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Articles by Michael T. Yang in JoVE
JoVE General
微細加工後のアレイ検出器（mPADs）：機械的な力を単離するためのアプローチ
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2University of Washington
このビデオでは、我々は細胞の収縮性の変調を評価するための微細加工後のアレイ検出器を（mPADs）の製造と利用する方法を示しています。
Other articles by Michael T. Yang on PubMed
細胞表面の受容器の体外への VEGF バインディングのモンテカルロ ・ シミュレーション。
血管内皮増殖因子 （VEGF） 家族複数の血管内皮細胞表面の受容器をバインドします。私たちの目標は、目的の血管新生をシミュレートするためにこれらの相互作用の包括的なモデルを構築します。成長因子の in vivo および in vitro で確率的分子間相互作用のモデリングの低濃度からみた必要があります。ここでは、我々 は VEGF の確率の結合と細胞 in vitro で同等の確定的なシミュレーションをその主要な受容体の 2 つのモンテカルロ ・ シミュレーションを比較します。典型的な VEGF 濃度の範囲は契約で確率的および確定的なモデルです。しかし、生物の確率イベントには例えば、血管芽開始リンクされるかもしれない受容体結合の有意な変動を観察します。バインディングの変動性に直接影響、セルによって信号の空間統合を調査するためにさまざまなサイズのセル表面のパッチを研究し、単一細胞レベルまで有意な変動を見つけます。VEGF 受容体ダイマー化リガンド結合の変動を大幅に変更されません。'スライディング ウィンドウ' アプローチ削減は時空間統合による実証バインディングの可変性ではありません。ばらつきはどこバインディングに利用できるリガンド分子の数の小さい in vivo での状況でより顕著なことに期待です。
生きた細胞に力を加えるためのアプローチとして、磁気Microposts
細胞は外部から印加された、または細胞骨格を介して内部的に生成されたかどうかを機械的な力に応答します。別々に勢力に対する細胞応答を調べるために、我々は、細胞の牽引力に独立したセンサーを務めたエラストマーの記事の配列に散在コバルトナノワイヤーを含む微細磁気ポストを介して細胞に外部の力を適用した。磁界は、磁気の投稿を偏向し、配列に付着した細胞の個々の癒着に力を付与するナノワイヤーにトルクを誘導した。このシステムを使用して、我々は与えられた力に対する細胞の反応を検討し、アプリケーションのサイトではなく、近くには非磁性の記事では地元の接着斑の大きさの増加につながったステップの力を加えることがわかった。細胞は、同じ時間間隔内に複数の力の作動を行ったときに接着斑の採用がさらに強化されました。刺激の最初の分または数分以上の収縮が徐々に減衰内で発生した収縮性の突然の損失：そのような力の刺激に応答して牽引力を記録する2つの応答を明らかにした。応答の両方のタイプについては、牽引力の損失の細胞内分布が作動マイクロポストに近い場所に限定されていない、また、均一に全体のセルの両端ではなく、セルの周囲に沿って離散的な場所で発生しました。一緒に、これらのデータは、外部と内部の力の間の重要な動的な生物学的な関係を明らかにし、この相互作用を探索するために、この微細加工システムの有用性を示しています。
平衡乗算の静電相互作用の影響テトラヒドロピラン オキソカルベ イオン置換。
