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Articles by Muniswamy Madesh in JoVE

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Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS


JoVE 3511 12/21/2011

1, 1, 2, 1

1Department of Biochemistry, Temple University, 2Department of Anesthesiology and Pain Medicine, University of Washington

Un metodo efficiente per acquisire conoscenze in visualizzando il paracrino derivato induzione di ROS endoteliali Ca2 + segnalazione è descritto. Questo metodo si avvale della misurazione paracrini derivati ​​ROS innescato mobilitazione Ca2 + in cellule endoteliali vascolari in una co-coltura modello.

Other articles by Muniswamy Madesh on PubMed

Rapida Cinetica Indotta TBid Citocromo C E Rilascio Di Smac/DIABLO E Depolarizzazione Mitocondriale

The Journal of Biological Chemistry. Feb, 2002  |  Pubmed ID: 11741882

Scissione dell'offerta ha dimostrato di promuovere l'apoptosi inducendo permeabilization membrana mitocondriale con conseguente rilascio di proteine che inducono apoptosi dallo spazio intermembrana nel cytosol. Tuttavia, diretta visualizzazione del rilascio Bid-indotta di varie proteine dallo spazio intermembrana altamente compartimentato e i cambiamenti nei meccanismi metabolici mitocondriali rimangano inafferrabili. Utilizzando proteine di fusione della proteina fluorescente verde e immunostaining in singole cellule HepG2 permeabilized, in primo luogo abbiamo dimostrato che troncato Bid (15,5-kDa frammento C-terminale, tBid) evocato una rapida ed essenzialmente completo rilascio del citocromo c e Smac/DIABLO da ogni mitocondrio. Per stabilire con una risoluzione di secondi la cinetica indotta tBid citocromo c e rilascio di Smac/DIABLO e depolarizzazione, abbiamo monitorato il potenziale di membrana mitocondriale (DeltaPsi(m)) fluorimetrically in permeabilized cellule e applicato un metodo di filtrazione rapida per ottenere frazioni citosoliche per macchiarsi occidentale. Abbiamo trovato che dosi subnanomolar di tBid erano sufficienti per evocare la versione del citocromo c e la depolarizzazione mitocondriale, mentre offerta full-length era 100 volte meno efficacia. BCL-x(L) impedito depolarizzazione e c rilascio citocromo indotto tBid. In risposta a 2,5 nm tBid, versione del citocromo c iniziato dopo un ritardo di s 10, visualizzato rapida progressione e fu completata al 50-70 che s. rilascio di Smac/DIABLO è stato sincronizzato con la versione del citocromo c, considerando che la perdita di DeltaPsi(m) ritardate leggermente dietro versione del citocromo c. Inoltre, indotta da tBid citocromo c rilascio era insensibile alle variazioni nella composizione del substrato, ma depolarizzazione indotta tBid non si è verificato in presenza di alimentazione extramitochondrial ATP. Così, permeabilization tBid-indotta della membrana esterna permette il rapido rilascio di citocromo c, Smac/DIABLO da tutti i domini dello spazio intermembrana. La perdita indotta tBid di DeltaPsi(m) si verifica dopo la versione del citocromo c e riflette la compromissione del metabolismo ossidativo.

TcBid Promuove La Propagazione Di Segnale Ca(2+) Per I Mitocondri: Controllo Di Permeazione Ca(2+) Attraverso La Membrana Mitocondriale Esterna

The EMBO Journal. May, 2002  |  Pubmed ID: 11980717

Picchi di calcio fondate da IP(3) mediata dal recettore Ca(2+) rilascio dal reticolo endoplasmatico (ER) vengono trasmessi in modo efficace ai mitocondri, che utilizzano locali Ca(2+) interazioni tra sottodomini strettamente associati di ER e mitocondri. Poiché la membrana mitocondriale esterna (OMM) è stata pensata per essere liberamente permeabile a Ca(2+), le indagini si sono concentrate su IP (3)-driven Ca(2+) trasporto attraverso la membrana mitocondriale interna (IMM). Qui dimostriamo che permeabilization selettiva dell'OMM da tcBid, una proteina di Miselli, si traduce in un aumento della grandezza di IP (3)-indotta mitocondriale segnale [Ca(2+)]. Questo effetto di tcBid è stato a causa della promozione dell'attivazione di Ca(2+) siti di assorbimento in IMM e, di conseguenza, alla facilitazione dell'assorbimento Ca(2+) mitocondriale. Al contrario, tcBid non è riuscito a controllo la consegna di Ca(2+) sostenuta e globale i segnali di mitocondri. Così, i nostri dati supportano un modello di romanzo che Ca(2+) permeabilità dell'OMM all'interfaccia ER - mitocondriale è un determinante importante del locale Ca(2+) segnalazione. Facilitazione di consegna Ca(2+) ai mitocondri da tcBid può supportare anche il reclutamento dei mitocondri per le macchine di morte delle cellule.

