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Articles by Matthew E. Pope in JoVE
JoVE General
Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center - FHCRC, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, 3Broad Institute of MIT and Harvard, 4Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 5Plasma Proteome Institute
Stabile Isotope Standards und Capture von Anti-Peptid-Antikörper (SISCAPA) Paare Affinitätsanreicherung von Peptiden mit Isotopenverdünnungsanalyse Massenspektrometrie (MRM-MS) zur quantitativen Messung von Peptiden als Ersatz für ihre jeweiligen Proteine liefern. Hier beschreiben wir das Protokoll mit magnetischen Partikeln in einer teilautomatisierten Format.
Other articles by Matthew E. Pope on PubMed
Anti-Peptide Antikörper-Screening: Auswahl Der Hohe Affinität Monoklonalen Reagenzien Durch Eine Raffinierte Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Technik
Eine raffinierte Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Methode wurde entwickelt, um die Kinetik der Peptid-Bindung an Kaninchen monoklonale Antikörper (RabMAbs) zu messen. Optimierte Mengen an RabMAbs wurden auf Sensor-Chips von Hybridoma Supernatants anschließender Bindung von freien Peptiden aus Lösung gefangen genommen. Dies erlaubt kinetische Messung der monovalenten Interaktionen von Peptiden mit einzelnen Antigen Bindungsstellen auf den Antikörpern und Bestimmung der Affinität Konstanten ohne Komplikationen durch die Avidität Überlegungen beigetragen. Peptid-Bindung Antworten wurden für den Antikörper in jeder Probe normalisiert und eine einfache Interaktionsmodell wurde gleichzeitig für alle verbindliche Antworten passen. Infolgedessen konnte der kinetischen Rate Konstanten ka und kd und der Affinität Konstante KD (kd/ka), für jede Antikörper Interaktion unter identischen Bedingungen ermittelt werden. Höhere Auflösung-Studien, die mit mehreren Konzentrationen von Peptidantigene wurden durchgeführt, um die Zuverlässigkeit der Einzel-Konzentrationsmessungen zu validieren. Durch die Kombination von Daten für Affinität, Bewegung und Konzentration, wurde Ranking der Antikörper-haltigen Supernatants durchgeführt, so dass Auswahl hochwertiger RabMAbs für die Bindung von Peptiden in Lösung.
MALDI-Immunoscreening (MiSCREEN): Eine Methode Für Die Auswahl Der Anti-peptide Monoklonale Antikörper Für Den Einsatz in Immunoproteomics
Eine skalierbare Methode für Screening und Auswahl von Peptid-spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAbs) wird beschrieben. Um hohe Affinität anti-peptide mAbs in Hybridoma Supernatants zu identifizieren, wurden Antikörper durch magnetische Affinität Perlen mit anschließender Bindung von spezifischen Peptiden aus Lösung erfasst. Nach zeitlich Waschschritte, wurden die verbleibenden gebundene Peptide aus den Perlen eluiert und von Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-Time-of-Flight (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) erkannt. Dies erlaubt Messung von monovalenten Interaktionen von Peptiden mit einzelnen Antigen Bindungsstellen auf die Antikörper, Antikörper-Affinität anstatt Avidität was. Antikörper, die konnten Ziel Peptide Phase-Lösung zu binden und binden sie beim Waschen für ein Minimum von 10 min wurden durch die Stärke der entsprechenden m/Z Peptid MS Signale erhalten identifiziert. Diesmal waschen spiegelt den minimalen Peptid Dissoziation Zeitaufwand für die Verwendung dieser Antikörper bei mehrere aktuelle Massenspektrometrie-Immuno-Assays. Kinetische Analyse der Antikörper-Peptid-Bindung von Surface Plasmon Resonance (SPR) zeigte, dass die markierten Antikörper der hohe Affinität waren und, am wichtigsten, geringe Dissoziation-Konstanten. Diese Methode mit dem Namen MALDI-Immunoscreening (MiSCREEN), kann somit schnell-Screening und Auswahl der hohe Affinität anti-peptide Antikörper, die für eine Vielzahl von Immunoproteomics Anwendungen nützlich sind. Um ihren funktionalen Nutzen bei Massenspektrometrie-Immuno-Assays zu demonstrieren, haben wir die ausgewählten, gereinigtes RabMAbs verwendet, natürliche (tryptic) Peptide aus verdauten Blutplasma zu bereichern.