グリコシルトレハ ロース カチオンに関連 dioxocarbenium イオンの立体構造の分光学的、計算、分析と反応性のデータによって決定しました。仮説の低エネルギー構造の dioxocarbenium イオンの実験的決定 (1) H NMR 結合定数と求核置換反応からのジアステレオ選択性結果と相関が認められました。このメソッドは、C 3 アルコキシ置換システムの pseudoaxial 好みの確認、C 5 アルコキシメチルフェニルエステル グループのコンホメーションの好みを明らかにしました。一置換 C 5 アルコキシメチルフェニルエステル置換基、pseudoequatorial の配向が、C 5 C 6 債券回転静電効果によって制御されました。最寄りの diaxial conformer トランス-4, 5-ジ置換 tetrahydropyranyl 系の平衡を口述静電効果の重要性を強調しました。2 Deoxymannose システムでは、立体効果を C 5 アルコキシメチルフェニルエステル置換基の配向の影響がすべて軸の conformer のための静電安定化支持だった。
3D Microtissuesから力を測定し、操作するための微細組織のゲージ
細胞によって生成された物理的な力は、開発中に形態学的変化を促進し、細胞の表現型を調節することができます。フィードバック。これらの現象は、通常、生体内での3次元（3D）マトリックス内で発生するので、我々は3次元マイクロパターン行列内にカプセル化細胞からなるmicrotissuesの配列を生成する微小電気機械システム（MEMS）技術を使用していました。マイクロカンチレバーを同時にコラーゲンゲルのリモデリングを抑制するために、このプロセス中に発生する力を報告するために使用されました。同時に力を測定し、細胞の長さスケールでのマトリックスの再構築を観察することによって、我々は初期の相関関係を報告し、後で携帯電話の収縮力と組織形態の変化の間のデカップリング。独立してカンチレバーとコラーゲンマトリックスの機械的剛性を変化させることによって、細胞骨格と細胞外マトリックスのレベル（ECM）は、機械的ストレスのレベルと相関するタンパク質は、一方の細胞の力は、境界又はマトリックス剛性を増加することを明らかにした。 microtissue収縮のバイオ化学機械的なモデルに、携帯電話や行列力学、細胞の力、およびタンパク質の発現との間のこれらの関係をマッピングすることによって、我々は機械的応力のintratissue勾配が集団細胞の収縮から抜け出すことができ、最終的に、どのようなグラデーションができる方法を示しています3D組織内タンパク質組成と組織を設計するために使用されます。一緒に、これらの知見は、細胞の力、ECMリモデリング、細胞表現型の間に複雑でダイナミックな関係を強調表示し、設計の3D microtissues内でこの関係を検討し、適用するシステムを説明します。
機械抓みフォースは、細胞間接合のサイズを調節する
アクトミオシンの収縮は、細胞 - マトリックスの部位での機械的な力の生成および細胞 - 細胞接触を介して部分的に組織内の細胞組織に影響を与えます。接着斑の成長を細胞 - マトリックス接着の結果を機械的荷重を増加させながら、細胞間接着のサイズを強制的にドライブの変更かどうかは未解決の問題のままです。強制的に接着接合（AJ）の応答性を調べるために、我々は定量的に力とAJのサイズを揺さぶる、細胞 - 細胞を報告する微細加工力センサのシステムを適応した。我々は、AJのサイズは、内皮細胞間揺さぶる力によって変調された観察：AJSと揺さぶる力はそれぞれ、ミオシンの活性化または阻害と成長または減衰。 Rac1の、この協調制御と協調して動作しAJSのミオシンに依存した規制が接合安定性に血管透過性エージェント（S1P、トロンビン）の効果は、これらのエージェントはRacに結合する程度を変えることによって逆転したことを示すことによって説明されたとミオシン依存性経路。また、機械的揺さぶる力はなく、それ自体ミオシン活性の直接アプリケーションでは、AJの成長を誘発するのに十分であった。これらの知見は、機械的な力と細胞間接着剤の相互作用の動的な調整可能性が高い多整合性の維持に重要であり、新しいアプローチのために力を揺さぶる勉強する必要性を強調することを示している。
ビンキュリンアクロス機械的張力を測定することにより、接着斑のダイナミクスの調節を明らかに
