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Articles by Merav Socolovsky in JoVE
JoVE General
CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析
直接収穫したてのマウスの骨髄、脾臓や胎児の肝臓における分化段階特異的マウス赤血球前駆細胞と前駆体の同定と分子解析のためのフローサイトメトリー法。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119、およびセルサイズに依存しています。
Other articles by Merav Socolovsky on PubMed
エリスロポエチン受容体のシグナル伝達ドメインは、プロラクチン受容体変異体乳腺上皮を救う
サイトカインホルモンのプロラクチンおよびエリスロポエチンは、それぞれ同族受容体、プロラクチン受容体（PrlR）とエリスロポエチンレセプター（EPOR）を活性化することによって、組織特異的発達の成果を媒介する。 PrlRの主な機能は、妊娠中や授乳期の乳腺[オーマンディ、C.らの開発であるのに対し、EPORは、赤血球の形成に不可欠である。 DEV（1997）遺伝子。 11、167から178]。分化の有益なモデルは、異なる、サイトカイン依存発達成果は系統特異的遺伝子の誘導をもたらすサイトカイン受容体に固有の信号の結果であることを提案している。 （ - / - ）赤芽球前駆細胞および赤血球細胞への分化を媒介するこのビューは、外因的に発現してPrlRはEPORを救うことができるという我々の発見によって挑戦された。一緒に他の造血系統で同様の所見と、これは、サイトカイン受容体は造血系への分化に有益な役割を果たしていないことが示唆された。ここでは、これらの知見は、造血系に限定されないことを示しているが、サイトカイン依存性の分化がより一般的な関連性があります。 （ - / - ）乳腺上皮がPrlR細胞外ドメインは、EPORの膜貫通および細胞内ドメインに参加して含まれている外因性発現するキメラ受容体（PRL-EPOR）によって救助された我々はPrlRの発達欠陥があることを示している。 （ - / - ）乳腺上皮を、野生型PrlRのように、PRL-EPORはPrlRでalveologenesisと乳汁分泌を救助した。これらの結果は、細胞タイプで赤血球と乳腺上皮細胞のような無関係のように、サイトカイン受容体は、所定の、組織特異的分化プログラムの表現を可能にする同様に、一般的な信号を採用することを示唆している。
RbとN-rasのは、マウスの分化を制御するために一緒に機能
網膜芽細胞腫の腫瘍抑制遺伝子（RB）の製品は、細胞増殖を制御し、分化を促進することができます。 RBのnullizygousマウス胚は、細胞周期調節、アポトーシスの制御、および骨格筋、神経系、レンズを含むいくつかの組織の分化の欠陥で妊娠中期に死亡しています。以前の細胞培養ベースの実験では、網膜芽細胞腫タンパク質（pRbの）とRasは細胞分化を制御するための共通の経路で動作することを示唆している。ここでは、プロトオンコジーンN-rasのは、N-rasおよびRbの両方を欠損するマウス胚を生成し、特徴づけることにより、分化のRb-依存性の調節に関与するという仮説をテストしました。我々は、N-rasの削除は寿命の大幅な拡張子で、その結果、Rbのnullizygosityに関連付けられている発達障害の一意のサブセットを救出することを示している。 RB（ - / - ）、N-RAS（ - / - ）骨格筋のRb-欠損胚とは対照的に、通常の繊維密度、筋管の長さと厚さを有する。さらに、Rbは（ - / - ）、N-RAS（ - / - ）筋肉が遅れて筋肉特異的遺伝子MCKの発現の回復を示し、RbでMyoDの転写活性の有意な増強は、この相関（ - / - ）、N-RAS（ - / - ）、Rbに比べ（ - / - 文化の中で）筋芽細胞。 Rbで骨格筋の改善分化（ - / - ）、N-RAS（ - / - ）胚としてのRb-欠損動物に見られるように、規制緩和の増殖とアポトーシスの証拠にもかかわらず発生します。我々の調査結果は、Rbによって分化と増殖の制御が遺伝的に分離可能であることを示唆している。
マウス胎児肝細胞の赤血球分化におけるRasシグナルの役割：フローサイトメトリーベースの新規培養システムによる機能解析