Bewertung Der Groß Angelegte Quantitative Proteomic-Assay-Entwicklung Mit Peptid Affinität-basierte Massenspektrometrie
Stabile Isotop Normen und Erfassen von antipeptide Antikörpern (SISCAPA) Paare Affinität Anreicherung von Peptiden mit stabilen Isotope Dilution und Erkennung durch mehrere Reaktion Überwachung Massenspektrometrie um quantitative Messung von Peptiden als Ersatzzeichen für ihre jeweiligen Proteine zu bieten. In diesem Bericht beschreiben wir eine Machbarkeitsstudie, um die Erfolgsrate für die Produktion von passenden Antikörpern für SISCAPA Assays zu ermitteln, um Strategien für eine groß angelegte Assayentwicklung zu informieren. Ein Workflow wurde entworfen, die eine multiplex Immunisierung-Strategie enthalten, in der bis zu fünf Proteotypic Peptide aus ein einzelnes Protein-Ziel verwendet wurden, um einzelne Kaninchen zu immunisieren. Insgesamt 403 Proteotypic tryptic Peptide, 89 Protein Ziele darstellt, wurden als Immunogenen verwendet. Antipeptide Antikörper-Titer gemessen wurden von ELISA und 220 antipeptide Antikörper, die 89 Proteine wurden für Affinitätsreinigung ausgewählt. Diese Antikörper wurden in Bezug auf ihre Leistung im SISCAPA-Multiple Reaktion Überwachung Assays mit Trypsin verdaut Blutplasma Matrix charakterisiert. Mehr als die Hälfte der generierten Tests waren Aufspüren von das Ziel-Peptid bei Konzentrationen von weniger als 0,5 Fmol/μl in menschlichem Plasma Protein-Konzentrationen von weniger als 100 ng/ml entspricht. Die Strategie der Multiplexen fünf Peptid Immunogenen war erfolgreich eine arbeiten-Assay für 100 % der gezielten Proteine in diese Evaluationsstudie zu generieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass es für ein einzelnes Labor entwickeln Hunderte Proben pro Jahr und ermöglichen eine Planung für kostengünstige Generation SISCAPA Assays durchführbar ist.
Laborübergreifende Bewertung Der Automatisiert, Multiplex-Peptid Immunoaffinity Bereicherung an Mehreren Reaktion Überwachung Zur Quantifizierung Der Proteine Im Plasma-Massenspektrometrie Gekoppelt Ist
Die Unfähigkeit, zahlreicher Proteine im Gewebe und hinter mit hoher Präzision, Sensibilität und Durchsatz zu quantifizieren ist ein großes Hindernis in Biomarker-Studien. Wir zuvor nachweislich Immunoaffinity Anreicherung mit anti-peptide Antikörpern (SISCAPA) zu MRM-MS Kopplung Immuno-MRM Proben produziert, die zur Quantifizierung der Proteine im Plasma mit hoher Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit Multiplexing werden können. Hier berichten wir, dass die erste systematische Bewertung der laborübergreifende Leistung (8-Plex) Immuno-MRM-MS in drei unabhängige Labore Multiplexing. Eine inszenierte Studie wurde durchgeführt, in denen die Wirkung der einzelnen Schritte der Verarbeitung und Analyse auf Probe CV, LOD, LOQ und Recovery ausgewertet wurde. Nachweisgrenzen waren bei oder unter 1 ng/mL für die analysiert Proteine in 30 uL von Plasma. Assay Reproduzierbarkeit war akzeptabel für Überprüfung Studien, mit medianen Intra - und inter - laboratory CVs oberhalb der LOQ von 11 % und < 14 %, jeweils für den gesamten Immuno-MRM-MS-Assay-Prozess, einschließlich enzymatische Verdauung von Plasma. Trypsin-Verdauung und den Umgang damit erforderliche Beispiel trugen die meisten um die Variabilität Brutversuch und die Wiederherstellung der Ziel-Peptide von verdaute Proteine verringert. Mit ein stabiles Isotop Protein als ein internes Standards statt Stabiles Isotop beschriftete Peptide für Verluste im Verdauungprozeß fast Konto Assay Genauigkeit dafür verdoppelt, gleichzeitiger Verbesserung der Assay-Präzision 5 % gekennzeichnet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Multiplex Immuno-MRM-MS in unabhängigen Labors reproduzierbare gemacht werden kann und das Potenzial hat, die weit angenommen werden, für die Prüfung der Proteine in Matrizen so komplex wie Plasma.