TGF-beta-induced Ca(2+) Afflusso Coinvolge Il Tipo III IP(3) Recettore E Regola Il Citoscheletro Di Actina

American Journal of Physiology. Renal Physiology. May, 2002  |  Pubmed ID: 11934702

CA(2+) afflusso è stata postulata per modulare la via di segnalazione di trasformare growth factor-beta (TGF-beta); Tuttavia, il meccanismo sottostante e l'importanza funzionale del TGF-beta-indotta stimolazione dell'afflusso Ca(2+) sono poco chiare. Mostriamo qui che stimola il TGF-beta Ca(2+) afflusso nelle cellule mesangiali senza rilascio di Ca(2+). L'afflusso di Ca(2+) è impedito da farmacologici inibitori dei recettori di inositolo 1.4.5-trifosfato (IP(3)R) così come gli anticorpi specifici di tipo III IP (3) R (IP(3)RIII) ma non di tipo IP (3) R (IP(3)RI). TGF-beta migliora la localizzazione della membrana plasmatica di RIII IP (3), mentre il reticolo sarcoplasmatico endoplasmic Ca(2+)-ATPasi (SERCA) preferenzialmente trasloca al nucleo. Le cellule mesangiali non trattata presentano sporgenze filamentose actina sulla superficie delle cellule e trattamento con TGF-beta riduce drasticamente questo modello. Le alterazioni del citoscheletro di actina di TGF-beta dipendono dall'afflusso di TGF-beta-induced Ca(2+). Questi studi identificano un romanzo pathway che regola l'afflusso di Ca(2+) TGF-beta e induce alterazioni del citoscheletro.

Segnalazione Di Calcio E Apoptosi

Biochemical and Biophysical Research Communications. May, 2003  |  Pubmed ID: 12729578

CA(2+) è uno dei regolatori chiavi di sopravvivenza delle cellule, ma Ca(2+) può anche indurre il apoptosis in risposta ad una varietà di condizioni patologiche. Gli effetti pro-apoptotici della Ca(2+) sono mediati da un fattori diversificata gamma di Ca(2+)-sensibili che sono compartimenti in vari organelli intracellulari tra cui ER, citoplasma i mitocondri. La dinamica di Ca(2+) di questi organelli sembra essere modulata da proteine famiglie Bcl-2 regolazione del apoptosis. In questo libro, sono discussi i recenti progressi della ricerca sui meccanismi di mediazione effetti regolazione del apoptosis di Ca(2+) e le interazioni delle proteine famiglie Bcl-2 con gli organelli di archiviazione Ca(2+).

Il Fattore Di Rilascio Della Catena Del Polipeptide GSPT1/eRF3 Proteoliticamente Viene Trasformato in Un IAP-binding Protein

The Journal of Biological Chemistry. Oct, 2003  |  Pubmed ID: 12865429

SMAC/Diablo e HtrA2/Omi sono inibitori di apoptosi (IAP)-associazione di proteine rilasciate dai mitocondri delle cellule umane durante il apoptosis e regolano l'apoptosi da liberatorio caspases da inibizione IAP. Qui descriviamo l'identificazione di un'isoforma del fattore di rilascio catena del polipeptide GSPT1/eRF3 proteina, che funziona nella traduzione, come una nuova proteina IAP proteoliticamente trasformato. In comune con altre proteine IAP-associazione, le proteine trasformate GSPT1 porti un motivo N-terminale IAP-associazione conservato (AKPF). Inoltre, GSPT1 trasformati biochimicamente interagisce con IAPs e potrebbe promuovere l'attivazione di caspase, IAP ubiquitination e apoptosi. Il motivo di IAP-associazione del GSPT1 elaborato è assolutamente necessario per queste attività. I nostri risultati sono coerenti con un modello per cui la trasformazione di GSPT1 nell'isoforma IAP-associazione potrebbe potenziare il apoptosis da liberatorio caspases da inibizione IAP, o target IAPs e il GSPT1 elaborato per degradazione mediata dal proteasoma.

