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Articles by Michael K. Mansour in JoVE
JoVE Immunology and Infection
El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, The Ohio State University, 3Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Dept. of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University
Se describe un método para seleccionar de forma individual, manipular, y los agentes patógenos de imágenes en vivo con una trampa óptica acoplada a un microscopio de disco giratorio. La trampa óptica proporciona un control espacial y temporal de los organismos y los coloca junto a las células huésped. Microscopía de fluorescencia captura dinámica de interacciones intercelulares con perturbación mínima para las células.
Other articles by Michael K. Mansour on PubMed
Óptima T Cell Responses to Cryptococcus Neoformans Manoproteínas Dependen De Reconocimiento De Carbohidratos Conjugados Por Receptores De Manosa
Criptococosis son una causa principal de muerte entre personas con la función de la célula de T comprometido. Solubles Cryptococcus neoformans manoproteínas (MP) han surgido como prometedores candidatos vacunales debido a su capacidad para retrasar-tipo hipersensibilidad y Th tipo 1-como citoquinas, ambos fundamentales para la liquidación de esta levadura patógena. En este estudio, se analizaron los mecanismos responsables de las propiedades inmunoestimulantes potente de MP. Utilizando células de ovario de hámster chino que expresan receptores de manosa macrófago humano (MMR), determinamos que el MP es un ligando MMR. Funcionalmente, bloqueo competitivo de los receptores de manosa multilectin (MR) en APC disminuyó estimulación MP-dependiente de las células T primarias de ratones inmunizados y el hibridoma de célula de MP-reactivo CD4 T, P1D6, 72 y 99%, respectivamente. Eliminación de sacáridos O ligado de MP por beta-eliminación había inhibida estimulación MP-dependiente de la P1D6 y las células T primarias por 89 y 90%, respectivamente. Además, la estimulación MP-dependiente de P1D6 fue abrogada después de digestión con proteinasa K, sugiriendo el núcleo proteico de MP contribuyó la molécula antigénica presentada por APC. Estimulación de la P1D6 por MP también fue suprimida con APC obtenido ratones invariantes de la cadena-deficientes, demostrando presentación Ag fue MHC de clase II restringido. Nuestros datos sugieren que el MP es un ligando para la MMR y que estimulación celular T funcionalmente es inhibida por bloqueo competitivo de Señor o eliminación de residuos de carbohidrato críticos para el reconocimiento. La demostración de que las respuestas de la célula T eficiente a MP requieren reconocimiento de grupos de manosa terminal por MMR proporciona una base molecular para la inmunogenicidad de MP cryptococcal y apoyo a estrategias de vacunación dirigidos a Señor.
Interacciones De Hongos Con Los Fagocitos
Los avances recientes han ampliado nuestro conocimiento de la función única que neutrófilos, macrófagos y células dendríticas desempeñan en la protección de la hostia contra infecciones por hongos y los mecanismos por el cual hongos patógenos intentan subvertir las defensas fagocíticas. En este artículo, se examina la interacción entre los fagocitos y hongos.
Purificación Y Caracterización De Un Segundo Manoproteínas Immunoreactive De Cryptococcus Neoformans Que Estimula Las Respuestas Del T-Cell
Aunque las respuestas de células T son conocidas por ser crítica para las defensas del anfitrión eficaz contra el hongo patógeno Cryptococcus neoformans, los antígenos que estimulan respuestas protectoras caracterizan mal pero se cree que se compone, al menos en parte, de manoproteínas. Recientemente, hemos creado un panel de murino CD4 (+)-T-célula hibridomas que reaccionan con los antígenos de C. neoformans. Un antígeno de manoproteínas, MP98, que estimula a uno de los hibridomas se purificó, y fue clonado el gen que codifica la MP98. En el presente estudio, el antígeno criptocócico, MP88, que estimula una segunda hibridoma de células T, X5A3, que secretan interleucina-2 se caracterizó. MP88 se purificó de sobrenadantes de vidrio grano-disrupted C. neoformans por intercambio aniónico y cromatografía de interacción hidrófoba. Una única banda con una masa molecular aparente de 88 kDa fue resuelto por electroforesis del gel de poliacrilamida-sulfato de sodio dodecil y sometida a la secuencia de aminoácido interna parcial. El gen que codifica la MP88 fue clonado y secuenciado. MP88 cuenta con una región c-terminal de serina/treonina-ricos, que presumiblemente sirve como un sitio para amplia O glicosilación, seguido por un sitio de anclaje glicosilfosfatidilinositol putativos. Una búsqueda de bases de datos genómicos de C. neoformans reveló que MP88 comparte esta característica con al menos 11 otros genes, incluyendo MP98. La naturaleza de manoproteínas de MP88 se estableció basado en la capacidad de (i) la fracción de manoproteínas de sobrenadantes de C. neoformans para estimular la X5A3 y (ii) mannosylated ligandos para inhibir competitivamente esta estimulación. Así, se ha identificado un segundo manoproteínas cryptococcal que estimula respuestas de células T y es un candidato vacunal.
