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Articles by Matthew Clay in JoVE
JoVE General
Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra
1Genetics Training Program, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Anatomy, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Zoology, University of Wisconsin-Madison, 4Cell and Molecular Biology Training Program, University of Wisconsin-Madison
Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.
Other articles by Matthew Clay on PubMed
Cancelación De Aril De Cetonas Cíclicas Mediante Un Protocolo De Carbometalation-6-pi-electrocyclization De Magnesio
Se describe una nueva estrategia para la cancelación de aril de cetonas cíclicas. Acoplamiento de Palladium(0) de un alcohol propargílico con el enol triflate de una cetona y la adición de cloruro de vinylmagnesium generan un triene como un quelato de magnesio que puede ser apagado con un electrófilo. En algunos casos, los derivados triene bajo las condiciones de reacción. Aromatización se logra por la exposición a dióxido de manganeso o dichlorodicyanoquinone (DDQ). [reacción: ver texto]
Allenophanes Acetileno: Una Síntesis Asimétrica De Un Bis (alleno)-bis (butadiynyl) - Meta - Cyclophane
Estructura Cristalina De LL-diaminopimelate Aminotransferasa De Arabidopsis Thaliana: Una Enzima Recientemente Descubierta En La Biosíntesis De L-lisina Por Plantas Y Chlamydia
La vía biosintética esencial a la l-lisina en bacterias y plantas es un destino atractivo para el desarrollo de nuevos antibióticos o herbicidas porque está ausente en los seres humanos, que deben adquirir este aminoácido en su dieta. Las plantas utilizan un atajo una vía bacteriana para l-lisina en el cual el 5'-fosfato de piridoxal (PLP)-enzima dependiente ll-diaminopimelate aminotransferasa (LL-DAP-AT) transforma el ácido l-tetrahydrodipicolinic (L-THDP) directamente a LL-DAP. Además, LL-DAP-AT se encontró recientemente en Chlamydia SP., lo que sugiere que los inhibidores de esta enzima también pueden ser eficaces contra tales organismos. Para entender el mecanismo de esta enzima y para ayudar en el diseño de inhibidores, la estructura cristalina tridimensional de LL-DAP-AT se determinó en 1.95 una resolución. La secuencia de cDNA de LL-DAP-AT de Arabidopsis thaliana (AtDAP-AT) fue optimizada para expresión en bacterias y clonada en Escherichia coli sin su secuencia de líder pero con una etiqueta de afinidad c-terminal hexahistidine para facilitar la purificación de proteínas. La estructura de AtDAP-AT se determinó utilizando el método de dispersión anómala de múltiples longitudes de onda (MAD) con un derivado de seleno-metionina. AtDAP-AT es activo como un homodímero con cada subunidad con PLP en el sitio activo. Pertenece a la familia de tipo doblar las enzimas PLP-dependiente. Comparación de los residuos del sitio activo de AtDAP-AT y Aspartato Aminotransferasas reveló que los residuos de la Unión de PLP en AtDAP-AT se conservan bien en ambas enzimas. Sin embargo, Glu97 * y Asn309 * en el sitio activo de AtDAP-AT no se encuentran en posiciones similares en Aspartato Aminotransferasas, sugiriendo que reconocimiento del sustrato específico puede requerir estos residuos de otro monómero. Una estructura de malato-limite de AtDAP-AT permitió LL-DAP y L-glutamato a modelar en el sitio activo. Estas estructuras tridimensionales iniciales de LL-DAP-en proporcionan la penetración en su especificidad de sustrato y el mecanismo catalítico.
Rho-kinasa Miosina II Y Afectan a Los Comportamientos Dinámicos De Células De La Cresta Neural Durante Epiteliales De Transición Mesenquimal En Vivo
La inducción y la migración de las células de la cresta neural (CCN) son esenciales para el desarrollo de estructuras craneofaciales y del sistema nervioso periférico. Un paso crítico en el desarrollo de los países contribuyentes netos es el de la transición epitelio mesenquimal (EMT) que pasan por el fin de iniciar la migración. Varios factores de transcripción son importantes para la EMT NCC. Sin embargo, se sabe menos acerca de los efectores que regulan los cambios en la adhesión celular, el citoesqueleto y la motilidad celular asociada con la EMT o sobre los cambios específicos en el comportamiento de las células sometidas a la EMT en vivo. Hemos utilizado el tiempo-lapse de imágenes de los países contribuyentes netos en el cerebro posterior del pez cebra para demostrar que los países contribuyentes netos someterse a una serie de conductas estereotipadas durante la EMT. Se encuentra que la pérdida de adhesión celular y la membrana blebbing preceder extensión filopodial y el inicio de la migración. Vivo de imágenes de la dinámica de actina muestra que la actina se localiza de manera diferente en las ampollas y filopodios. Por otra parte, nos encontramos con que la interrupción de la miosina II o Rho quinasa (ROCK) inhibe la actividad del NCC blebbing y provoca una disminución NCC EMT. Estos datos ponen de manifiesto los papeles de la miosina II y Rock en el NCC de la EMT en vivo, y una caracterización detallada del comportamiento del NCC durante la EMT que formarán una base para futuros estudios sobre el mecanismo.
