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Articles by Mayuresh M Abhyankar in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Desarrollo de un marcador negativo seleccionable para Entamoeba histolytica
Division of Infectious Disease and International Health, University of Virginia Health System
Se presenta el desarrollo de un sistema de selección negativa en
Other articles by Mayuresh M Abhyankar on PubMed
Reconstitución De La Replicación Del ADN R6K in Vitro Utilizando 22 Proteínas Purificadas
Nos hemos reconstituido un sistema multiproteínas formado por 22 proteínas purificadas que catalizaron la iniciación de la replicación específicamente en ori gamma de R6K, alargamiento de las horquillas y su terminación en terminadores de replicación específica. La iniciación era estrictamente dependiente en el pi de proteína plasmídico iniciador y en el iniciador de host-codificado DnaA. El pi de tipo salvaje fue casi inerte, mientras que una forma mutante que contiene 3 sustituciones de aminoácidos que tienden a monomerize la proteína fue eficaz en la iniciación de la replicación. La replicación in vitro fue preparada por primase DnaG, mientras en un sistema de extracto crudo que no había sido fraccionado, que era dependiente de ARN polimerasa. La proteína ADN-flexión que IHF era necesaria para la replicación óptima y su sustitución por HU, a diferencia del sistema oriC, fue menos efectiva en la promoción de replicación óptima. Por el contrario, el tipo salvaje mediada por pi replicación in vivo requiere IHF. Utilizando una plantilla que contiene gamma ori flanqueado por dos sitios de Ter asimétrico colocados en la orientación bloqueo, replicación procedió en el modo de tipo de Cairns y generaron los esperado tipos de productos de terminación. La mayoría de las moléculas progresó hacia la izquierda de la ori, en la misma dirección que se ha observado en vivo. Muchas características de la replicación en el sistema reconstituido parecían los de replicación in vivo mímico. El sistema desarrollado aquí es un hito importante para continuar el análisis bioquímico de este interesante replicón.
Investigaciones Bioquímicas Del Control De La Iniciación De La Replicación Del Plásmido R6K
La base mecanicista del control de la iniciación de la replicación del plásmido R6K fue investigada por abordar las siguientes preguntas. ¿Cuáles son los atributos bioquímicos de mutaciones en la proteína de iniciador de pi que causó la pérdida de control negativo de iniciación? ¿El control primario implican interacción de ADN de proteína-ori único iniciador o también implican interacciones proteína-proteína entre pi y varias proteínas codificada en host? Las mutaciones en dos diferentes regiones de la secuencia de codificación de pi individualmente causaban cierta pérdida de control negativo según lo indicado por un relativamente modesto aumento en el número de copias. Sin embargo, combinaciones de la mutación P42L, que causó la pérdida de bucles de ADN, con los situados en la región entre los residuos 106 y 113 inducida por una sólida mejora de copiar el número. Estas formas mutantes promueven mayores niveles de replicación in vitro en un sistema reconstituido, compuesto por 22 proteínas purificadas. Las formas mutantes de pi fueron susceptibles a pronunciado inducida por iteron monomerization en comparación con la proteína WT. En contraste con los cambios en la interacción de ADN y proteínas, encontramos diferencias detectables en la interacción proteína-proteína entre pi de tipo salvaje con DnaA, DnaB helicasa y primase DnaG por un lado y entre las formas mutantes de copia alta y las proteínas de anfitrión mismo por el otro. La interacción DnaG-pi registrados aquí es novela. Tomados en conjunto, los resultados sugieren que tanto pérdida de control negativo debido a monomerization de iteron-inducida del iniciador e interacción mejorada iniciador iteron parecen ser las principales causas de número de copia mejorada.