Eficacia Protectora De Fracciones Antigénicas En Modelos De Ratón De Criptococosis
Infecciones por hongo encapsulada Cryptococcus neoformans son una causa significativa de morbilidad y mortalidad en pacientes con disfunción de células T, particularmente aquellos con SIDA. Probablemente entonces, respuestas de células T a los antígenos criptocócica son críticas para la protección contra este hongo ubicuo. Para probar la eficacia protectora de estos antígenos como candidatos vacunales, antígenos cryptococcal secretados se separaron por concanavalina una cromatografía de afinidad en adherente (manoproteínas [MP]) y nonadherent (flujo [FT]) fracciones y las fracciones se probaron en modelos murinos de criptococosis diseminada. En comparación con adyuvante sola, ratones C57BL/6 que recibieron dos inoculaciones de MP y FT exhibieron supervivencia prolongada y reducción cerebro y riñón hongo carga tras desafío intravenoso con C. neoformans variedad B3501. MP-inmunizados animales habían aumentado cerebro niveles de factor de necrosis tumoral alfa, interferón gamma y la interleucina-2. La examinación histopatológica reveló que, en comparación con los órganos de los ratones que recibieron sólo adyuvante, MP-inmunizados ratones fueron capaces de reclutar un infiltrado celular más fuerte en el cerebro, el riñón y el hígado en respuesta a la infección por criptococos. Conjugado glycans vinculados O eran necesarias para una protección óptima mediada por MP, como química O deglycosylation reduce la eficacia protectora de la inmunización de MP. Inmunización FT y MP protegidos B-célula-deficientes, pero no ratones T-celular-deficientes, sugiriendo que la protección era mediada por células T. Ratones CBA/J que también se beneficiaron de la inmunización con FT y MP, aunque los beneficios eran más modestos que los que se ven con ratones C57BL/6. Así, tanto el MP y el FT fracciones de C. neoformans contienen componentes que protegen a ratones de criptococosis diseminada, y esta protección parece ser mediada por células T.
Participación De CD14, Receptores Toll-like 2 Y 4 Y MyD88 En La Respuesta Del Huésped Al Hongo Patógeno Cryptococcus Neoformans in Vivo
Los principales polisacáridos capsulares de Cryptococcus neoformans, glucuronoxylomannan (GXM), es reconocido por Toll-like receptor 2 (TLR2), TLR4 y CD14. En estos estudios, los ratones deficientes en CD14, TLR2 y TLR4, la proteína asociada a TLR adaptador, MyD88, fueron utilizados para investigar la contribución de TLRs y CD14 defensas del anfitrión en vivo contra C. neoformans. MyD88(-/-) ratones habían redujo significativamente la supervivencia en comparación con ratones C57BL/6 de tipo salvaje después intranasal (i.n.) y la infección por vía intravenosa (i.v.) con vivo C. neoformans. CD14(-/-) ratones habían reducido la supervivencia cuando infectan i.v., mientras que los ratones TLR2(-/-) significativamente antes murieron después de la infección i.n.. La mortalidad fue similar comparando ratones C3H/HeJ mutantes de TLR4 y controlar ratones C3H/HeOuJ tras desafío i.v. o i.n. con C. neoformans. El curso de Criptococosis pulmonar fue estudiado con más detalle en los ratones CD14(-/-), TLR2(-/-) y MyD88(-/-). MyD88(-/-) ratones infectados i.n. tenía un número mayor de UFC en los pulmones así como mayores niveles de GXM en el suero y los pulmones 7 días después de la infección de los ratones de tipo salvaje. Sorprendentemente, no hubo diferencias importantes en los niveles de factor de necrosis tumoral alfa, Interleucina-4 (IL-4), interferón gamma, IL - 12 p 70 o IL-10 en los pulmones de ratones knockout C. neoformans infectados en comparación con los ratones de tipo salvaje. El análisis histopatológico de los pulmones en postinfection de día 7 reveló inflamación mínima en todos los grupos de ratón. Estos estudios demuestran un papel importante para MyD88 y relativamente menor papeles para CD14 y TLR2 en la respuesta a la infección por criptococos, con la supervivencia disminuida de ratones MyD88(-/-) correlacionar con mayor número de niveles de pulmón UFC y suero y pulmón GXM.