Coinvolgimento Di Trasformare Growth Factor-beta Nel Regolamento Dei Transitori Di Calcio Nelle Cellule Della Muscolatura Liscia Vascolare Diabetica

American Journal of Physiology. Renal Physiology. Dec, 2003  |  Pubmed ID: 12876066

Transitori di calcio alterato [Ca2 +] di cellule muscolari lisce vascolari di vasocostrittori possono contribuire all'alterata regolazione del flusso di sangue nel diabete. Abbiamo ipotizzato che diabete indotto transforming growth factor (TGF)-produzione di beta contribuisce alla risposta di ANG II alterata delle cellule muscolari lisce vascolari in macrovessels e Talengectasia. Aortica muscolo liscio vascolare cellule isolate da topi diabetici esposto segnale marcatamente alterata calcio citosolico indotta da ANG II [Ca2 +] che è stata completamente restaurata dal pretrattamento con anticorpi anti-TGF-beta. Risultati simili sono stati notati nelle cellule muscolari lisce microvascolare isolato dai vasi preglomerulari e coltivate in alto glucosio. L'impatto del diabete su [Ca2 +] transitori è stato replicato con aggiunta di TGF-beta1 e beta2 isoforme di muscolo liscio aortiche cellule nelle cellule di cultura e diabetico era migliorata produzione di TGF-beta2. Nelle condizioni in vivo, TGF-beta1 è stata aumentata in glomeruli diabetici, mentre TGF-beta2 è stata aumentata nell'aorta diabetica. Il caratteristico aumento superficie di filtrazione glomerulare trovato in ratti diabetici è stato impedito da un trattamento con anticorpi anti-TGF-beta, e contrazione di compromissione anello aortico ANG II-indotta in ratti diabetici è stata completamente restaurata da anticorpi anti-TGF-beta. Disfunzione vascolare alterata può essere in parte a causa del recettore di diminuzione inositolo 1.4.5-trifosfato (IP3R), ridotto tipo IP3R espressione ero trovato nell'aorta diabetica e restaurato da anticorpi anti-TGF-beta. Concludiamo che TGF-beta svolge un ruolo importante nella disfunzione vascolare del diabete precoce inibendo transitori di calcio nelle cellule muscolari lisce vascolari.

Una Mutazione Dominio Precursore Della Proteina BRICHOS Di Tensioattivo Proteina C Provoca Lo Stress Del Reticolo Endoplasmatico, La Disfunzione Del Proteasoma E Attivazione Di Caspase 3

American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. Jun, 2005  |  Pubmed ID: 15778495

BRICHOS è un dominio trovato in diverse proteine che consiste di circa 100 aminoacidi con sequenza e analogie strutturali. Mutazioni nel dominio BRICHOS sono state associate con malattie degenerative e proliferative in alcuni organi nonpulmonary, anche se i meccanismi patogeni sono in gran parte non definiti. Recentemente, diverse mutazioni nel mapping di tensioattivo proteina C (SP-C) per il dominio BRICHOS che si trova all'interno del proprotein (proSP-C) sono state collegate a malattie polmonari interstiziali. Espressione in vitro di uno di questi mutanti BRICHOS, l'eliminazione dell'esone 4 (hSP-CDeltaexon4), promuove una dominante negativo perinucleare aggregazione della proteina. Il presente studio caratterizza il comportamento di traffico e patogene conseguenze derivanti dall'espressione di hSP-CDeltaexon4. Time-lapse e collocazione microscopia studi hanno dimostrato una maggiore proteina fluorescente verde (EGFP) / hSP-CDeltaexon4 espressione nel vano calnexin-positivi (reticolo endoplasmatico [ER]) con lo sviluppo successivo di tempo e concentrazione dipendente dei corpi di inclusione perinucleare ubiquitarie seguita da apoptosi. Rispetto ai controlli, EGFP/hSP-CDeltaexon4 promosso sovraregolazione di molteplici specie di ER stress, attivazione di caspase 3 e indotta annexin associazione V. Inoltre, in cellule GFP-u, hSP-CDeltaexon4 inibito direttamente attività del proteasoma. Questi risultati supportano un modello per cui le mutazioni BRICHOS proSP-C inducono una dinamica tossica guadagno di funzione, causando la morte delle cellule apoptotic dai primo accumulo ER che conduce a una risposta esagerata spiegata della proteina e da una maggiore deposizione di aggregati cellulari associati con disfunzione del proteasoma.

