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Articles by Matthew E. Pope in JoVE
JoVE General
La quantification des protéines à l'aide d'enrichissement d'immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center - FHCRC, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, 3Broad Institute of MIT and Harvard, 4Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 5Plasma Proteome Institute
Normes des isotopes stables et capture par anticorps anti-peptide (SISCAPA) l'enrichissement affinités couples de peptides avec des isotopes stables de dilution spectrométrie de masse (MRM-MS) pour fournir une mesure quantitative des peptides comme substituts pour leurs protéines respectives. Nous décrivons ici le protocole en utilisant des particules magnétiques dans un format partiellement automatisés.
Other articles by Matthew E. Pope on PubMed
Dépistage Des Anticorps Anti-peptide : Sélection Des Réactifs Monoclonaux Haute Affinité Par Une Technique De Résonance Plasmonique De Surface Raffinée
Une méthode de résonance plasmonique de surface raffinée a été développée pour mesurer la cinétique de la liaison peptidique d'anticorps monoclonaux de lapin (RabMAbs). Quantités optimisées de RabMAbs ont été capturées sur les copeaux de capteur des surnageants d'hybridome suivies par la liaison des peptides libres de solution. Cela a permis à mesure cinétique des interactions monovalentes de peptides avec antigène unique des sites de liaison sur les anticorps et la détermination des constantes d'affinité sans complications a contribué par des considérations de l'avidité. Liaison peptidique réponses ont été normalisées pour le montant d'anticorps présent dans chaque échantillon et un modèle d'interaction simple était apte à toutes les réponses de la liaison en même temps. En conséquence, le ka de constantes cinétiques et kd et le KD constante d'affinité (kd/ka), pourraient être déterminé pour chaque interaction de l'anticorps dans des conditions identiques. Haute résolution études impliquant plusieurs concentrations d'antigènes peptidiques effectuées pour valider la fiabilité des mesures de concentration unique. En combinant les données sur l'affinité, l'activité et concentration, classement des surnageants contenant des anticorps a été effectué, permettant la sélection de haute qualité RabMAbs pour la liaison des peptides en solution.
MALDI Immunocriblage (MiSCREEN): Une Méthode De Sélection D'anticorps Monoclonaux Anti-peptide Devant Servir à Immunoproteomics
On décrit une méthode évolutive pour la présélection et de sélection de peptide spécifique des anticorps monoclonaux (ACM). Pour identifier le mAbs anti-peptide haute affinité dans les surnageants de l'hybridome, anticorps ont été capturés par des billes magnétiques d'affinité suivies par la liaison des peptides spécifiques de la solution. Une fois terminé les étapes de lavage, les peptides liés restants ont été éluées de perles et détectés par spectrométrie de désorption-ionisation laser assistée par matrice temps de vol (MALDI-TOF) masse (MS). Cela a permis à mesure des interactions monovalentes de peptides avec antigène unique des sites de liaison sur les anticorps, reflétant ainsi l'affinité de l'anticorps plutôt que d'avidité. Les anticorps qui ont pu lier des peptides de la cible de la phase de solution et de les maintenir pendant le lavage pendant au moins 10 min ont été identifiés par la force des signaux appropriés m/z peptide MS obtenus. Cette durée de lavage reflète le temps de dissociation peptide minimales requis pour l'utilisation de ces anticorps dans plusieurs essais d'immuno-spectrométrie de masse actuelle. Analyse cinétique de liaison anticorps-peptide par résonance plasmonique de surface (SPR) a montré que les anticorps sélectionnés étaient de haute affinité et, surtout, constantes de dissociation faible. Cette méthode, appelée MALDI immunocriblage (MiSCREEN), permet ainsi de dépistage rapide et la sélection des anticorps anti-peptide de haute affinité qui sont utiles pour une variété d'applications d'immunoproteomics. Afin de démontrer leur utilité fonctionnelle dans les dosages immuno-spectrométrie de masse, nous avons utilisé le RabMAbs sélectionné, purifiée pour enrichir des peptides naturels (tryptiques) du plasma humain digérée.
