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Articles by Michelle Krogsgaard in JoVE
JoVE Immunology and Infection
T细胞受体在小鼠T细胞的逆转录病毒转导
1NYU Cancer institute, New York University School of Medicine, 2Program in Structural Biology, New York University School of Medicine
我们提出了一个协议，以产生抗原特异性的小鼠的T细胞，用逆转录病毒转导
Other articles by Michelle Krogsgaard on PubMed
配体的 T 细胞识别的直接观察。
激活的 T 细胞通过其 T 细胞受体与抗原肽表面的抗原提呈细胞 (Apc) 绑定到主要组织相容性复合 (MHC) 的互动是自适应免疫的关键步骤。在这里我们使用三维荧光显微镜直观显示个别 peptide-I-E(k) 类 MHC II 配合物，以定性 T 细胞敏感性和形成单个细胞免疫突触的要求贴上的标签与藻藻红蛋白。我们显示表示 CD4 抗原的 T 细胞反应甚至单个激动剂多肽 MHC 配体对信号的瞬态钙和分子的 T 细胞和 APC 的接触区域组织就免疫突触的特征存在仅约十受体激动剂时。这种敏感性是高度依赖于 CD4，因为阻止这种分子与抗体呈现无法检测小于约 30 配体的 T 细胞。
不同的分子机制的两个不同的 T 细胞受体的特异性的帐户。
D3 T 细胞受体 (TCR) 和其天然配体，绑定到 HLA-A0201 (HLA-A2) 主要组织相容性复合 (MHC) 蛋白，艾滋病毒肽之间的相互作用的热力学分析显示相似之处和区别与 2B4 TCR 绑定到其肽 MHC 配体相比。这两个反应的平衡热力学参数都符合构象调整在绑定接口特定 TCR-肽-MHC 复合物的形成过程。但是，脱水蛋白表面的 osmolytic 试剂有两种反应，表明水分子进行非常不同的贡献提高 D3 TCR 的绑定，但削弱 2B4 TCR 的绑定的力量深刻的不同影响。使用这些不同的机制，由通产润盛承认配体可能增加其固有的交叉性的重要手段。
在 T 细胞识别细胞表面分子动力学。
外国抗原基因的 T 淋巴细胞识别是脊椎动物的非常重要的组成部分免疫重要病原微生物和特定病毒和必要的清拆间接地高亲和力抗体的生产。T 细胞识别被介导的 T 细胞，集体表达许多抗原受体的细胞表面的系统扫描。当适当的抗原肽绑定到一个分子的主要组织相容性复合是分钟数量一系列精心的细胞表面分子的发现 — — 甚至和内部重排进行。事件和遵守这些所需的技术发展的一系列事件显著增强了我们对 T 细胞识别的理解和可能会发现应用程序中的瞬态单元格： 交互以及其他系统。
结构重排和/或在 TCR 绑定过程的灵活性可以有助于激活 T 细胞的证据。
虽然在许多情况下 T 细胞受体 (TCR) 绑定到特定配体的半衰期是激活潜在的良好预测指标，多的例外情况建议其他物理参数也必须发挥作用。因此，我们分析了热力学 TCR 绑定到一系列的肽 MHC 配体，其中三个是更刺激，比其稳定性的绑定将预测。引人注目的是，我们发现在 TCR 绑定期间这些异常数据显示反常的大改变热容量、 构象变化或绑定交互中的灵活性的指标。通过结合热容量 (DeltaCp) 的值和 TCR 绑定的半衰期 （t(1/2))，我们发现我们可以准确地预测 T 细胞刺激的程度。结构分析显示中央 TCR 肽 MHC，指示结构重排 TCR-肽-MHC 界面内的可以有助于激活 T 细胞的接触残留物中的重大变化。
将 T 细胞激活和突触形成的分子和细胞事件联系起来。
复杂的一系列事件中的 T 细胞识别外国实体上的其他单元格不是很了解。然而，发展新技术和方法在这两本问题的分子和细胞方面提供了重大洞察的 T 细胞识别与突触的形成机制。尤其是，我们已清楚的 T 细胞敏感性、 辅免疫的突触的形成中的作用和如何 TCR 信号行为保持突触的结构和促进 T 细胞经过许多小时的接触。我们也是知道的新的复杂因素，在 T 细胞受体分子绑定肽-MHC （抵押） 配体的方式，这可能意味着为 TCR 扫描、 交叉性和激活。最终，我们想要该驱动器的特定事件的分子相互作用的关键功能结合的 T 细胞识别这些细胞方面。