機械的な力は、発達、生理学的および病理学的プロセスの中心である。ただし、サブセルラー構造内力伝達の限られた理解は、分子メカニズム解明への大きな障害となっている。単一分子蛍光力分光法により示されるようにここでは、ピコニュートン（PN）感度で細胞内の特定のタンパク質間の力を測定し、キャリブレーションセンサーの開発について説明します。メソッドは、ビンキュリン、アクチンフィラメントにインテグリンを接続し、その募集焦点癒着（FAS）の力に依存するタンパク質に適用されます。我々は、安定したFAはでビンキュリン全体にその緊張が別々に規制されているビンキュリン全体のFASと力の伝達には約2.5 PNとそのビンキュリン募集であることを示す。ビンキュリンで最高張力が接着·アセンブリーおよび拡大に関連付けられています。逆に、ビンキュリンは、移行細胞の立ち下がりエッジでFAを分解したり、スライドに低力の下にあります。さらに、ビンキュリンは、力の下に癒着を安定させるために必要です。一緒に、これらのデータは、力の下でFAの安定化がビンキュリン募集と力伝達の両方が必要であることを明らかにし、それは、驚くべきことに、これらのプロセスは独立して制御することができます。
幾何学的に変調されたエラストマー基板を用いた細胞機能の力学的規制
我々は独立して接着剤と他の材料の表面特性に及ぼす影響の基板剛性を調節するmicromoldedエラストマーマイクロポストの配列のライブラリーの設立を報告します。我々は、マイクロポスト剛性に影響を与え、細胞形態、接着斑、細胞骨格の収縮性と幹細胞の分化を示した。さらに、細胞骨格の収縮の初期段階での変更は後で単一細胞での細胞の運命決定に歯止めをかけると予測した。
幾何学的に変調された剛性の高い微細加工エラストマー基板上に幹細胞のメカノを測定する
我々は、細胞機能に及ぼす基板の剛性の影響を調べるために、間隔の狭い、垂直、エラストマーmicropostsの均一な配列から成る微細加工細胞培養基板の使用方法について説明します。エラストマーマイクロポスト基板は異なる剛性の基板を得るために高さの異なるmicropostsから成るシリコンマスターからmicromoldedされています。エラストマーmicropostsのヒントは、細胞接着を促進するためにマイクロコンタクトプリンティングを介して細胞外マトリックスで機能化されています。唯一のマイクロポストの高さの操作を介して基板の剛性を変化させながら、これらの基質は、したがって、接着細胞に同じ地形の手がかりを提示します。このプロトコルは、シリコンマイクロポスト配列のマスター（〜2週間完全に）と、エラストマー基板（3 D）を作製するとともに、細胞培養実験（1-14 d）は、免疫蛍光イメージング（2 D）、トラクションを実行する方法方法について説明します。力分析（2 D）と、これらの基板上に幹細胞の分化アッセイ（1 D）幹細胞の形態、牽引力発生、接着斑の組織と分化の基板剛性の影響を調べるためインチ
血管作動性アゴニストに応答した牽引力のダイナミクスの測定と解析
その周辺に付着した細胞によって及ぼされる機械的な牽引力が細胞の運動性と多再配列を含む細胞および生理学的プロセスの群衆の中で重要な役割を果たす。内皮細胞では、収縮はまた、血液や間質組織のコンパートメント間の透過性を高めるために、炎症時に細胞間接合を妨害する手段を提供します。内皮細胞によって示された収縮の程度は、トロンビン、ヒスタミン、リゾホスファチジン酸、スフィンゴシン-1 - リン酸、および血管内皮増殖因子（VEGF）などの多数の可溶性因子によって影響を受けています。細胞表面の受容体に結合することによって、これらの薬剤は、程度の差は細胞骨格組織、密着性およびミオシンIIの活性の変化をトリガします。従来の抗体ベースの生化学的なアッセイは、エンドポイントの形式で収縮性のバイオマーカーで比較的大きな変化を検出するのに適しているが、それらは収縮性の微妙なまたは急速な変化を解決することはできませんので、非侵襲的に行うことはできません。これらの制限を克服するために、我々は、高時空間分解能で収縮性アゴニストにさらされた単一細胞の収縮反応を測定する手法を開発しました。