Evaluation De Développement à Grande échelle Quantitative Assay Protéomique Utilisant La Spectrométrie De Masse Peptide D'affinité à Base De
Normes des isotopes stables et la capture par des anticorps antipeptides (SISCAPA) d'enrichissement d'affinité couples de peptides avec la dilution des isotopes stables et la détection par spectrométrie de masse de réaction multiples surveillance pour fournir une mesure quantitative de peptides en tant que substituts pour leurs protéines respectives. Dans ce rapport, nous décrivons une étude de faisabilité afin de déterminer le taux de réussite pour la production d'anticorps appropriés pour les dosages SISCAPA afin d'informer les stratégies de développement test à grande échelle. Un flux de travail a été conçu comprenant une stratégie d'immunisation multiplexage dans lequel jusqu'à cinq peptides protéotypiques d'une cible unique protéine ont été utilisés pour immuniser des lapins individuels. Un total de 403 protéotypiques peptides tryptiques représentant 89 cibles protéiques ont été utilisés comme immunogènes. Les titres d'anticorps ont été antipeptide mesurée par ELISA et 220 anticorps antipeptides représentant 89 protéines ont été choisis pour la purification par affinité. Ces anticorps ont été caractérisés à l'égard de leur performance dans SISCAPA-multiples tests de contrôle de la réaction en utilisant la trypsine-plasma humain digéré la matrice. Plus de la moitié des dosages générés sont capables de détecter le peptide cible à des concentrations inférieures à 0,5 fmol / pi dans le plasma humain, qui correspond à la concentration de protéines de moins de 100 ng / ml. La stratégie de multiplexage cinq immunogènes peptidiques a réussi à générer un test de travail pour 100% des protéines ciblées dans cette étude d'évaluation. Ces résultats indiquent qu'il est possible pour un seul laboratoire à développer des centaines de tests par an et permettre la planification de rapport coût-efficacité des tests de génération SISCAPA.
Inter-laboratoires D'évaluation De La Automatisé, Multiplexée Enrichissement Immunoaffinité Peptide Couplée à La Spectrométrie De Masse De Réaction Multiple De Surveillance Pour Les Protéines Dans Le Plasma Quantification
L'incapacité de quantifier un grand nombre de protéines dans les tissus et biofluides avec une grande précision, la sensibilité et le débit est un obstacle majeur dans les études de biomarqueurs. Nous avons déjà démontré que le couplage d'enrichissement d'immunoaffinité utilisant des anticorps anti-peptide (SISCAPA) pour MRM-MS produit immuno-essais de GRM qui peuvent être multiplexés pour quantifier les protéines dans le plasma avec une grande sensibilité, la spécificité et de précision. Nous rapportons ici la première évaluation systématique de la performance inter-laboratoires des multiplex (8-plex) immuno-MRM-MS dans trois laboratoires indépendants. Une étude mise en scène a été réalisée dans lequel l'effet de chaque traitement et l'analyse étape sur le dosage CV, LOD, LOQ et la récupération a été évaluée. Les limites de détection étaient égaux ou inférieurs à 1 ng / mL pour les protéines dosées dans 30 uL de plasma. Reproductibilité du test était acceptable pour les études de vérification, avec une médiane CV intra-et inter-laboratoire-dessus de la limite de quantification de 11% et <14%, respectivement, pour le processus de dosage immuno-MRM-MS entier, y compris la digestion enzymatique du plasma. Digestion par la trypsine et sa manipulation de l'échantillon requise contribué la variabilité test le plus à la récupération et réduit de peptides cibles à partir de protéines digérées. En utilisant une protéine isotopes stables étiquetés comme une norme interne au lieu de peptides isotopes stables étiquetés pour tenir compte des pertes dans le processus de digestion a presque doublé la précision de dosage de ce tout en améliorant la précision du dosage de 5%. Nos résultats démontrent que multiplexée immuno-MRM-MS peut être fait reproductible dans des laboratoires indépendants et a le potentiel pour être largement adoptées pour le dosage de protéines dans des matrices aussi complexe que le plasma.