Mecanismo De Reconocimiento De Sustrato Y Cambios Conformacionales Inducidos Por PLP En LL-diaminopimelate Aminotransferasa De Arabidopsis Thaliana
LL-Diaminopimelate aminotransferasa (LL-DAP-AT), un fosfato de piridoxal (PLP)-enzima dependiente en las vías biosintéticas de lisina de las plantas y la clamidia, es un blanco potencial para el desarrollo de herbicidas o antibióticos. Esta enzima homodiméricas convierte el ácido L-tetrahydrodipicolinic (THDP) directamente a LL-DAP usando L-glutamato como la fuente del grupo amino. Anteriormente, hemos descrito las estructuras 3D de nativo y malato-limite LL-DAP-AT de Arabidopsis thaliana (AtDAP-AT). Siete estructuras de cristal adicional de AtDAP-AT y sus variantes se divulgan aquí como parte de una investigación sobre el mecanismo de reconocimiento de sustrato y catálisis. Dos estructuras son de AtDAP-AT con análogos de la reducida aldimine externo: N-(5'-phosphopyridoxyl)-L-glutamato (Glu-PLP) y N-(5'-phosphopyridoxyl)-LL-Diaminopimelate (PLP-DAP) atado en el sitio activo. Sorprendentemente, revelan que el L-glutamato y LL-DAP se reconocen de manera muy similar por los mismos sistemas de residuos de aminoácidos; ambas moléculas adoptan conformaciones trenzados en forma de V. Con ambos sustratos, las alfa-carboxylates están limitados en un puente de sal con Arg404, mientras que el carboxylates distales se reconocen mediante enlaces de hidrógeno a las cadenas laterales bien conservado de Tyr37, Tyr125 y Lys129. El grupo amino distal de C(epsilon) de LL-DAP específicamente es reconocido por varias interacciones no covalentes con residuos de la otra subunidad (Asn309 *, Tyr94 *, Gly95 * y Glu97 * (aminoácidos ácidos designadores seguidas por un asterisco (*) indican que los residuos se originan en la otra subunidad del dimer)) y por tres moléculas de agua. Dos variantes catalítico inactivas de AtDAP-AT fueron creadas mediante mutagénesis sitio-dirigida de la lisina de sitio activo (K270N y K270Q). Las estructuras de estas variantes permiten la observación de la aldimines externa no reducida de PLP con L-glutamato y LL-DAP en el sitio activo y revelaron diferencias en el ángulo de torsión sobre el vínculo de PLP-sustrato. Por último, una estructura de apo-AtDAP-AT falta PLP reveló detalles de los cambios conformacionales inducidos por el atascamiento de PLP y entrada de sustrato en el sitio activo.
Identificación De La Solo-marcador De Cabeza Y Cuello De Células Escamosas Células Madre Del Cáncer Con La Aldehído Deshidrogenasa
De acuerdo con la teoría de la célula de vástago (CSC) de cáncer, sólo un pequeño subconjunto de las células cancerosas son capaces de formar tumores. Divulgamos previamente que CD44 aísla tumorígena células de cáncer de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). Estudios recientes indican que la actividad de aldehído deshidrogenasa (ALDH) puede representar un marcador más específico de CSC.
Exploración De Los Inhibidores Para Diaminopimelate Aminotransferasa
Bacterias y plantas superiores hacen de l-lisina del ácido diaminopimélico (DAP). En los mamíferos, l-lisina es un aminoácido esencial que deben adquirirse de la dieta como la vía biosintética está ausente este componente clave de las proteínas. Recientemente, ll-diaminopimelate aminotransferasa (ll-DAP-AT), un 5'-fosfato de piridoxal (PLP)-enzima dependiente, informó para catalizar un paso clave en la ruta a la l-lisina en plantas y Chlamydia. Inhibidores específicos de esta enzima así pueden llegar a servir como herbicidas o antibióticos que no son tóxicos para los mamíferos. En este trabajo, 29.201 inhibidores fueron defendidos contra ll-DAP-AT y se determinaron los valores IC(50) para los 46 compuestos superiores. Un derivados de aril maleica y rhodanine más fueron modificados para generar 20 análogos que también fueron probados contra ll-DAP-AT. Estos análogos proporcionan relaciones estructura-actividad adicional (SAR) que son útiles en la orientación más diseño de inhibidores.