异常类二选择限制点头表示谷氨酸脱羧酶 (GAD) 65 特定的 T 细胞受体转基因的小鼠中的 CD8 + T 细胞。
我们前面所述的表达转基因 T 细胞受体 (TCR) 的非肥胖糖尿病 (点头) 小鼠代特定的肽抗原表位 286-300 的糖尿病相关的自我抗原，谷氨酸脱羧酶 (GAD) 65 I-A(g7) 类二 MHC 的上下文中，矛盾的是受来自糖尿病。在本报告中，我们检查这些老鼠的非典型 CD8 + 细胞。与典型的类不同二限制 TCR 转基因小鼠、 GAD286 小鼠具有正常数目的 CD8 + 细胞，其中一半表达的转基因 TCR 的高水平。不匹配的这些 MHC CD8 + 细胞在外围持续存在和蔓延到 GAD286 300 多肽体外和体内的一类二限制时尚。有趣的是，表达内源性 TCR CD8 + tetramer(-) T 细胞可以延缓糖尿病感应在传输模式中，正如我们以前显示的 CD4 + 四聚体 + T 细胞在这些老鼠。不匹配的 MHC CD8 + 细胞出现积极选择非常规的方式，在这他们做不长期 CD69 或 reexpress CD44，和他们摆脱不利的选择。我们发现这些 CD8 + 细胞的生产不是依赖于点头胸腺或高亲和力的 TCR，却取决于非典型 TCR 转基因胸腺环境。
高级别细菌分泌的单链 Alphabeta T 细胞受体。
虽然结构上的特点是大量抗体抗原系统，结构上类似的 T 细胞受体 MHC 系统的研究有很大程度上是由于缺乏一般的 TCR 表达系统落后。努力培养细菌系统造成活性物质很容易被水解和聚合 （< 0.5 mg/l) 的低收益率。在这里我们报告一项战略，分泌折叠、 可溶性单链 T 细胞受体 (scTCR) 在使用三个代表 alphabeta 通产润盛 (172.10，1934.4/c19 和 2B4) 的大肠埃希氏大肠杆菌 periplasm 中。摇瓶 0.5 和 30 毫克/升之间的收益率处于活动状态，为所有通产润盛研究，发现要取决于采用溶解度增加氨基酸替换、 skp 伴侣共表达和 C 终端融合在人类 kappa 常量域范围内的一种监管严密表达载体实现了纯的物质。此系统将极大地使通产润盛，需要大量的均质材料的晶体结构、 热力学和其他生物物理分析。
定量的淋巴细胞膜蛋白重组成像和信号。
膜蛋白定位的变化是建立细胞极性和调节细胞信号转导的关键。标记蛋白的荧光显微镜允许可视化的这些变化，但定量分析需要研究这方面的细胞信号全机械详细。我们制定了定量评估基于四维视频显微镜的遗传物质标记蛋白的膜蛋白再分配的一种新方法。我们分析系统为细胞表面重建、 细胞形状跟踪、 细胞表面距离测量和群集形成分析提供强大的自动化的方法。这些方法允许的统计分析和测试的有关细胞信号转导机理假说。我们已经用这种方法对度量值依赖抗原的聚类的信号分子在 CD4 + T 淋巴细胞中的，获得聚类速度与单粒子跟踪数据保持一致。我们的系统捕获定量差异聚类之间信号蛋白具有独特的生物学功能。我们的方法可以被推广到一系列的细胞信号转导的现象，并启用新型应用程序与单粒子的研究，例如亚细胞蛋白质定位活器官培养分析不可行。
T 细胞如何看抗原。
轴承 alphabeta T 细胞受体的 T 淋巴细胞是免疫应答的大多数脊椎动物的关键。例如，辅助 T 细胞可以协调抗体生产的 B 细胞，以及刺激其他单元格，而细胞毒性 T 细胞杀死病毒式受感染或不正常的细胞。规管 T 细胞行事遏抑响应能力，并监测自然杀手 T 细胞的脂质代谢。这些细胞的特异性受检测抗原片段 (多肽) 或绑定到组织相容性分子脂质的抗体样 heterodimeric 受体 alphabeta-T 细胞受体。有趣的线索，至于如何识别这些奇特的配体，多年来已经逐渐显露和生化与细胞新奇的一个显著的故事。我们在这里总结一些较新的 alphabeta T 细胞受体识别的工作，并讨论对激活的影响。
激动剂/内源性多肽 MHC Heterodimers 驱动器 T 细胞的活化和敏感性。