KRE5 Gen Nulas Mutantes Cepas De Candida Albicans Son Avirulentas Y Han Alterado La Composición De La Pared Celular Y Propiedades De Formación De Hifa
La UDP-glucosa: glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT) es un sensor de retículo endoplásmico para control de calidad de glicoproteína plegable. Saccharomyces cerevisiae es que el organismo sólo eucariota descritas hasta ahora reglucosylation transitoria UGGT mediada por carecer de oligosacáridos N-ligado. El único gen en S. cerevisiae con semejanza a los UGGTs de codificación es KRE5. Cepas de S. cerevisiae KRE5 eliminación muestran niveles severamente reducidos de polímero de beta-1, 6-glucano de la pared celular, morfología aberrante y crecimiento extremadamente comprometida o mortalidad, según el fondo de la cepa. Eliminación de ambos alelos del gen de la Candida albicans KRE5 da lugar a células viables que son mayores que las del tipo salvaje (WT), tienden a agregar, han ampliado las vacuolas y mostrar los defectos de la pared de célula principales. C. albicans kre5/kre5 mutantes han reducido significativamente los niveles de beta-1, 6-glucano y más quitina y beta-1, 3-glucano y menos manoproteínas que la WT. El restante beta-1,6-glucano, alrededor del 20% de los niveles WT, exhibe un patrón de beta-1, 6-permitan la digestión, incluyendo una proporción estiramiento punto-a-lineal de la rama idéntica a la de las cepas WT, sugiriendo que el Kre5p no es un beta-1, 6-glucano sintasa. C. albicans KRE5 es un homólogo funcional de S. cerevisiae KRE5; complementa parcialmente el defecto de crecimiento y reducido pared celular beta-1, 6-glucano contenido de mutantes viables de S. cerevisiae kre5. C. albicans estirpes mutantes homocigóticos de kre5/kre5 son incapaces de hifas forma en varios medios sólidos y líquidos, incluso en presencia de suero, un potente inductor de la transición de dimorfismo. Sorprendentemente, los mutantes forman hifas en presencia de N-acetilglucosamina. Finalmente, C. albicans estirpes mutantes homocigóticos KRE5 exhiben una reducción del 50% en la adhesión a las células epiteliales humanas y son completamente avirulentas en un modelo murino de infección sistémica.
Separación Mediada Por Receptor Del Polisacárido Capsular De Neoformans De Cryptococcus En Vivo
Cryptococcus neoformans capsular glucuronoxylomannan (GXM) se desprende durante criptococosis y tomado por los macrófagos. Los papeles de los supuestos receptores GXM CD14, CD18, Toll-like receptor 2 (TLR2), y se estudiaron TLR4 en la remoción de GXM del suero y la deposición en el hígado y el bazo de los ratones deficientes en receptores. Mientras que se observaron alteraciones en la cinética de redistribución GXM en los ratones mutantes, ninguno de los receptores era absolutamente necesaria para la separación del suero o acumulación hepatoesplénico.
Una Vacuna Modelo Explotación De Hongo Mannosylation Para Aumentar La Inmunogenicidad De Antígeno
AG mannosylation representa una estrategia prometedora para aumentar la inmunogenicidad de la vacuna dirigiéndose a Ag a receptores de manosa (MRs) en células dendríticas. Porque hongos naturalmente mannosylate proteínas, presumimos que Ags en hongos tendría una capacidad mejorada para estimular las respuestas de células T. Usando el modelo Ag OVA, generamos proteínas que diferencialmente expresan mannosylation N - y O-ligado en la levadura Pichia pastoris y los compararon con su unglycosylated homólogos producidas en Escherichia coli. Encontramos que proteínas de OVA derivados de levadura que contiene N-vínculos, enlaces O extensas, o ambos eran más potente que la unmannosylated de Ags a inducir la proliferación de células T CD4 + OVA-específica. Esta elevada respuesta a Ags hongos fue inhibida por mannan, sugiriendo la implicación de la señora. Sin embargo, el macrófago Señor (CD206) no era esencial, porque células dendríticas del Señor deficientes de macrófagos eran plenamente competentes en la presentación de derivados de levadura OVA Ags. Así, el uso de fungicidas glicosilación para proporcionar mannosylation extensa o N-ligados O vinculados aumenta la capacidad del modelo Ag OVA para estimular las respuestas de células T Ag específicos en una forma dependiente de Señor. Estos datos tienen implicaciones para el diseño de la vacuna al proporcionar la prueba del principio que eso mannosylation derivados de la levadura puede mejorar la inmunogenicidad.