Segnalazione Proliferativa Dai Canali Del Calcio Operati Dal Negozio Si Oppone Cytostasis Di Cellule Cancro Colon Indotta Da Enterotossine Batteriche

The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. Sep, 2005  |  Pubmed ID: 15937149

Guanil ciclasi C e accumulo di cGMP indotta da enterotossine termostabili batteriche (STs) promuovere cytostasis di cellule cancro del colon, che serve come un soppressore del tumore nell'intestino. Al contrario, voce capacitivo calcio attraverso i canali calcio store-operato (SOC) è una chiave segnalazione meccanismo che promuove la proliferazione di cellule di cancro del colon. Il presente studio rivelò che segnalazione proliferativa da ingresso capacitivo calcio attraverso SoC si oppone e reciprocamente è accoppiato al cytostasis mediata da guanil ciclasi C in cellule di carcinoma del colon umane T84. Eliminazione della voce calcio capacitivo che impiegano 2-aminoethoxydiphenylborate (2-APB), un inibitore selettivo di SoC, potenziato cytostasis indotta da opposizione St cytostasis ST-indotta dalla voce capacitivo calcio riflette l'inibizione reciproca di guanil ciclasi C segnalazione. Ingresso di calcio attraverso SoC indotta dalla Calcio-ATPasi inibitore thapsigargin o agonisti del recettore UTP o Carbacolo inibito guanil ciclasi C-dipendente dal cGMP accumulazione. Questo effetto è stato imitato dal calcio ionoforo ionomicina e bloccato da 1,2-bis(o-amino-5,5'-dibromophenoxy) 2-APB e intracellulare etano-N, N, N', N'-Etilendiamminotetraacetico acido-acetossimetil estere (BAPTA-AM), un chelante del calcio. Inoltre, regolamento di ingresso capacitivo calcio riflessa sensibilizzazione ligando-dipendente della guanil ciclasi C per inibizione da quel catione. Sebbene attività catalitica basale era refrattario, ST-stimolato guanil ciclasi C è stato inibito dal calcio, che antagonizzato associazione di magnesio a siti allosterici necessaria per accoppiamento recettore-effector. Queste osservazioni dimostrano che la regolazione reciproca della guanil ciclasi C segnalazione dalla voce capacitivo calcio attraverso SoC rappresenta un arto di un meccanismo coordinato bilanciamento cytostasis e proliferazione di cellule di cancro del colon. Essi suggeriscono che la combinazione guanil ciclasi C agonisti e inibitori della SOC offre un paradigma romanzo di cGMP-regia di terapia e prevenzione per i tumori del colon-retto.

Il Reticolo Endoplasmatico Gateway Al Apoptosis Di Modulazione Bcl-X(L) Della InsP3R

Nature Cell Biology. Oct, 2005  |  Pubmed ID: 16179951

Membri della famiglia Bcl-2 proteina modulano la permeabilità della membrana mitocondriale esterna per controllare l'apoptosi. Tuttavia, queste proteine localizzare anche al reticolo endoplasmatico (ER), il cui significato funzionale è controverso. Qui forniamo prove che anti-apoptotic Bcl-2 proteine regolano recettore inositolo 1.4.5-trifosfato (InsP(3)R) ER Ca(2+) nel canale di rilascio, con conseguente resistenza aumentata apoptosi cellulare ed enhanced bioenergetica mitocondriale. Bcl-X(L) anti-apoptotic interagisce con il terminus carbossilico di InsP (3) R e sensibilizza singoli R InsP (3) canali nelle membrane ER al basso [InsP(3)], Ca(2+) e InsP (3)-dipendente dal regolamento dell'attività del canale in vitro e in vivo, riducendo il contenuto di ER Ca(2+) e stimolazione energetica mitocondriale. Le proteine pro-apoptotici Bax e tBid antagonizzare questo effetto bloccando l'interazione biochimica di Bcl-X(L) con l'InsP (3) R. Questi dati supportano un modello di romanzo in cui Bcl-X(L) è un effettore diretto di InsP (3) R, aumentando la sensibilità a InsP(3) e abilitazione ER Ca(2+) versione per essere più sensibile accoppiati a extracellulare segnali. Di conseguenza, le cellule sono protette contro apoptosis da un accoppiamento più sensibile e dinamico di ER ai mitocondri attraverso la trasduzione del segnale Ca(2+)-dipendente che migliora la bioenergetica cellulare e preserva la sopravvivenza.