Alphabeta T 淋巴细胞是能够检测出甚至单个肽主要相容复杂 (MHC) 的抗原递呈细胞表面上的。这是尽管有明确的证据表明，至少与 CD4 + T 细胞、 单体配体不刺激。为了理解这种非凡的敏感性如何实现的我们建造可溶性肽 MHC heterodimers，其中一个肽是促效剂，另一种是大量的内源性多肽母婴健康院所呈现的单元格显示之一。我们发现这些 heterodimers 的某些特定组合可以刺激特定 T 细胞 CD4 依赖的方式。如果烧蚀上激动剂配体的 CD4 绑定站点，但是对内源性配体相同，突变没有影响，此激活是严重受损。这些数据也与脂双层和介绍这些配体，细胞分析关联，并指示辅助 T 细胞的活化的基本单位是黑腹激动剂多肽-和内源性多肽 MHC 复合物，稳定的 CD4。
分子的灵活性可以对受体-配体相互作用单元格路口刺激能力发生影响。
直接单元格通信是在生物学中，特别是胚胎，hematopoetic 细胞之间的相互作用和在中枢神经系统中多进程的关键。此通信通常介导到单元格交界的同源配体受体的结合。对于许多免疫反应的发展非常重要的一次这种互动是抗原 (TCR) 的 alphabeta T 细胞受体的绑定对 T 淋巴细胞的肽 MHC 配合物上的其他单元格。一般情况下，TCR-肽-MHC 绑定的稳定性 （例如，半衰期) 测量功能反应与解决方案建立关联。然而，已报告几个异常。例如，对于一些异常的配体，变化大的热容量显然可以取代缺乏 TCR 配体相互作用的稳定性。在这里，我们表明，当有一些重要的期间受体-配体和受体/配体的构象变化有相对刚性分子子域，此受体-配体复杂单元格交界的半衰期和衡量使用可溶性分子之间的差异很大。因此，与这些特定的分子功能受体/配体不遵循细胞环境中的刺激效价和半生活量度的可溶性分子之间的相关性。我们"第一性原理"处方的纠正半衰期测量解决方案获取相关值的单元格路口亮起的 T 细胞反应的热力学性质与相关性的起源。受体配体相互作用并置单元格中出现的位置的不同系统中的我们的想法应用可能有助于避免"异常情况"可能只是产生的一半生活在溶液中和细胞环境中特定的受体/配体差异的争论。
作为一个自引用、 感官器官的 T 细胞。
根据近期的数据显示，既帮助器和细胞毒性 T 细胞可以检测甚至激动剂多肽 MHC 的单分子、 alphabeta T 细胞显然是一种感官细胞，中枢神经系统中的任何可比性。此外，绑定到母婴健康院的内源性 (自我) 肽并不只是重要的胸腺的选择，但也在对外国抗原反应的 T 细胞的活化中发挥不可或缺的作用。与众多的特殊性提供给大多数 T 细胞，它们可以因此视为感官器官、 自我-肽-母婴健康院接受培训，准备好检测非。
发挥作用，"自我"在 T 细胞的活化。
由哪些 alphabeta T 细胞在胸腺中选定，然后识别多肽 MHC (抵押) 复合物的外围的机制仍然是个谜。最近的工作，特别是在 T 细胞敏感性的量化和自配体在 T 细胞的活化作用提供了一些重要线索可能如何发起 TCR 信号的详细信息。在这里，我们突出显示最近的实验数据，洞察了 T 细胞活化的开始和还讨论的主要争议和这一领域中的不确定性。
多肽的体内增强显示由 MHC 类二分子的小分子多肽交流的催化剂。
MHC II 类分子多肽的快速绑定是通常仅限于在低 ph 值和 HLA-DM 的协调行动取代固定链残剪辑或其他多肽的绑定站点从深 endosomal 车厢。外部添加的肽受蛋白酶分解为较长的时间之前到达有关 endosomal 车厢，这限制了肽为基础的疫苗和治疗的疗效。在此研究中，我们描述一个家庭大幅加速向 HLA 分子的 HLA DM 缺席率的多肽具有约束力的小分子。构效关系研究导致类似物具有显著更高的效能和还定义关键结构特征所需的活动。这些化合物广泛 ph 值范围内处于活动状态，从而使有效加载在细胞表面的多肽。小分子不仅增强肽演示文稿由 APC 在体外，但也积极在体内凡他们大大增加的 APC 的分数显示的肽是探测。我们建议的小分子迅速达到引流区淋巴结和 coadministered 的多肽和诱导多肽的快速加载的蛋白酶销毁它之前。这种化合物可能有助于加强基于多肽疫苗的疗效和其他需要绑定到 MHC II 类分子的疗法。
开发一个多学科的前瞻性黑色素瘤 Biospecimen 存储库以平移的研究进展。