Reconstitución De La Replicación Del ADN De Factor F in Vitro Con Las Proteínas Purificadas
Jacob, Brenner y Cuzin fue pionera en el desarrollo del plásmido F como sistema modelo para estudiar el control de la replicación, y estas investigaciones condujeron al desarrollo del "modelo replicón" (Jacob, f el., Brenner, S. y Cuzin, f el. (1964) Cold Spring Harbor Symp. Cantidad Biol 28, 329-348). Para aclarar aún más el mecanismo de iniciación de la replicación de este plásmido y su control, nosotros hemos reconstituido su replicación in vitro con 21 proteínas purificadas codificada en host y el iniciador plasmídico RepE. La replicación in vitro específicamente se inició en la ori F (oriV) y requiere tanto la proteína bacteriana iniciador DnaA y el iniciador plasmídico RepE. El tipo salvaje dimérico RepE fue inactivo en la catálisis de replicación, mientras que una forma mutante monomérica llamada RepE(*) (R118P) fue capaz de catalizar la replicación vigorosa. La topología de replicación era sobre todo de la forma de Cairns, y el movimiento de la horquilla era unidireccional y sobre todo de derecha a izquierda. La replicación dependía de la proteína HU y el ADN estructural y funcionalmente relacionados con flexión proteínas que IHF no podría sustituir eficientemente HU. El oscurecimiento dependía de primase DnaG. Muchas de las características de la replicación in vitro estrechamente mímico los de replicación in vivo. Creemos que el sistema in vitro debe ser muy útil en el mecanismo de iniciación de la replicación y su control.
Un Aislante De Vertebrados Novela Libre De CpG Silencia El Gen De La SP-10 De Testículo Específicos En Tejidos Somáticos: Papel Para TDP-43 En Función Del Aislador
Regulación de la transcripción de genes específicos del tipo de célula es fundamental para el desarrollo y diferenciación celular. Durante la espermatogénesis, un número de genes específicos de testículo se expresa en un orden preciso de espacio-temporal. ¿Cómo permanecen en silenciosos en los tejidos somáticos estos genes no se comprende bien. Nuestros estudios previos con el gen de SP-10 ronda spermatid específico del ratón, que codifica para una proteína acrosómica, reveló que su promotor proximal actúa como aislante y evita la expresión en los tejidos somáticos. Aquí se reporta que el aislador anclar el gen de la SP-10 a la matriz nuclear en tejidos somáticos, secuestrar el promotor de la base en el proceso, evitando así la transcripción. En espermátidas redondas donde se expresa el gen de la SP-10, esta inmovilización se libera. Proteína de unión a DNA de alquitrán de 43 kDa (TDP-43), demostrada previamente para interactuar con el aislador de SP-10, se encontró que en la fracción de la matriz nuclear de 2 m de NaCl-insoluble. TDP-43 prevenir interacciones potenciador-promotor artificialmente reclutados entre los dos por estrategia Gal4. Caída de TDP-43 utilizando ARN interferente pequeño había lanzado el efecto potenciador del bloqueo del aislador SP-10 en un modelo de cultura de célula estable. Mutación de sitios de unión de TDP-43 suprimió este efecto. Finalmente, un subfragment de 50-bp del aislador SP-10, que incluye sitios de unión de TDP-43, funcionó como un aislante mínimo en ratones transgénicos y silenciados por otro lado expresó ectópicamente transgén en tejidos somáticos. El aislador de SP-10 carece de dinucleótidos CpG o sitios de unión de CTCF. Así, el presente estudio caracteriza un aislador vertebrado novela en un contexto fisiológico y demostró por primera vez cómo un gen específico de testículo está silenciado en los tejidos somáticos por un aislador.