Cryptococcus Neoformans Glycoantigens Son Capturados Por Múltiples Receptores Lectinas Y Presentados Por Las Células Dendríticas
Celular – transmitida por inmunorespuestas a glycoantigens han sido en gran parte no caracterizados. Protección T cell responses to la levadura patógena Cryptococcus neoformans dependen fuertemente mannosylated Ags denominado manoproteínas. En el trabajo presentado, se determinó la respuesta inmune innata a manoproteínas. Se utilizaron células dendríticas esplénicas murinas purificadas (DC), células B y macrófagos para estimular los linfocitos T específicos manoproteínas. DC sólo eran capaces de cualquier estimulación mensurable. Agotamiento de DC dio lugar a la anulación de la respuesta de células T. DC humano y murino rápidamente había capturado manoproteínas marcado con fluorescente por un proceso de mediada por receptor de manosa. Utilizando líneas celulares transfected, el tipo II C-tipo lectina receptor C.C.-específicos ICAM-3 apropiación de nonintegrin (CD209) se determinó que tienen afinidad por manoproteínas. Tomado junto con trabajos previos, demostrando que manoproteínas fue capturado por el receptor de manosa de macrófagos (CD206), estos datos sugieren que varios receptores de manosa en DC reconocen manoproteínas. Pulsos experimentos demostraron que la DC capturado manoproteínas suficiente sobre 2 h a 50% de estimulación total. Capturar dependiente apareció en receptores de manosa, como inhibidores de la mannosylated competitivo y quelantes de calcio que cada uno interfirió con la estimulación de células T. Mediante microscopía confocal, manoproteínas intracelular traficada a un compartimiento endo-lysosomal en DC y en momentos más adelante extendidos en túbulos de manera similar al marcador degradación DQ-OVA. Manoproteínas colocalized intracelular con CD206 y CD209. Estos datos sugieren que la DC proporcionar el vínculo crucial entre las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas a C. neoformans mediante un proceso que depende de la absorción eficiente de manoproteínas por receptores de manosa.
Los Principales Determinantes Genéticos Del Afecto De Control Del VIH-1 HLA Clase I Presentación De Péptido
Enfermedades infecciosas e inflamatorias repetidamente han mostrado fuertes asociaciones genéticas dentro del complejo principal de histocompatibilidad (MHC); sin embargo, la base para estas asociaciones sigue siendo elusiva. Para definir los efectos genéticos anfitrión sobre el resultado de una infección viral crónica, realizamos el análisis de Asociación de genoma en una cohorte multiétnica de controladores de VIH-1 y progresistas, y se analizaron los efectos de los aminoácidos individuales dentro de las proteínas de clásica del leucocito humano (HLA) el antígeno. Identificamos > 300 genoma importantes nucleótido polimorfismos (SNPs en el MHC y ninguno en otros lugares). Aminoácidos específicos en la ranura de unión de péptido HLA-B, así como un efecto independiente de HLA-C, explicar las asociaciones de SNP y conciliar la protección tanto riesgo alelos HLA. Estos resultados implican la naturaleza de la interacción de péptido HLA-viral como el principal factor de modulación control durable de la infección por VIH.
Toll-like Receptor 9 Modula Macrófagos Efector Función Antifúngica En Reconocimiento Innato De Candida Albicans Y Saccharomyces Cerevisiae
Respuestas fagocíticas son fundamentales para la defensa del huésped eficaz contra los hongos patógenos oportunistas. Los macrófagos probar el contenido phagosomal y orquestar la respuesta inmune innata. Toll-like receptor 9 (TLR9) reconoce unmethylated CpG ADN y se activa por el ADN de hongos. Aquí demostramos que la activación específica de TLR9 de contratación a la membrana de los macrófagos phagosomal es una característica conservada de los hongos de los orígenes filogenéticos distintos, incluyendo Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Malassezia furfur, y Cryptococcus neoformans. La capacidad de desencadenar phagosomal TLR9 de contratación no se vio afectada por una pérdida de la viabilidad de hongos o la integridad de la pared celular. TLR9 deficiencia ha sido relacionada con una mayor resistencia a la candidiasis murino y de restricción del crecimiento fúngico en vivo. Los macrófagos que carecen de TLR9 demostrar una capacidad similar para la fagocitosis y la maduración phagosomal normal en comparación con los macrófagos de tipo salvaje. Ahora demuestran que la deficiencia de TLR9 de macrófagos aumenta el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) de producción en respuesta a C. albicans y S. cerevisiae, independiente de la viabilidad de la levadura. El aumento de TNF-α producción fue reversible por complementación funcional del gen TLR9, confirmando que TLR9 era responsable de modulación negativa de la respuesta de citoquinas. Por ello, la deficiencia de TLR9 mejorado la respuesta efectora de los macrófagos por aumentar la producción de óxido nítrico de macrófagos. Por otra parte, la actividad microbicida contra C. albicans y S. cerevisiae fue más eficiente en TLR9 knockout (TLR9KO) que en los macrófagos de tipo salvaje macrófagos. En conclusión, nuestros datos demuestran que TLR9 está compartimentado de forma selectiva a los fagosomas hongos y negativamente modula las funciones efectoras de los macrófagos antifúngicos. Nuestros datos apoyan un modelo en el que la orquestación de la inmunidad innata antifúngico implica una compleja interacción de las combinaciones de ligandos por hongos, reordenamientos de la célula huésped maquinaria, y la cooperación de TLR y el antagonismo.