Rasシグナルは造血において重要な役割を果たしている。その機能は広範囲に赤血球とnonerythroid細胞株で同様に主要な赤芽球で研究されているが、従来の赤芽球コロニー形成単位（CFU-E）アッセイを使用して決定的な結果は赤血球分化におけるRasシグナルの役割について得られた。ここでは、端末の胎児肝赤芽球の増殖と分化およびin vivoでその密接に反復する赤血球の開発をサポートする新たな培養系を説明します。赤血球分化をフローサイトメトリー解析による手順と定量的に順を追って監視されているが、この分析では、分化の異なる段階にCD71及びTER119二重染色した赤芽球を区別します。赤血球分化におけるRasシグナル伝達の役割を研究するために、異なるH-rasの蛋白質は二シストロン性レトロウイルスシステムを利用したCFU-Eの前駆細胞および初期の赤芽球で発現させ、CFU-Eコロニー形成と赤血球分化に及ぼす影響を分析した。のみ発癌性H-rasのではなく、ドミナントネガティブH-RASは、CFU-Eコロニー形成を減少させた。新しく開発したシステムに感染した赤芽球の分析では、発癌性H-rasのブロックターミナル赤血球分化ことではなく、分化した赤血球細胞のアポトーシスを促進することであった。むしろ、発癌性のH-rasはCFU-Eの前駆細胞および初期の赤芽球の異常増殖を促進し、それらのエリスロポエチン（EPO）非依存性増殖をサポートしています。
成人および胎児造血および内皮細胞の幹細胞性白血病19幹細胞エンハンサーのトランスジェニック解析
適切な転写調節は、幹細胞白血病（SCL）遺伝子を含む多くの主要な調節遺伝子の生物学的機能に重要である。 SCL転写調節の系統的郭清の一部として、我々は以前に胎児と成人の造血前駆細胞と幹細胞（HSC）と一緒に胚の内皮細胞を標的と5245 bpのSCL 18/19エンハンサーを同定した。このエンハンサーは、造血前駆細胞および幹細胞を操作するための強力なツールであることが証明されていますが、このようなトランスジェニック研究の設計や解釈は、in vivoでのエンハンサー活性を詳細に理解する必要があります。本研究では、18/19エンハンサーは、マスト細胞、巨核球、成人の内皮細胞でアクティブであることを示している。 644-bpの19コアエンハンサーは、開発中および成体マウスの両方の5245-bpの18/19断片に類似した時間的·空間的活性を示した。真核生物のレポーター遺伝子、ヒト胎盤アルカリホスファターゼにリンクされたときに18/19エンハンサーとは異なり、19コアエンハンサーは、成体マウスでのみ有効であった。造血幹細胞の単一コアエンハンサー、内皮細胞、マスト細胞、巨核球の活性は、それぞれの転写プログラムの可能性と重なることを示唆している。また、胸腺細胞や他のSCL-陰性細胞型の割合の活動は、他のSCL座でサイレンサーの存在が示唆された。
生体内におけるエリスロポエチンストレス応答時のエリスロポエチン仲介赤芽球膨張によるFas誘導FasLの共発現の抑制
エリスロポエチン（EPO）はその受容体、EPORを介して、低酸素ストレスに対する赤血球造血反応の主要な調節因子である。ストレス反応を媒介するEPOR信号はほとんど不明であり、ストレス応答性前駆体のスペクトルは完全に定義されていません。ここでは、in vivoでのストレス応答TER119 + CD71highFSChigh初期の赤芽球のサブセットを識別するために、フローサイトメトリーを使用していました。マウスの脾臓、赤血球の予備臓器では、初期の赤芽球は、低い周波数で存在し、骨髄に相当する細胞よりアポトーシスの割合が高いことを受けていた。脾臓の初期の赤芽球の割合が高い死受容体Fasを共発現させ、およびそのリガンド、Fasリガンド。 FAS-陽性早期赤芽球が示唆され、同等のFas陰性細胞よりも共発現するアネキシンVに有意に高かったこと、in vivoでのFas媒介初期の赤芽球のアポトーシス。我々は、赤血球増加症、β-サラセミアを含む、赤血球のストレスのいくつかのマウスモデルを検討した。我々は、その細胞表面からFasとFasLのダウンレギュレーションと相関して脾臓の初期の赤芽球の頻度が劇的な増加を発見した。さらに、EPOの単回注射は、特に初期の赤芽球のFasとFasLのmRNAと細胞表面発現を抑制した。したがって、FasとFasLは、赤血球の負の調節因子である。赤芽球FasとFasLのEPO媒介抑制は、生体内での赤芽球の拡大を促進する新たなストレス応答経路である。
ストレス造血に分子の洞察
ベースラインの赤血球産生の本質的な役割に加えて、ホルモンのエリスロポエチンは、低酸素ストレスに対する赤血球造血反応を駆動します。ストレス赤血球生成のメカニズムの理解は、複数の臨床現場に利益をもたらす、と理解白血病に役立つ可能性があります。