Función De Un Aislador En La Transcripción De Genes Específicos De Testículo
Promotores específicos de testículo son únicos en eso relativamente cortos proximales promotores de varios genes han demostrado ser capaces de dirigir la expresión específica de tejido y células tipo en ratones transgénicos. ¿Cómo dichos fragmentos pequeños promotor realizan las funciones duales de mantener un estado silenciado en tejidos somáticos y activación de la expresión génica en el tipo correcto de la célula de germen en testículo sigue siendo mal entendida. Estudios de nuestro laboratorio utilizando el gen de SP-10 ronda spermatid específicos como modelo experimental han proporcionado algunas ideas sobre los mecanismos implicados. Se encontró que el promotor proximal del gen SP-10 actúa como un elemento aislante o límite de cromatina en tejidos somáticos y previene la transcripción del gen SP-10. En las espermátidas redondas, se alivia la función aislante, facilitando así la transcripción del gen de SP-10. Aisladores actúan como bloqueadores de reforzador o barreras para proteger la expresión programada de un gen de la heterocromatina. Típicamente, los aisladores son separables de promotores. En el caso del gen de la SP-10, sin embargo, el aislador superpone el promotor y opera de manera facultativa. Presumimos que los promotores proximales de algunos genes específicos de testículo han adaptado a la función de aislante para mantener silencio transcripcional en los tejidos somáticos.
Caracterización De Una Proteína De Alta Movilidad-grupo Caja De Entamoeba Histolytica Inducida Durante La Infección Intestinal
Los eucariotas unicelulares Entamoeba histolytica es un parásito humano causante de la disentería amebiana y absceso hepático. Un análisis del genoma de la expresión génica modulada por la invasión y colonización intestinal identificó una transcripción de alza que codifican una proteína supuesta alto-movilidad-grupo caja (HMGB), EhHMGB1. Probamos si EhHMGB1 codifican una proteína funcional de HMGB y determina su papel en el control de la expresión génica de parásito. EhHMGB1 recombinante fue capaz de doblar el ADN in vitro, una característica de las proteínas HMGB. Residuos de núcleo conservada necesarios para doblar la actividad en otras proteínas HMGB de ADN fueron demostrados por el análisis mutacional esencial para la actividad EhHMGB1. EhHMGB1 también fue capaz de aumentar la Unión de p53 humana a su secuencia de ADN cognado in vitro, que se espera para una proteína HMGB1. Microscopia confocal, usando los anticuerpos contra la proteína recombinante, confirmó su localización nuclear. Sobreexpresión de EhHMGB1 en HM1:IMSS trofozoitos condujo a la modulación de las 33 transcripciones implicadas en una variedad de funciones celulares. De éstos, 20 fueron también modulada en día 1 o el día 29 en el modelo murino de la amebiasis intestinal. En particular, cuatro transcripciones con papeles conocidos en virulencia, incluyendo dos cadenas ligeras de la lectina de Gal/GalNAc, de codificación fueron moduladas en respuesta a la sobreexpresión de EhHMGB1. Llegamos a la conclusión que EhHMGB1 era una proteína buena fe de HMGB con capacidad para recapitular parte de la modulación de la expresión génica de parásito huaycos adaptación al intestino del huésped.
Desarrollo Del Sistema Gateway Para La Clonación Y Expresión De Genes En Entamoeba Histolytica
El temprano ramificación eucariotas Entamoeba histolytica es un parásito humano que es el agente etiológico de la disentería amebiana y absceso hepático. La secuenciación del genoma de E. histolytica, combinado con el desarrollo de un microarray de E. histolytica ha dado como resultado la identificación de varios perfiles de expresión de distintos genes asociados a virulencia. La función de muchas transcripciones moduladas es desconocida y su papel en la patogenicidad está claro. Sin embargo, representan un conjunto de factores de virulencia potenciales que podrían ser objetivos para el desarrollo de nuevas terapias. Eficientes herramientas y métodos para caracterizar estos nuevos genes asociados a virulencia y proteínas sería beneficiosos. Aquí divulgamos el uso de la Gateway((R)) sistema de clonación para generar la E. histolytica expresión vector pAH-DEST. Para comprobar la utilidad de este sistema, el vector se utilizó para la construcción de un plásmido que contiene una versión recombinante del locus EHI_144490, que codifican una proteína de función desconocida. Se expresó el gen recombinante y la proteína recombinante, que fue etiquetado como estreptococos-myc, demostró una localización citoplásmica en trofozoitos transfected. Este vector de expresión con el sistema Gateway((R)) debe facilitar la investigación sobre las funciones de nuevas proteínas en E. histolytica.