Ruolo Selettivo Per Superossido in InsP3 Receptor Mediated Disfunzione Mitocondriale E Apoptosi Endoteliale

The Journal of Cell Biology. Sep, 2005  |  Pubmed ID: 16186254

Specie reattive dell'ossigeno (ROS) giocano un ruolo divergente in sia la sopravvivenza delle cellule e la morte delle cellule durante l'ischemia/reperfusion (I / R) lesioni e l'infiammazione associato. In questo studio, generazione di ROS da macrofagi attivati evocato un Ca2 + intracellulare ([Ca2 +] i) transiente in cellule endoteliali che è stato rimosso da una combinazione di superossido dismutasi e un antagonista anione. [Ca2 +] memorizzare esaurimento, ma non extracellular Ca2 + chelazione, impedito [Ca2 +] i elevazione in risposta per O2 - che è stato dipendente di inositolo 1.4.5-trifosfato (InsP3), e le cellule mancano le tre isoforme di InsP3 receptor (InsP3R) non è riuscito a visualizzare la [Ca2 +] i transitori. Soprattutto, l'O2 * - innescata Ca2 + mobilizzazione preceduto una perdita nel potenziale di membrana mitocondriale che era indipendente da altri ossidanti e derivati mitochondrially ROS. Attivazione dell'apoptosi si è verificato in modo selettivo in risposta per O2- e potrebbe essere impedito di [Ca2 +] i buffer. Questo studio fornisce la prova che O2 * - facilita una cascata InsP3R-linked apoptotic e può servire una funzione critica nei / R lesioni e le infiammazioni.

Difetti Funzionali E Tratta Di Esseri Mutanti Di ATP Binding Cassette A3 Associato a Sindrome Da Distress Respiratorio

The Journal of Biological Chemistry. Apr, 2006  |  Pubmed ID: 16415354

Membri della superfamiglia delle proteine ATP binding cassette (ABC) trasportano attivamente un'ampia gamma di substrati attraverso delle cellule e le membrane intracellulari. Mutazioni in ABCA3, un membro della sottofamiglia ABCA con funzione sconosciuta, portano a fatale sindrome da distress respiratorio (RDS) nei neonati. Utilizzando in coltura le cellule polmonari umane, abbiamo trovato che hABCA3 wild-type ricombinante localizzata alle membrane dei lisosomi sia corpi lamellari, che sono gli organelli intracellulari archiviazione per tensioattivo. In contrasto, hABCA3 con mutazioni legate a RDS non è riuscito a destinazione ai lisosomi e rimase nel reticolo endoplasmatico come forme non trasformate. Trattamento di tali cellule con il chaperone chimica sodio 4-fenilbutirrato potrebbe ripristinare parzialmente tratta del mutante ABCA3 al corpo-come le strutture lamellari. Espressione di ABCA3 ricombinante in cellule non-polmone rene embrionale umano 293 indotta da formazione di vescicole simil-corpo lamellare contenente lipidi. Piccolo atterramento di RNA interferente di hABCA3 endogeni nel differenziare cellule del polmone fetale umano alveolari di tipo II ha portato nei corpi anormali, lamellari comparabili con quelli osservati in vivo con mutante ABCA3. Silenziamento dell'espressione ABCA3 anche ridotto assorbimento vescicolare di tensioattivo lipidi fosfatidilcolina, sfingomielina e colesterolo ma non fosfatidiletanolammina. Concludiamo che ABCA3 è richiesto per caricamento lisosomiale di fosfatidilcolina e conversione dei lisosomi in lamellare corpo-come le strutture.