Dinámica Virulencia: Evaluación En Tiempo Real De La Patogénesis Intracelular Fenotipo Enlaces Cryptococcus Neoformans Con El Resultado Clínico
Mientras que un gran número de estudios han examinado los factores del huésped que predisponen a las personas a la infección con el hongo patógeno oportunista Cryptococcus neoformans, relativamente poco se ha hecho para examinar cómo las diferencias de virulencia entre los aislamientos de los factores por criptococos puede afectar los resultados. En el reciente informe de Alanio et al. (A. Alanio, M. Ollivier Desnos, y Dromer F., mBio 2: e00158-11, 2011), la novela de la citometría de flujo basados en técnicas fueron empleadas para demostrar una asociación entre el fenotipo de C. neoformans-macrófagos interacciones, como medido por los resultados de la fagocitosis y la replicación intracelular, y el paciente, según lo determinado por cultivos positivos en la terapia y la supervivencia. Estos experimentos establecen que el pronóstico de los pacientes con criptococosis es influenciado por las características fenotípicas de la infección por hongos aislados.
El Uso De Fungicidas Derivados Conjugados Polisacárido-partículas Investigará Dectin-1 Respuestas En La Inmunidad Innata
El número de infecciones mortales por hongos ha aumentado en los pacientes inmunodeprimidos, y la identificación de las normas que rigen una respuesta inmune adecuada es esencial para desarrollar mejores diagnósticos y terapias destinadas. El componente de la pared celular externa sobre hongos patógenos consta de β-1 ,3-glucano, y Dectina 1-, un reconocimiento de patrones receptor presente en la superficie celular de las células inmunes, se une específicamente a este carbohidrato. Una barrera en la comprensión de la respuesta inmunológica a epítopos exacta de carbohidratos derivados de patógenos es la presencia de múltiples tipos de restos de carbohidrato en las paredes celulares de los hongos. Para diseccionar los mecanismos inmunológicos para el reconocimiento de patógenos, un sistema de "hongos como las partículas" se ha desarrollado, que consistía en perlas de poliestireno, que imitaban la forma tridimensional del hongo, recubiertas de forma covalente con β-purificada 1 ,3-glucano derivado de Saccharomyces cerevisiae. La morfología de la capa de β-1 ,3-glucano fue examinado por inmunofluorescencia, cytometery flujo, e inmuno-microscopía electrónica de transmisión. Los enlaces covalentes de la β-1 ,3-glucano a la superficie de poliestireno eran estables después de someter las perlas a los detergentes. Al pre-tratamiento de β-1 ,3-glucano perlas con laminarinasa, una específica β-1 ,3-gluconase, la reactividad del anticuerpo anti-β-1 ,3-glucano fue abrogada en comparación con el tratamiento con proteinasa K que indica que el revestimiento de estas perlas era predominantemente β-1 ,3-glucano. TNF-α también se midió por estimulantes de la médula ósea macrófagos derivados con las β-1 ,3-glucano perlas, y mostraron una respuesta dependiente de la dosis en comparación con solubles glucano β-, insoluble en β-1 ,3-glucano, perlas no revestidas, y soluble en β-1 ,3-glucano mezclado con perlas no revestidas. Finalmente, β-1 ,3-glucano cuentas fueron incubadas con las buenas prácticas agrarias Dectin-1 que expresan los macrófagos y utilizando imágenes de microscopía confocal. β-1 ,3-perlas se recogió en cuestión de minutos y retenido Dectina-1 a la contratación fagosoma en comparación con perlas no revestidas. Estos datos describen un único fungicida-como sistema de partículas que permitirá a los inmunólogos para investigar los pasos críticos en el reconocimiento temprano de los derivados de patógenos fúngicos antígenos de hidratos de carbono de las células inmunes.
