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Articles by Matthew Clay in JoVE
JoVE General
細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング
1Genetics Training Program, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Anatomy, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Zoology, University of Wisconsin-Madison, 4Cell and Molecular Biology Training Program, University of Wisconsin-Madison
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。
Other articles by Matthew Clay on PubMed
アリール環化マグネシウム Carbometalation 6 Pi Electrocyclization プロトコル経由で環状ケトンの。
アリール環化環状ケトンのための新しい戦略を説明します。プロパルギル アルコール、ケトンのトリフラート エノールを触媒として結合と vinylmagnesium と塩化はトリエン求を急冷することがあります、マグネシウムのキレートとして生成します。いくつかのケースでは, 反応条件下でトリエン cyclizes。芳香族化二酸化マンガンまたは dichlorodicyanoquinone (DDQ） への暴露によって実現されます。[反応： テキストを表示]
シロイヌナズナから LL ジアミノピメリン酸アミノ基転移酵素の結晶構造: 植物およびクラミジアによる L-リジンの生合成における最近発見された酵素。
L-リジン細菌と植物に不可欠の生合成経路の新しい抗生物質や除草剤を開発の魅力的なターゲット欠席されている人間の人は自分たちの食事、このアミノ酸を取得する必要があります。L-リジンへの細菌の経路のショートカットの使用植物でピリドキサール 5'--リン酸 (PLP) 依存性酵素 ll ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ (LL DAP AT) 変換 LL DAP に直接 l-tetrahydrodipicolinic 酸 (L-働き)。さらに、LL DAP AT 最近クラミジアの sp では、この酵素の阻害剤もそのような生物に対する効果的なことを示唆発見されました。この酵素のメカニズムの解明と阻害剤の設計を支援するために、3次元結晶構造の LL DAP AT 1.95 A の解像度で決定されました。LL DAP AT の cDNA シーケンス シロイヌナズナ （AtDAP AT） から細菌の表現のために最適化され、大腸菌蛋白質の浄化を援助する C ターミナル hexahistidine 親和性タグがそのリーダー シーケンスなしで複製。AtDAP AT の構造は、液体メチオニン誘導体と多波長異常分散 （MAD） を用いて測定しました。AtDAP AT PLP 抱えてアクティブ サイトで各サブユニットではホモ二量体としてアクティブになります。ファミリに属する型の私は PLP 依存性酵素を折る。AtDAP AT とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性部位残基の比較 PLP 結合残基 AtDAP AT で両酵素でよく保存されていることを明らかにしました。ただし、Glu97 ※ と Asn309 ○ AtDAP AT の活性部位にアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの同様の位置で特定の基質認識他のモノマーからこれらの残基を必要があることを示唆して見つかっていません。AtDAP AT のマラテ バインド構造 LL DAP および l-グルタミン酸アクティブ サイトにモデリングする許可。これら初期の 3次元構造の LL DAP AT その基質特異性と触媒機構への洞察を提供します。
Rho-キナーゼとミオシンIIは、in Vivoでの上皮間葉移行の間に動的な神経堤細胞の挙動に影響を与える
