para cuantificar los cambios en la intensidad de reportero en el pez cebra individuo con el tiempo llamado, cuantificación automatizada de Reportero en vivo (ARQiv). ARQiv difiere de la actual "alto contenido" (por ejemplo, confocal de imágenes basado en) todo el organismo, las tecnologías de detección, proporcionando un enfoque puramente cuantitativo de adquisición de datos que ofrece notables mejoras en el rendimiento. ARQiv utiliza un lector de microplacas de fluorescencia con funcionalidades de detección específicos necesarios para la cuantificación de las señales de sólida reportero en vivo. Este enfoque es el siguiente: 1) rápida, logrando verdaderas capacidades de superconductores de alta temperatura (es decir,> 50.000 unidades por día), 2) reproducible, que alcanzan HTS-compatible con la calidad del ensayo (es decir, Z 'factores de ≥ 0,5), y flexible 3), susceptibles de a casi cualquier reportero de ensayo basado en los embriones de pez cebra, larvas o juveniles. ARQiv se utiliza aquí para cuantificar los cambios en: 1) el número de células, la pérdida y la regeneración de dos tipos diferentes de células marcado con fluorescencia (células beta del páncreas y los fotorreceptores de varilla), 2) la señalización celular, la actividad relativa de un transgénico Notch de señalización reportero, y 3 ) el metabolismo celular, la acumulación de especies reactivas del oxígeno. En resumen, ARQiv es un enfoque versátil y fácilmente accesible para facilitar la evaluación de las manipulaciones genéticas y / o químicas en el pez cebra vida que complementa actuales de "alto contenido" organismo entero métodos de cribado, proporcionando un primer nivel in vivo plataforma HTS descubrimiento de fármacos.