Control Del Comportamiento Neuronal De Células De La Cresta Y La Migración: Perspectivas Desde El Barómetro De Imágenes En Vivo
Las células de la cresta neural (CCN) son un grupo notable, dinámica de las células que viajan largas distancias en el embrión para llegar a sus lugares de destino. Ellos son responsables de la formación de los huesos y cartílagos craneofaciales, neuronas y glía en el sistema nervioso periférico, y las células de pigmento. Vivo de imágenes de los países contribuyentes netos a medida que atraviesan el embrión ha sido fundamental para aumentar nuestro conocimiento de su biología. CCN presentan comportamientos múltiples y se comunican entre sí y su entorno a lo largo de cada etapa de su viaje. Imagen combinada con manipulaciones moleculares ha conducido a una visión de los mecanismos de control de estas conductas. En esta revisión, se destacan los estudios que han utilizado imágenes en vivo para dar una idea novedosa en el NCC de la migración y analizar cómo el uso continuado de estas técnicas puede mejorar nuestra comprensión de la biología del NCC.
Reglamento De Adherencias Y Motilidad Celular Durante El Inicio De La Migración Neuronal Crest
Precisa de células de la cresta neural (CCN) la migración requiere un estricto control de las adhesiones celulares, la dinámica del citoesqueleto y la motilidad celular. Cadherinas y RhoGTPases son críticos jugadores moleculares que regulan las adherencias y la motilidad durante la primera delaminación de los países contribuyentes netos de la neuroepitelio. Estudios recientes han puesto de manifiesto las múltiples funciones de estas moléculas y sugieren que un balance preciso de sus actividades es crucial. RhoGTPase parece regular tanto adhesiones celulares y las fuerzas durante la protrusión NCC delaminación. Cada vez hay más evidencia de que cadherinas son multi-funcional de las proteínas con la novela, de adhesión independientes de las funciones de señalización que controlan la motilidad NCC durante tanto delaminación y la migración. Estas funciones suelen estar regulados por escisión proteolítica específica de las cadherinas. Después de NCC delaminación, polaridad celular plana de señalización a través de actos RhoGTPases para controlar salientes del CNC y la dirección de la migración.
Cabeza Y Cuello De Células Madre Del Cáncer: La Población De Lado
La teoría de la célula de vástago (CSC) de cáncer concluye que una subpoblación de células cancerosas, las células de cáncer, pueden autorrenovarse y son responsable del crecimiento del tumor. Estudios previos han identificado células capaces de eflujo Hoechst 33342 tinte como la población de lado (SP). SP células y CSC comparte muchas características, sugiriendo el SP aislado de tumores malignos contiene CSC.
La Estructura Del LL-diaminopimelate Aminotransferasa De Chlamydia Trachomatis: Implicaciones Para Su Especificidad De Sustrato Amplio
Hemos divulgado previamente las estructuras de los nativo holo y formas de sustrato-limite de LL-diaminopimelate aminotransferasa de Arabidopsis thaliana (AtDAP-AT). Aquí, Divulgamos el cristal y las estructuras moleculares de la aminotransferasa de LL-diaminopimelate de Chlamydia trachomatis (CtDAP-AT) en el apo-forma y la forma de piridoxal-5'-fosfato-bound. La estructura molecular de CtDAP-AT demuestra que su doblez general es esencialmente idéntica a la de AtDAP-AT excepto que CtDAP-AT adopta una conformación "abierta" en contraposición a la conformación de "cerrada" de AtDAP-AT. Aunque AtDAP-a y CtDAP-a son idéntico en su secuencia principal aproximadamente el 40%, tienen grandes diferencias en sus especificidades del sustrato; AtDAP-AT es altamente específico para LL-DAP, mientras que CtDAP-AT acepta una amplia gama de sustratos. Puesto que todos los residuos que intervienen en el reconocimiento del sustrato están muy conservadas entre AtDAP-a y CtDAP-a, proponemos que las diferencias en la flexibilidad de los lazos de la guarnición de la región de sitio activo entre la cuenta de dos enzimas probablemente las diferencias en la especificidad de sustrato.