神経堤細胞の誘導と移行（NCCS）は、頭蓋顔面構造の開発と末梢神経系に不可欠です。 NCCSの開発における重要なステップは、移行を開始するために受けることを間葉移行（EMT）に上皮である。いくつかの転写因子は、NCC EMTのために重要である。しかし、以下は、細胞接着の変化、細胞骨格やEMTに関連付けられている細胞の運動性を調節するエフェクターについてまたはin vivoでEMTを受ける細胞の挙動の特定の変更について知られています。我々はNCCSはEMTの間に行動のステレオタイプのシリーズを受けることを示すためにゼブラフィッシュ後脳にNCCSのタイムラプスイメージングを使用していました。我々は、細胞接着および膜ブレブ形成のその損失がfilopodial拡張や移行の開始を前に見つける。アクチンダイナミクスのライブイメージングは、アクチンがプレブと糸状仮足で異なる局在を示しています。さらに、ミオシンIIまたはRhoキナーゼ（ROCK）活性の混乱を見つけるNCCのブレブ形成を阻害し、減少NCC EMTを引き起こします。これらのデータは、in vivoでのNCC EMTにおけるミオシンIIとROCKの役割を明らかにし、さらに機構の研究の基礎を形成しますEMT中にNCCの動作の詳細な特性を提供しています。
基質認識と LL ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼのシロイヌナズナ PLP 誘起コンホメーション変化のメカニズム
LL ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ (LL-DAP-AT)、ピリドキサール燐酸 (PLP)-依存の酵素リジンの生合成経路では植物、クラミジアである、除草剤、抗生物質の開発のための潜在的なターゲット。この示された (fig3) 酵素 L-tetrahydrodipicolinic 酸 (働き) 直接 LL DAP を変換 l-グルタミン酸アミノ グループのソースとして使用します。前にネイティブとマラテ バインド LL-DAP-AT シロイヌナズナ （AtDAP AT） からの 3 D 構造を説明しました。AtDAP AT とその亜種の 7 追加の結晶構造を報告ここ基質認識および触媒作用のメカニズムに調査の一環として。2 つの構造は AtDAP-AT の削減外部アルジミンの類似: N-(5'-phosphopyridoxyl)-L-グルタミン酸 (PLP Glu) とジアミノピメリン N-(5'-phosphopyridoxyl)-LL-酸 (PLP DAP) バインド アクティブ サイトで。驚いたことに、彼らは l-グルタミン酸と LL DAP は非常に同様の方法でアミノ酸残基の同じセットによって認識されることを明らかにする;両方の分子ツイスト V 字の立体構造を採用します。遠位のカルボン酸水素結合を持つ側鎖の Tyr37、Tyr125、Lys129 経由で認識されるに対し両方基板とアルファ カルボン酸 Arg404、塩橋にバインドされます。DAP の LL の遠位 C(epsilon) アミノ具体的にいくつかの非共有結合相互作用と他のサブユニット (Asn309 ○ Tyr94 ○、Gly95 ○、Glu97 ※ (アミノ酸指定子の後にアスタリスク (※) 残基が二量体の他のサブユニットで発信されたことを示す)) からの残留と 3 つの結合水の分子によって認識されます。2 つの触媒非アクティブ バリアント AtDAP at アクティブ サイト リジン (K270N および K270Q) のサイト特異的変異を介して作成されました。これらの亜種の構造 PLP l-グルタミン酸と LL DAP の雑種の外部個活性部位での観察を許可、PLP 基板付着についてねじり角度の違いを明らかにしました。最後に、PLP 行方不明 apo AtDAP AT 構造は PLP が結合および活性部位への基板の参入による構造変化の詳細を明らかに。
頭頸部の扁平上皮がん幹細胞とアルデヒド脱水素酵素の単一マーカー同定。
がん幹細胞 (CSC) 理論と一致して、がん細胞の小さなサブセットだけいる腫瘍形成できます。以前、我々 は CD44 頭頸部扁平上皮癌 (HNSCC) からの発癌性細胞を分離することを報告しました。最近の研究は、アルデヒド脱水素酵素 (ALDH) 活性より特異的マーカー CSCs を表すかもしれないことを示します。
ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼの阻害剤の探索。