FASの仲介によって負の自己調節堅牢な胎児の造血
組織開発は、発育速度を制御し、最終的な組織の質量を決定するシグナル伝達ネットワークによって規制されています。ここでは、赤血球組織開発の前駆細胞間の規制のフィードバックとフィードフォワードの相互作用を識別するために用いられる新規な計算アルゴリズムを提示する。アルゴリズムは、マウスの胚日12と15の間に赤血球前駆細胞の動的測定を利用しています。それは赤血球の発達過程を再現し、外部摂動に対するロバスト性とそれを与える細胞間相互作用のために選択します。この分析では、負の自己調節の相互作用が類似した成熟期の初期の赤芽球との間で発生すると予測している。死の受容体Fasの変異胚を研究することによって、またはそのリガンド、FASL、およびin vivoでのFAS介在性アポトーシスの速度を測定することによって、我々は、FasとFasLは、胎児の赤血球の重要な負の調節因子であることを示す方法でで予測される計算モデル。我々は成熟に達した赤血球の数を調整する赤血球の開発を媒介堅牢な恒常性のアポトーシスを示唆している。
赤血球産生の重要なコミットメントのステップは、PU.1とS期の進行間の相互阻害を介して細胞周期のクロックに同期されてい
造血前駆細胞は、いくつかの細胞分裂サイクルをナビゲートしながら、差別を受けるが、それはこれらの2つのプロセスが結合されているかどうかは不明である。我々は、in vivoでのマウス胎児の肝臓で赤血球生成を研究することによってこの問題に対処しました。我々は、細胞表面CD71の初期レギュレーションはしっかりS期に同期している発達にマッチ赤芽球を識別することがわかった。我々は、これではなく後続のサイクル内でのDNA複製は、正確なタイミング以前に知られていなかった、迅速かつ同時コミットの遷移を有する分化のスイッチが必要になります。表示これらは、エリスロポエチン依存性の発現、赤血球のマスター転写調節因子GATA-1の活性化、およびβ-グロビン遺伝子座の活性クロマチンの立体構造へのスイッチが含まれています。具体的には、S期の進行はDNase I高感受性部位を形成するために、この遺伝子座におけるDNA脱メチル化のために必要となります。機構的に、我々は、このキーコミットステップ中にS期の進行はサイクリン依存性キナーゼP57のダウンレギュレーション（KIP2）に依存していることを示し、順番にPU.1のダウンレギュレーション、GATA-1機能のアンタゴニストを引き起こします。これらの知見は、したがって、細胞周期の出口での既知の関数に異なる分化におけるサイクリン依存性キナーゼ阻害剤のための新たな役割を強調表示します。さらに、PU.1の発現とS期の進行の間に小説、相互抑制が重要な差別化イベントの正確な調整を確保するため、細胞周期のクロックに赤芽球分化プログラムを "ロック"と "シンクロ"のメカニズムを提供することを示しています。
イムノフィリンアリール炭化水素受容体と相互作用する蛋白質によるアポトーシスの発生制御（AIP）は、サバイビン蛋白質のミトコンドリアインポートを伴い
サバイビンは、細胞分裂とアポトーシスの抑制に重要な役割を持つ多機能タンパク質であるが、その細胞保護特性の分子基盤はほとんどわかっていない。 （ - ）ここではアリール炭化水素受容体と相互作用するタンパク質（AIP）、サバイビン関連イムノフィリンは、TER119の増加アポトーシス、胎生13.5から14までで、マウスの胚性致死を引き起こし、そのホモ接合性欠失表示/ CD71（ - ）初期の赤血球前駆細胞、およびin vivoでの細胞質とミトコンドリアのコンパートメントにおけるサバイビン発現の損失。組換えタンパク質を使用してインポートアッセイでは、AIPは、直接このようにAIPがミトコンドリアにインポートし、アポトーシスを阻害しなかったされていないバインドされませんサバイビン1から141変異体に対し、その抗アポトーシス機能を有効にすると、ミトコンドリアにサバイビンの輸入を仲介。サバイビンのAIP-監督ミトコンドリアのインポートは、細胞分裂に影響を及ぼさなかった、細胞小器官の膜電位とは独立していた、シャペロン熱ショックタンパク質90（HSP90）を必要とせず、正常な細胞に存在する細胞質因子（s）によって阻害された。 TOM 70のサイレンシングには影響を及ぼさなかったのに対し、ミトコンドリアのインポート受容体Tom20のshRNAのノックダウンは、アポトーシスにサバイビンのミトコンドリアのインポートおよび感作腫瘍細胞を廃止した。したがって、AIP-Tom20認識はサバイビンのミトコンドリアインポートを仲介することにより、開発および癌における細胞の生存に貢献しています。