L'HIV-1 Vpr E Glucocorticoidi Complesso Recettoriale è Un'interazione Di Guadagno Di Funzione Che Impedisce La Localizzazione Nucleare Di PARP-1

Nature Cell Biology. Feb, 2006  |  Pubmed ID: 16429131

La proteina Vpr di HIV-1 funzioni come un gene fondamentale accessorio regolando varie funzioni cellulari, tra cui il differenziamento cellulare, apoptosi, fattore nucleare kappaB (NF-kappaB) soppressione e arresto del ciclo cellulare della cellula ospite. Diversi report hanno indicato che Vpr complessi con il recettore glucocorticoidi (GR), ma rimane poco chiaro se il sentiero GR è necessario per Vpr alla funzione. Qui, segnaliamo che Vpr utilizza il pathway GR come un veicolo di reclutamento per la proteina co-activating NF-kappaB, poly(ADP-ribose) polimerasi-1 (PARP-1). L'interazione di GR con Vpr è necessaria e sufficiente per facilitare questa interazione da POTENZIANTI la formazione di un complesso di Vpr-GR-PARP-1. L'assunzione di PARP-1 dal complesso Vpr-GR impedisce la localizzazione nucleare, che è necessario per Vpr sopprimere NF-kappaB. L'associazione di GR con PARP-1 non è osservato con trattamento di steroidi (glucocorticoidi), che indica che l'associazione GR con PARP-1 è un guadagno di funzione che è attribuita unicamente a Vpr di HIV-1. Questi dati forniscono importanti intuizioni Vpr biologia e suo ruolo nella patogenesi dell'HIV.

Proliferazione Delle Cellule Endoteliali Polmonari Con Diminuzione Shear Stress è Mediata Da Specie Reattive Dell'ossigeno

American Journal of Physiology. Cell Physiology. Jan, 2006  |  Pubmed ID: 16107509

Cessazione acuta del flusso (ischemia) porta alla depolarizzazione della membrana delle cellule endoteliali (CE) mediato da canali K(ATP) e seguita dalla produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da NADPH ossidasi. Abbiamo postulato che i ROS sono un segnale per l'avvio di proliferazione CE associati con la perdita della sollecitazione di taglio. Citometria a flusso è stata utilizzata per identificare proliferanti CD31 positivi polmonare microvascolare delle cellule endoteliali (mPMVECs) da wild-type, Kir 6.2-/-e gp91phox-/-mice. mPMVECs sono stati etichettati con PKH26 e colta nei capillari artificiali per 72 h a 5 dyn/cm2 (adattamento di flusso), seguita da 24 h di arresto flusso o continuato flusso. Produzione di ROS durante la prima ora di ischemia è stata notevolmente diminuita rispetto ai topi wild-type in entrambi i tipi di gene targeting mPMVECs. Proliferazione delle cellule è stata definita come l'indice di proliferazione (PI). Dopo 72 h di flusso, > 98% del marcato PKH26 wild-type mPMVECs erano a un singolo picco (PI 1.0) e la percentuale delle cellule in S + G2 / M fasi erano pari al 5,8% sulla base di analisi del ciclo delle cellule. Con ischemia (24 h), PI aumentato a 2,5 e il rapporto delle cellule in S + G2 / M fasi erano al 35%. Catalasi, diphenyleneiodonium e cromakalim marcatamente inibito la proliferazione delle cellule e la produzione di ROS nel flusso-adattato selvaggio-tipo mPMVECs. Effetti significativi di ischemia non sono stati osservati in Kir 6.2-/ - e gp91phox-/-cellule. ANG II attivazione della NADPH ossidasi è stata influenzata dalla delezione di un gene KATP. Così perdita di shear stress nel flusso-adattato mPMVECs risultati nella divisione cellulare associato ROS generati da NADPH ossidasi. Questo effetto richiede un funzionamento canale KATP membrana cellulare.

Flusso Di Superossido in Cellule Endoteliali Attraverso Il Canale Di Cloruro-3 Media Di Segnalazione Intracellulare