面临几个挑战的发展和运作的 biospecimen 银行挂钩临床信息，任何有效的转化研究程序的重要组成部分。黑色素瘤添加特定的复杂程度和难度考虑此恶性肿瘤的独特特征的这种努力。我们在此处描述的 biospecimen 银行和我们在建立一个多学科、 前瞻性、 综合性临床病理 biospecimen 数据库在黑色素瘤中的经验的审查。跨学科黑色素瘤合作集团 （IMCG），一个前瞻性临床病理和 biospecimen 数据库，在纽约大学 (纽约) 朗贡医学中心成立。病人的知情同意，生物检材的内外纽约大学、 临床病理数据和后续资料收集使用开发的协议。在 35 字段中，记录的信息有关的生物检材和临床病理资料录 371 字段内 5 个模块中的一种虚拟的网络系统。调查人员进行研究利用 IMCG biospecimen 资源是盲的临床病理资料，和分子数据生成使用生物检材生物统计学调查员可独立链接与临床病理数据。此转化研究企业行为作为一种宝贵的资源有效地翻译到诊所实验室发现。
多肽 MHC Heterodimers 显示胸腺积极选择需要自我肽比消极的选择更多的限制设置。
T 单元格的选定和胸腺中的成熟取决于 T 细胞受体 （通产润盛） 和不同的自我-肽-主要组织相容性复合 (抵押) 分子之间的相互作用。我们展示的亲和性 OT-我为 Catnb-H-2 Kb 和 Cappa1-H-2 Kb，其内源性积极选择配体 TCR 是比以前报告的积极选择改变短肽配体显著较低。若要了解如何这些极为薄弱的内源性配体产生成熟胸腺细胞中的信号，我们生成可溶性单体及二聚肽-H-2 Kb 的配体。可溶性单体卵清蛋白 （卵）-Kb 分子引起 OT 没有探测信号-我胸腺细胞，而卵 Kb heterodimers 配对的积极选择或 nonselecting 的内源性多肽，但没有工程空肽诱导删除。相比之下，致二聚体阳性选择是身份的合作伙伴肽敏感得多。Homodimers Catnb Kb Catnb Kb，但不是 heterodimers Catnb Kb nonselecting 肽 Kb 与配对的诱导积极选择，即使这两个配体绑定 OT-我 TCR 探测的亲和力。因此，可通过二聚但不是单体配体驱动积极和消极的选择。此外，积极选择了伙伴自我-抵押更严格的要求。
减毒 T 细胞对体内高烈度配体反应。
绑定到主要组织相容性复合 (抵押) 分子表面的抗原提呈细胞的外源多肽的 αβ T 细胞受体 (TCR) 识别是开始自适应的细胞免疫功能的一个关键事件。体外、 高亲和性结合和 （或） 长寿通产润盛和抵押之间的交互关联与高烈度 T 细胞的活化。然而，少人了解体内的 T 细胞反应对 TCR/抵押相互作用参数的影响。我们研究 TCR/抵押绑定特性通过跟踪 CD4(+) T 细胞活化、 效应和内存对参展范围的 TCR/抵押的多肽免疫反应体内的 T 细胞免疫功能的影响半生命和体外 T 细胞激活效力。与从体外研究预测，我们发现最优体内的 T 细胞反应发生到中间 TCR/抵押半-生命配体。我们观察到参展 TCR/抵押半衰期最长的配体的减少体内反应都与衰减的细胞内信号转导、 扩展和功能关联在一系列广泛的时间点。我们的研究结果揭示体内 T 细胞的活化控制级别不在体外检测方法概括和突出考虑 TCR 配体体内疗效作为疫苗设计的一部分的重要性。
Polyreactivity Heteroligation 增加明显的抗 Hiv 抗体亲和。
在免疫应答过程抗体选择，他们能够通过将绑定到外国抗原高亲和力，部分接受同型二价绑定的能力。然而，这种类型的绑定不总是可能。例如，gp140 糖蛋白峰值的人类免疫缺陷病毒 (HIV) disfavours 同双价抗体绑定的图面上显示的数量很少。在这里我们表明，在人类抗体应对艾滋病毒，增加抗体亲和的体细胞突变还增加广度和中和效价。奇怪的是，答复天真和记忆 B 细胞产生夹带抗体，这些足以一高亲和力抗艾滋病毒 gp140 结合站点和艾滋病毒问题的另一种分子结构上的第二个低亲和力站点之间的双价 heteroligation。B 细胞发育过程，强烈反对自我抗原或 polyreactivity 变应原所选，虽然它是某些在人类中，包括艾滋病毒、 爱泼斯坦-巴尔病毒和丙型肝炎病毒感染血清学的共同特点。75%的高滴度的中和抗体与六名病人从克隆 134 单克隆抗艾滋病毒 gp140 抗体是夹带。尽管夹带结合网站的低亲和力，heteroligation 明显增加感染艾滋病毒抗体夹带明显亲和性。