Fas抗体による負の自己調節は大人造血を安定化とそのストレス応答を加速
貧血では赤血球の生産を加速ストレス応答、失血や高高度をマウント中に赤血球は、基底状態での安定したヘマトクリット値および組織酸素化を維持しています。したがって、組織低酸素は、赤血球前駆細胞および赤血球率の増加を刺激し、ホルモンのエリスロポエチン（EPO）の分泌を増加させます。いくつかの細胞分裂のEPO反応性前駆細胞が赤血球に成熟する前に、しかし、経過しなければなりません。この固有の遅延は、赤血球の安定性を減らすために、ストレスへの応答を遅くすることが期待されています。ここでは、これらの影響を相殺するのに役立ちメカニズムを識別します。我々は最近、その脾臓早期赤芽球、 'EryA'、負死受容体Fasを共発現させることによって、自分の生存を調節すると、そのリガンド、Fasリガンドを示した。ここでは、Fas欠損に関連付けられている自己免疫症候群を避けるために、免疫不全の背景に飼育は、FasまたはFasLのいずれかの変異マウスを調べた。変異マウスは、Fasに悪影響全体の動物のレベルで赤血球生成を調節することが示唆され、高いヘマトクリット値、低い血清Epo、および脾臓の赤血球前駆細胞数の増加があった。変異マウスは、一致した対照マウスよりもはるかに多くの変数EryAプールを持っていたので、さらに、Fas誘導を介した自己調節は、脾臓の初期の赤芽球·プールのサイズを安定させます。予期せず、負のレギュレータの損失にもかかわらず、高いin vivoでのEPOと同様に、EPOと注入または低酸素環境に置かれたマウスの赤血球率の増加に対応してEryAとProEの前駆細胞の拡大は、が大幅に遅れ変異マウス。これは、Fas誘導を介した自動調節がストレスに赤血球造血反応を加速を示唆している。したがって、脾臓の赤血球造血組織内でのFas媒介負の自己調節、ストレス応答を加速しながら、基底状態では赤血球の恒常性を維持するのを助け、全体として赤血球ネットワークの運用において重要な動的な機能を最適化します。
In Vivoマウス造血時にグローバルなDNA脱メチル化
哺乳類のゲノムでは、 '、5'-CpGの3ヌクレオチドは、しばしば転写サイレンシングと相関し、メチル化されている。ゲノムワイドなメチル化は、始原生殖細胞や着床前の胚では、開発時にのみ回発生すると考えられている。これらの脱メチル化イベントは、開発全体に継承され、組織特異的遺伝子座でのみ変更されたパターンを設定し、de novoのメチル化が続いている。我々は、ゲノム規模の縮小表現重亜硫酸塩シークエンシング（RRBS）を用いてin vivoでのマウス赤芽球を分化におけるDNAメチル化を調べた。赤血球特異的β-グロビン遺伝子座のメチル化は、ほとんどのゲノム要素のグローバルなDNAメチル化と一致した。グローバルな脱メチル化は、分化し、必要な迅速なDNA複製の全体の連続でした。したがって、DNA脱メチル化は、開発および疾患におけるその研究のための実験モデルを提供し、体細胞分化の間にグローバルに発生することがあります。
のBcl-xLおよびBIMエリスロポエチン生存経路の生体内での動的応答を対比
エリスロポエチン（EPO）受容体（EPOR）によるシグナル伝達生存率は、赤血球および低酸素ストレスでの加速のために不可欠です。いくつかの明らかに冗長なEPORの生存経路はin vivoでのその機能特化の可能性を高め、in vitroで同定された。ここでは、in vivoでの2赤芽球の生存経路の2つの大きく異なる応答のダイナミクスを識別するために、低酸素環境とβ-サラセミアを含む、急性および慢性的なストレスのマウスモデルを使用していました。アポトーシス促進タンパク質Bimの抑制が遅くなりますが、永続的である間、抗アポトーシスタンパク質Bcl-X（L）の誘導は、急速なしかし一時的なものです。感覚的適応と同様に、しかし、それは急性ストレスに新たに対応できるようにするBcl-X（L）経路 "がリセットされ、"慢性ストレス刺激に重畳された。使用して、 "ノックで"変異体EpoRsを発現するマウスモデルでは、我々は、Bcl-X（L）応答でその適応を発見したので、その上流のレギュレータStat5の適応が原因で発生し、EPOR遠細胞質ドメインを必要と両方。我々は、生存経路はストレス応答の急性および慢性の段階の以前は思いも寄らない機能的な分業を示すと結論付けている。遅くなりますが、恒久的な経路が活性化されるまでのBcl-X（L）誘導は、急性ストレスで "ストップギャップ"を提供しています。さらには、Bcl-X（L）の病理学的上昇は骨髄増殖性疾患のメカニズムへの影響で、障害の適応の結果であるかもしれません。