細菌および高等植物 l-リジンからジアミノピメリン酸 （DAP） を作る。哺乳類では l リジンです必須アミノ酸生合成経路は欠席は、食事から取得する必要がありますこのキー成分タンパク質のため。最近では、ll ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ (ll-DAP-AT)、ピリドキサール 5'--リン酸 (PLP) 依存性酵素 l-リジンの植物やクラミジアにルートの重要なステップを触媒すること報告されました。この酵素の特異的阻害剤がこうして潜在的奉仕除草剤または非毒性のある抗生物質としての哺乳類に。この作品は、29,201 阻害剤に対する ll DAP AT 上映し、トップ 46 化合物の ic50 値 （50 値を求めた。アリール ヒドラジドとハクチョウのデリバティブは、さらにまた ll DAP AT に対してテストされた 20 類縁体の生成に変更されました。これら類縁体阻害剤のより詳細な設計を導くに役立つ追加の構造活性相関 (SAR) を提供します。
神経堤細胞の挙動と移行の制御：ライブイメージングからの知見
神経堤細胞（NCCS）が標的部位に到達するための胚で長い距離を移動する細胞の顕著な、動的なグループです。彼らは、頭蓋顔面骨や軟骨、末梢神経系のニューロンとグリア細胞と色素細胞の形成に責任があります。彼らは胚が彼らの生物学の知識を高めるために重要であった横断としてNCCSのイメージングを住んでいます。 NCCSは、複数の行動や、彼らの旅の各段階に沿って互いに通信し、その環境を示す。分子の操作と組み合わせてイメージングは、これらの動作を制御するメカニズムへの洞察力につながっている。このレビューでは、NCCの移行に新たな洞察を提供し、そのような技術の継続的な使用がNCC生物学の我々の理解を進めることができる方法を検討するライブイメージングを用いた研究を強調表示します。
神経堤マイグレーションの開始時に細胞接着と運動の調節
正確な神経堤細胞（NCC）の移行は、細胞接着、細胞骨格のダイナミクスと細胞の運動性の厳密な制御を必要とします。カドヘリンとRhoGTPasesは、初期の神経上皮からNCCSの剥離中に癒着して運動性を調節する重要な分子の選手です。最近の研究では、これらの分子のために複数の機能を明らかにし、彼らの活動の正確なバランスが重要であることが示唆されています。 RhoGTPaseは剥離NCCの間に細胞接着及び突出力の両方を調節するために表示されます。カドヘリンは、両方の剥離と移行中の小説、密着性に依存しないシグナリング機能を制御するNCCの運動性を持つ多機能タンパク質であるという証拠を示して増加します。これらの関数はしばしばカドヘリンの特定のタンパク質分解的切断によって規制されている。 NCCは剥離した後、平面内細胞極性は、NCCの突起と移動方向を制御するためにRhoGTPases経由して行為をシグナリング。
LL ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼのクラミジア ‐ トラコマティスの構造: 広範な基質特異性のための含意。
我々 は以前のネイティブ ホロと基板バインド フォーム LL ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼのシロイヌナズナ （AtDAP AT） の構造を報告しました。ここでは、我々 はクラミジア ‐ トラコマティス （CtDAP AT） apo フォームとピリドキサール 5 から LL ジアミノピメリン酸アミノ基転移酵素の分子構造と結晶報告 ' - リン酸 - バインド フォーム。CtDAP AT の分子構造では、CtDAP AT AtDAP AT の「クローズド」のコンホメーションとは対照的「開放」型を採用することを除いて、その全体的な折り AtDAP AT のそれと本質的に同一になります。AtDAP AT と CtDAP AT 約 40 ％ そのプライマリのシーケンスで同じですが、彼らはその基質特異性に大きな差異がある;CtDAP AT 基板の広い範囲を受け入れるに対し AtDAP AT LL DAP の非常に特定です。すべて基板認識に関与する残基の AtDAP AT と CtDAP AT 間保存性が高いですので、我々 は 2 つの酵素の高いアカウントの基質特異性の違いの間アクティブ サイトの地域の裏地ループの柔軟性の相異点を提案する.
頭頸部がん幹細胞： 側の人口。
がん幹細胞 （CSC） の理論は、がん細胞、がん幹細胞の亜集団が自己更新することができ、腫瘍の成長に責任がある終わります。以前の研究ヘキスト 33342 染料の流出することができる細胞側の人口 (SP) として識別しました。SP 細胞と CSCs 多く特性 CSCs 悪性腫瘍から分離された SP を格納示唆して共有します。