Molecular Biology of the Cell. Jun, 2007  |  Pubmed ID: 17360969

Specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono state implicate nella segnalazione delle cellule e la patologia. La principale fonte di ROS in cellule endoteliali è NADPH ossidasi, che genera il superossido (O(2)(.-)) sul lato extracellulare della membrana plasmatica, ma può risultare nella segnalazione intracellulare. Per studiare possibile flusso transmembrana del O(2)(.-), cellule endoteliali microvascolare polmonare erano precaricate con il hydroethidine del fluoroforo O(2)(.-)-sensibili (egli). Applicazione di un bolo extracellulare di O(2)(.-) ha portato in rapida e concentrazione-dipendente ossidazione HE transitoria che è stata seguita da un aumento progressivo e irreversibile in fluorescenza nucleare di lui. Questi cambiamenti di fluorescenza sono stati inibiti dalla superossido dismutasi (SOD), l'antagonista di anione DIDS e silenziamento selettivo del cloruro canale-3 (ClC-3) da un trattamento con siRNA. O(2)(.-) extracellulare innescato Ca(2+) rilascio a sua volta innescato alterazioni potenziale di membrana mitocondriale che sono state seguite da produzione O(2)(.-) mitocondriale e l'apoptosi cellulare. Questi "segnali" effetti di O(2)(.-) sono stati evitati dal trattamento DIDS, dalla deplezione dei depositi intracellulari di Ca(2+) con thapsigargin e di chelazione di Ca(2+) intracellulare. Questo studio dimostra che O(2)(.-) flusso attraverso la membrana plasmatica delle cellule endoteliali avviene attraverso canali ClC-3 e induce intracellulare Ca(2+) release, che attiva la generazione O(2)(.-) mitocondriale.

ABCA3 è Un Fattore Critico Per La Biogenesi Corpo Lamellare in Vivo

The Journal of Biological Chemistry. Aug, 2007  |  Pubmed ID: 17540762

Mutazioni nel trasportatore di ATP-binding cassette A3 (human ABCA3) della proteina sono associati con fatale sindrome da distress respiratorio nei neonati. Abbiamo pertanto caratterizzato topi con interruzioni mirate del gene ABCA3. Topi di omozigoti Abca3-/-knock-out morirono subito dopo la nascita, considerando che la maggior parte del tipo selvatico, Abca3 + + ed eterozigoti, Abca3 +, i neonati sono sopravvissuti. I polmoni da E18.5 ed E19.5 Abca3-/-mice furono meno maturi di tipo selvatico. Cellule alveolari di tipo 2 da Abca3/embrioni non contenevano corpi lamellari, ed espressione della proteina matura di SP-B è stato interrotto quando confrontato con il sistema di surfattante polmonare normale degli embrioni di tipo selvatico. Piccole differenze strutturali e funzionali del sistema surfattante sono stati visti in adulti Abca3 + confrontato con Abca3 + + topi. Gli eterozigoti avevano un minor numero di corpi lamellari e l'incorporazione di substrati radioattivi nella modificazione recentemente sintetizzati fosfatidilcolina, fosfatidilglicerolo, fosfatidiletanolammina e fosfatidilserina in corpi lamellari e surfattante era inferiore in Abca3 + + polmoni del mouse. Inoltre, poiché la frazione di breve termine Abca3/embrioni era significativamente inferiore rispetto al previsto dall'ereditarietà mendeliana che ABCA3 probabilmente svolge ruoli nello sviluppo estranei a tensioattivo. Collettivamente, questi risultati suggeriscono fortemente che ABCA3 è necessaria per la biogenesi corpo lamellare, tensioattivo proteina-B elaborazione e lo sviluppo del polmone in ritardo nella gestazione.

I Fattori Di Miselli Bax E Bak Regolano Proliferazione T Cellulare Attraverso Il Controllo Dell'omeostasi Ca(2+) Del Reticolo Endoplasmatico

Immunity. Aug, 2007  |  Pubmed ID: 17692540

Bcl-2-associato X proteina (Bax) e Bcl-2-antagonista/killer (Bak) è essenziali regolatori dell'apoptosi dei linfociti, ma se giocano un ruolo nella funzione delle cellule T vitali rimane poco chiaro. Qui, segnaliamo che le cellule T manca sia Bax e Bak visualizzano difetti nella proliferazione antigene-specifiche a causa di difetti di Ca(2+)-segnalazione. Bax(-/-), Bak(-/-) T cellule visualizzato difettoso T cell receptor (TCR) - e inositolo-1.4.5-trifosfato (IP(3)) - dipendente Ca(2+) mobilitazione a causa di alterazioni del reticolo endoplasmatico (ER) Ca(2+) regolamento che è stato stornato dalla reintroduzione di Bax. La capacità del TCR-dipendente Ca(2+) segnali per stimolare la produzione di NADH mitocondriale superiore a quello utilizzato per la sintesi dell'ATP è stato dipendente da Bax e Bak. Blunting di Ca(2+)-indotta mitocondriale NADH elevazione in assenza di Bax e Bak portato a diminuita produzione di specie reattive dell'ossigeno, che è stato richiesto per la proliferazione delle cellule T. Insieme, i dati di stabiliscono modulando ER Ca(2+) rilascio che Bax e Bak svolgono un ruolo essenziale nel controllo della proliferazione delle cellule T.

