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Articles by Mohsen Khorshid in JoVE
JoVE General
PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN
1Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, 2Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 3Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 4Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 5Genomics Resource Center, Rockefeller University
Transcripciones de ARN están sujetas a numerosas normas posttranscriptional que está mediada por una multitud de trans-acción ARN-proteínas de unión (prácticas comerciales restrictivas). Aquí presentamos un método generalizable para identificar con precisión y en una escala de transcriptoma en todo los sitios de unión a ARN de las prácticas comerciales restrictivas.
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Los Receptores De Trasplante De Alta Frecuencia Y Diversidad De Tumores Cutáneos Appendageal En órgano
Receptores de trasplante de órganos inmunodeprimidos corren mayor riesgo de cánceres de piel no melanoma en comparación con la población general, pero se desconoce su riesgo de tumores appendageal.
Transcriptoma En Toda La Identificación De La Proteína De Unión Al ARN Y Los Sitios De Destino MicroARN Por PAR-CLIP
Las transcripciones de ARN están sujetos a la regulación de genes postranscripcional que participaron cientos de ARN-proteínas de unión a las prácticas comerciales restrictivas () y que contienen complejos de microARN-ribonucleoproteína (miRNPs) expresados en forma de células de tipo dependiente. Hemos desarrollado un enfoque reticulación a base de células para determinar en alta resolución y en todo el transcriptoma de los sitios de unión de las prácticas comerciales restrictivas y miRNPs celulares. Los sitios reticuladas son reveladas por timidina a las transiciones de citidina en los ADNc preparadas a partir de immunopurified RNPs de 4-tiouridina células tratadas. Se determinaron los sitios de unión y las consecuencias reglamentarias para varias prácticas comerciales restrictivas intensamente estudiados y miRNPs, incluyendo PUM2, QKI, IGF2BP1 3, AGO/EIF2C1-4 y TNRC6A-C. Nuestro estudio reveló que estos factores se unen miles de sitios que contengan la secuencia de motivos definidos y tienen distintas preferencias de exonic contra intrónica o codificación en comparación con las regiones no traducidas de transcripción. La asignación exacta de los sitios de unión de todo el transcriptoma será fundamental para la interpretación de los datos que emergen rápidamente sobre la variación genética entre los individuos y cómo estas variaciones contribuyen a enfermedades genéticas complejas.
CLIPZ: Una Base De Datos Y Análisis De Entorno Por Sitios De Unión Determinado Experimentalmente De Proteínas De Unión De ARN
El índice de estabilidad, localización y traducción de mRNAs están regulados por una multitud de proteínas de unión de ARN (restrictivas) que encontrar sus objetivos directamente o con la ayuda de la guía de RNAs. Entre los métodos experimentales para el mapeo de sitios de unión de las prácticas comerciales restrictivas, Cross-linking e inmunoprecipitación (CLIP) junto con la secuencia profunda proporciona cobertura transcriptoma así como alta resolución. Sin embargo, en parte debido a su gran volumen, los datos que hasta ahora se generaron en experimentos CLIP no se han puesto en una forma que permite la exploración rápida e interactiva de sitios de Unión. Para responder a esta necesidad, hemos desarrollado el entorno de base de datos y análisis CLIPZ. Datos del sitio de prácticas comerciales restrictivas como Argonaute 1-4, Insulin-like growth factor II mRNA vinculante proteína 1-3, TNRC6 proteínas de Unión A C, Pumilio 2, proteína de unión de tracto Quaking y Polypyrimidine puede ser visualizada a nivel del genoma y de transcripciones individuales. Los usuarios individuales pueden subir sus propios conjuntos de datos de secuencia siendo capaces de limitar el acceso a estos datos a usuarios específicos, y análisis de los conjuntos de datos públicos y privados pueden realizarse de forma interactiva. CLIPZ, disponible en http://www.clipz.unibas.ch, tiene como objetivo proporcionar un repositorio de acceso abierto de información para los elementos de regulación postranscripcional.
Conservado Generación De Productos Cortos En PiRNA Lugares Geométricos
La vía de piRNA opera en líneas de germen animal para asegurar la integridad del genoma a través de retrotransposon silenciamiento. Los Pío proteína asociada pequeños RNAs (piRNAs) guían de proteínas Piwi retrotransposon transcripciones, que son degradadas y así post-transcriptionally silenciadas a través de un proceso de amplificación de ping-pong. Escote de la transcripción de retrotransposon define al mismo tiempo el extremo 5' de una secundaria piRNA que guiará a su vez una proteína Piwi a un precursor primario piRNA, amplificando así piRNAs primaria. Aunque varios estudios proporcionan evidencia que este mecanismo se conserva entre los metazoa, cómo se inicia el proceso y qué actividades enzimáticas son responsables de generar las piRNAs primaria y secundaria no son totalmente claros.
Un Análisis Cuantitativo De Los Métodos CLIP Para Identificar Sitios De Unión De Proteínas De Unión De ARN
Cross-linking e inmunoprecipitación (CLIP) se utiliza cada vez más a mapa de sitios de unión de todo el transcriptoma de proteínas de unión de ARN. Hemos desarrollado un método para el análisis de datos CLIP y aplicado para comparar el CLIP con photoactivatable mejorada ribonucleósido CLIP (CLIP PAR) y para descubrir cómo las diferencias en la digestión de cross-linking y ribonucleasa afectan los sitios identificados. Encontramos sólo pequeñas diferencias en la precisión de estos métodos en la identificación de sitios de unión de HuR, que se une a secuencias de baja complejidad, y 2 Argonaute, que tiene una especificidad de Unión compleja. Encontramos que las mutaciones inducidas por Cruz-link llevaron a la resolución de nucleótido para PAR-CLIP y CLIP. Nuestros resultados confirman la expectativa de las publicaciones originales de CLIP que proteínas de unión de ARN no protegen a sus sitios de Unión suficientemente en las condiciones de desnaturalización utilizadas durante el procedimiento CLIP, y mostramos que extensa digestión con secuencia específica RNasas predispone fuertemente los sitios de Unión recuperados. Este sesgo se puede reducir sustancialmente por condiciones más suaves de digestión de Nucleasa.