細胞が培養されているエラストマーmicropostsの密な配列から構成される以前に開発された牽引力センサは、接着細胞によって変形マイクロポストアレイのタイムラプス画像の数千からひずみエネルギーの測定値を抽出するためにここで開発したカスタム、半自動化されたソフトウェアと組み合わせた。このアプローチを用いて、我々は収縮性の既知のアゴニストの差動効果を裏付けとその効果のダイナミクスを特徴とする。これらのアゴニストのすべてが持続的な増加が続いてひずみエネルギーの早い段階で一時的なスパイクを刺激したVEGFを除き、軍隊の特性の一次台頭と高原を作り出した。この小説は、二相収縮反応は、VEGFR2とROCKの活性化の両方を介して媒介され、細胞の亜集団に存在していたし、その大きさは、受容体の内在化によって変調された。興味深いことに、VEGFの濃度がスパイク対軍で唯一の徐々に増加すると答えた細胞の割合をシフトすることができます。さらに、繰り返しVEGFに曝された細胞は、露光の歴史は機械的な応答に影響を与える可能性があることを示唆し、前処理後に別のダイナミクスとの契約に発見された。これらの研究は、メカノトランスダクションの研究のためのツールとしての牽引力のダイナミクスの直接測定の重要性を強調。
骨形成タンパク質-2誘導されるシグナル伝達と骨形成は、細胞の形状、RhoAの/ ROCK、および細胞骨格テンションによって調節されている
ヒト間葉系幹細胞（hMSCが）の抽象的な骨分化は、古典などの骨形成タンパク質（BMP）など、さまざまなサイトカインによって媒介されると考えられています。ここでは、細胞外マトリックス（ECM）にその細胞接着を報告し、細胞の形状と細胞骨格の力学への影響は、BMP誘導シグナリングとhMSCの骨形成分化を調節する。徐々に拡散し、ECMに対して平坦化セルを制限するためにマイクロパターン基板を使用して、我々はBMPによって誘導される骨が徐々に広がって減少した細胞と拮抗していることを示した。 BMPは、急速かつ持続的なRhoAの/のRho関連蛋白質キナーゼ（ROCK）の活性とだけ拡散細胞の収縮張力を引き起こし、このシグナリングはBMPによって誘導される骨形成に必要であった。この効果の分子基盤を探る、我々はROCKシグナリングを減少させる、細胞が拡散を制限することを発見し、又は阻害する細胞骨格の張力がデカペンタプレジックに対するBMP誘導SMA /母親（SMAD）1 C-末端のリン酸化を防ぎ、SMAD4であるSmad1二量体化し、あるSmad1転座に核。一緒に、これらの知見は、細胞拡散およびRhoAの/の直接的な関与ROCK媒介BMP誘導性シグナリングにおける細胞骨格の張力の生成およびin vitro骨形成の初期段階を示すもので、幹細胞の分化の生化学的および機械的な手がかりの間に本質的な相互作用を強調表示します。
マイクロポストアレイで運動性樹状細胞の牽引力を測定
樹状細胞（DC）は、炎症部位から、彼らが適応免疫応答を開始する二次リンパ器官に移行します。運動は、DC機能に不可欠であるが、それらは移行する機構は十分に理解されていない。我々は、双方向の移行時に低振幅の牽引力をプロービングするための新規な方法であると考えるものを開発するために流体のグラデーションジェネレータにマイクロポストアレイ検出器が組み込まれていました。我々は、プライマリマウス樹状細胞の移行がリーディングエッジまたは糸状仮足で短命のトラクション応力によって駆動された。トラクションDCは18で、走化性と化学運動性の間に好中球で見つかったよりも大きさが小さく、同様の大きさは±それぞれ1.4および16±1.3 NN /セルによって生成され強制されます。ローカルDC牽引力の特性時間は3分であった。セル内の最大主応力は、前方重心の、運動の軸に垂直な平面内で発生しました。我々は、トラクション応力の時空間パターンは、将来のDCの動きの方向を予測するために使用することができることを示しています。全体として、樹状細胞は、主要な糸状仮足の牽引力の急激な売上高によって特徴づけ間葉系細胞および好中球の両方から異なる移行のモードを示しています。
