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Articles by Matthew Clay in JoVE
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在斑马鱼胚胎的单个神经元和神经嵴细胞的细胞运动和肌动蛋白细胞骨架的实时成像
1Genetics Training Program, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Anatomy, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Zoology, University of Wisconsin-Madison, 4Cell and Molecular Biology Training Program, University of Wisconsin-Madison
本协议描述了生活的斑马鱼胚胎的单个神经元或神经嵴细胞成像。使用此方法来研究细胞行为和肌动蛋白定位使用荧光共焦时间推移显微镜。
Other articles by Matthew Clay on PubMed
芳圆环域的环酮通过镁 Carbometalation-6-pi-electrocyclization 协议。
描述了芳基的环酮的圆环域的新战略。三酮的茼蒿丙炔醇物耦合和 vinylmagnesium 氯的增补可能与亲电淬火镁螯合物作为生成工业区。在某些情况下，在反应条件下工业区 cyclizes。芳构化是通过接触二氧化锰或 dichlorodicyanoquinone (DDQ) 来实现的。[反应： 看到文本]
从拟南芥 LL Diaminopimelate 氨基转移酶的晶体结构： 最近发现的酶在植物和衣原体的 L-赖氨酸的生物合成。
对 l-赖氨酸细菌和植物中必不可少的生物合成途径是发展的新的抗生素或除草剂具有吸引力的目标，因为它是缺席在人类中，他们必须获得此氨基酸在他们的饮食。植物在其中使用的 l-赖氨酸细菌通向快捷方式-5'-磷酸吡哆醛 (PLP)-依赖酶 ll diaminopimelate 转氨酶 (DAP LL AT) 转换直接向 LL DAP 的酸 l-tetrahydrodipicolinic (L THDP)。此外，LL DAP 在最近中找衣原体 sp.），这表明这种酶的抑制剂也可能有效打击这类有机物。为了了解这种酶的机制，并协助设计的抑制剂，在 1.95 A 决议确定 LL DAP AT 的三维晶体结构。从拟南芥 (AtDAP AT) LL DAP AT cDNA 序列是针对在细菌中的表达优化，并在不具备其领导人序列，但 C 终端 hexahistidine 亲和标记，以帮助蛋白质纯化的大肠杆菌中克隆。AtDAP AT 的结构是硒蛋氨酸导数与使用的多波长反常色散 (MAD) 方法确定的。AtDAP AT 是积极作为 homodimer 有工党活动网站中每个亚单位。它属于家庭类型的我折叠 PLP 依赖酶。AtDAP AT 和天冬氨酸转氨酶活性部位残留的比较表明 PLP 绑定残留在 AtDAP AT 好保守在这两种酶。然而，Glu97 * 和 Asn309 * AtDAP AT 的活动站点中都在找不到类似的职位的门冬氨酸转氨酶，表明特定底物识别可能需要从其他单体残留物。AtDAP-在苹果酸绑定结构允许将 DAP 和 L-谷氨酸仿效到活动网站。这些初步的三维结构的 LL DAP 在洞察其底物专一性和催化机制。
Rho 激酶和肌球蛋白二体内的上皮向间质过渡期间影响动态神经嵴细胞的行为。
感应和迁移的神经嵴细胞 （Ncc） 颅面结构和周围神经系统的发展至关重要。净捐助国的发展的一个关键步骤是上皮间质转换 (EMT) 他们接受，以便启动迁移。几个转录因子是重要的 NCC EMT。但是，不知道有关调节细胞粘附、 细胞骨架和细胞运动与 EMT 关联的变化产生影响的手段或经历 EMT 体内细胞的行为的具体变化。我们用于净的斑马鱼后脑的延时成像显示净 EMT 期间接受了一系列定型的行为。我们发现这一损失的细胞粘附和膜 blebbing filopodial 扩展和迁移的发病之前。肌动蛋白动力学的实时成像显示该肌动蛋白本地化以不同的方式在泡和例证。此外，我们发现肌球蛋白二中断或 Rho 激酶 (岩) 活性抑制 NCC blebbing 和原因减少 NCC EMT。这些数据揭示肌球蛋白 II 角色和岩 NCC EMT 体内，并提供 NCC 行为期间将形成进一步的机理研究的基础的 EMT 详细的表征。
底物识别和 LL Diaminopimelate 转氨酶从拟南芥 PLP 引起构象变化的机制。
LL Diaminopimelate 转氨酶 (LL-DAP-AT)、 磷酸吡哆醛 (PLP)-依赖酶在植物和衣原体的赖氨酸合成途径是除草剂或抗生素的发展的潜在目标。这种酶 homodimeric L tetrahydrodipicolinic 酸 (THDP) 直接转换 LL DAP 使用 L-谷氨酸氨基组的源。早些时候，我们描述了本机和苹果酸绑定 LL-DAP-在从拟南芥 (AtDAP AT) 的 3D 结构。AtDAP AT 和及其变种的七个额外的晶体结构报道这里作为底物识别和催化机制调查的一部分。两个结构的 AtDAP AT 有减少外部一类似物： N-(5'-phosphopyridoxyl)-L-谷氨酸 (PLP Glu) 和 N-(5'-phosphopyridoxyl) LL Diaminopimelate (PLP DAP） 绑定在活动网站。奇怪的是，它们揭示了 L-谷氨酸和 LL DAP 都承认非常相似的方式由相同的氨基酸残基 ； 集这两种分子采用扭的 V 形构象。这两种衬底，alpha-羧酸捆绑在盐桥的 Arg404，而远端羧酸酯承认通过氢键到 well-conserved 侧链的 Tyr37、 Tyr125 和 Lys129。远端 C(epsilon) 氨基 LL DAP 的特别被确认的几个非共价相互作用与残留物其他亚基 (Asn309 * Tyr94 * Gly95 *、 Glu97 * (氨基酸的酸指示符，跟一个星号 (*) 指示残留物源于中二聚体的其他亚基）） 和三个绑定的水分子。通过定点突变的活动网站赖氨酸 (K270N 和 K270Q) 创建了 AtDAP-在两个催化处于非活动状态的变种。这些变体的结构允许在活动网站，进工党与 L-谷氨酸和 LL DAP 的洞口外部 aldimines 的观察和透露有关 PLP 基板债券扭转角的差异。最后，缺少 PLP 载脂蛋白-AtDAP-在结构显示构象变化致工党绑定和衬底进入活动网站的详细的信息。
醛脱氢酶与头颈部鳞癌肿瘤干细胞的单标记鉴定。
只有一小部分肿瘤细胞在符合癌症干细胞 (CSC) 理论，能够形成肿瘤。我们以前曾报道 CD44 株致瘤细胞的头颈部鳞癌 (HNSCC)。最近的研究表明醛脱氢酶 (乙醛脱氢酶) 活性可能代表协会更特定标记。
Diaminopimelate 氨基转移酶的抑制剂的探索。
细菌和高等植物使 l-赖氨酸从 diaminopimelic 酸 (DAP)。在哺乳动物中 l-赖氨酸是必需氨基酸必须从饮食获得，如生物合成途径是缺席为此关键成分的蛋白质。最近，ll diaminopimelate 转氨酶 (ll-DAP-AT)，-5'-磷酸吡哆醛 (PLP)-依赖酶，据报道，催化 l-赖氨酸植物和衣原体在工艺路线中的关键一步。有具体抑制这种酶的因此可能作为除草剂或均不含毒素的抗生素对哺乳动物。在这项工作，29,201 抑制剂已播出对 ll DAP AT 和 IC(50) 的值被确定为最高 46 化合物。芳基丁烯二酰肼和丹宁衍生物被进一步修改，以生成 20 的类似物，对 ll DAP AT 还测试了。这些类似物提供额外的构效关系 （特区） 在指导进一步的抑制剂的设计中非常有用。
神经嵴细胞行为和迁移的控制： 从实时成像的见解。
神经嵴细胞 （Ncc） 是一种非凡、 动态的组的长途跋涉中，达到其目标站点的胚胎的细胞。他们负责颅面骨骼和软骨、 神经元和胶质细胞在周围神经系统和色素细胞的形成。实时成像的净他们遍历胚胎已增加其生物学知识的关键。净展出多个行为和沟通彼此和他们在他们的旅程沿每个步骤的环境。成像结合分子操作导致了机制来控制这些行为的见解。在这次审查，我们强调研究已经用于实时成像小说洞察 NCC 迁移并讨论如何继续的使用这种技术可以推进我们对 NCC 生物学的理解。
期间启动的神经嵴迁移细胞粘连及动力的规管。
准确的神经嵴细胞 (NCC) 迁移需要严格控制的细胞粘连、 细胞骨架动力学和细胞运动。期间净从诱导的初始分层规管粘连和动力的关键分子球员粘附和 RhoGTPases。最近的研究表明这些分子的多个函数和建议他们的活动的精确的平衡至关重要。RhoGTPase 出现在 NCC 分层调节细胞粘连和突出的部队。越来越多的证据表明粘附与控制分层和迁移过程中的 NCC 动力的新颖、 粘附独立信号功能的多功能蛋白质。这些函数往往受特定蛋白水解劈裂的粘附。NCC 分层后平面细胞极性信号行为通过 RhoGTPases 控制 NCC 突起和迁移的方向。
头颈部肿瘤干细胞： 侧人口。
癌症干细胞 (CSC) 理论的结论亚群的肿瘤细胞，肿瘤干细胞，可以 self-renew 负责对肿瘤的生长。以前的研究已确定细胞能够射流 Hoechst 33342 染料为侧人口 (SP)。SP 细胞和小区共享许多特性，，表明分离株恶性骨肿瘤的 SP 包含小区。
从沙眼衣原体 LL Diaminopimelate 氨基转移酶的结构： 对其广泛的底物专一性的影响。
我们以前有报道本机全息和基板绑定窗体的拟南芥 (AtDAP AT) 从 LL diaminopimelate 氨基转移酶的结构。在这里，我们报告的晶体和分子结构的 LL diaminopimelate 转氨酶从亚洲生产力组织形式及吡哆醛-5'-磷酸-绑定窗体中的沙眼衣原体 (CtDAP AT)。CtDAP-在分子的结构表明其整体折叠本质上是相同的 AtDAP 在不同之处在于 CtDAP AT 采用"开放"而不是"封闭"构象 AtDAP AT 的形态。虽然 AtDAP AT 和 CtDAP AT 都完全相同，其主要的序列中大约 40%，他们有重大分歧在其底物的具体情况 ；AtDAP AT 是非常具体的 LL DAP，而 CtDAP 在接受更广泛的衬底。因为所有涉及的底物识别残留高保守 AtDAP AT 和 CtDAP AT 之间，我们建议差异柔性的衬砌之间的差异在底物专一性的两种酶可能帐户活动网站区域的循环。