Dei Recettori Accoppiati a Proteine G Ca2 +-specie Ossigenate Reattive Mitocondriali Collegati Sono Essenziali Per L'adesione Endoteliale/leucocitarie

Molecular and Cellular Biology. Nov, 2007  |  Pubmed ID: 17724077

Recettore-mediata segnalazione è comunemente associato con molteplici funzioni, tra cui la produzione di specie reattive dell'ossigeno. Tuttavia, se derivato da mitocondrio superossido (mROS) contribuisce direttamente alla segnalazione fisiologica è controversa. Qui mostriamo un meccanismo precedentemente sconosciuto in cui fisiologica produzione mROS evocato Ca(2+) gioca un ruolo cardine nella cellula endoteliale (CE) attivazione e leucocita ferma aderenza. Recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e assorbimento di tirosina chinasi mediata inositolo 1.4.5-trifosfato-dipendente mitocondriale Ca(2+) portato nella produzione di NADPH ossidasi-indipendente mROS. Tuttavia, produzione legata al GPCR mROS non alterava mitocondriale funzione o un trigger di morte delle cellule ma piuttosto contribuito all'attivazione di NF-kappaB e leucocita adesione tramite l'induzione di CE della molecola di adesione intercellulare 1. Dismutazione di mROS dalla sovraespressione di manganese superossido dismutasi e una cella-neutralizzare superossido dismutasi mimetico ablazione attività trascrizionale NF-kappaB e facilitato il distacco dei leucociti da endotelio sotto circolazione simulato seguito GPCR - ma non indotta da citochine attivazione. Questi risultati dimostrano che mROS è la molecola effector downstream che traduce mediata dal recettore Ca(2+) segnali proinfiammatori segnalazione e leucociti/CE ferma adesione.

Rilevazione Simultanea Di Apoptosi E La Produzione Di Superossido Mitocondriale Nelle Cellule Vive Di Citometria a Flusso E Microscopia Confocal

Nature Protocols. 2007  |  Pubmed ID: 17853886

Annexin V e Sytox Green sono ampiamente usati marcatori per valutare apoptosi in vari tipi di cellule mediante citometria a flusso e microscopia di fluorescenza. Recentemente, un romanzo fluoroprobe MitoSOX rosso è stato introdotto per rilevazione selettiva del superossido nei mitocondri delle cellule vive ed è stato convalidato per microscopia confocal e citometria a flusso. Questo protocollo descrive le misure simultanee di generazione superossido mitocondriale con marcatori apoptotici (Annessina V e Sytox Green) sia mediante citometria a flusso e microscopia confocale in linee di cellule endoteliali. I vantaggi del metodo di citometria a flusso descritto sopra altre tecniche basate sulle cellule sono la tremenda velocità (1-2 h), squisita precisione e la possibilità di marcatori le misure quantitative simultanee di mitocondriale superossido generazione e apoptosi (e altre), con la massima conservazione delle funzioni cellulari. Questo metodo combinato con microscopia di fluorescenza possa essere molto utile per rivelare importanti cambiamenti spaziali-temporale nella produzione di superossido mitocondriale e l'esecuzione di morte cellulare programmata in praticamente qualsiasi tipo di cellula.

Endoteliali Di Targeting Di Polimero Semipermeabile Nanoportatori Per Terapie Di Enzima

Biomaterials. Jan, 2008  |  Pubmed ID: 17950837

L'utilità medica delle proteine, enzimi per esempio terapeutici, è notevolmente limitata dalla loro natura labile e inadeguata consegna. Gli enzimi più terapeutici non si accumulano nei loro obiettivi e vengono inattivati dalle proteasi. Targeting degli enzimi incapsulati in polimero substrato permeabile nano-vettori (PNC) impermeabile per le proteasi potrebbe superare queste limitazioni. Per verificare questa ipotesi, abbiamo progettato endoteliali mirati PNC caricato con catalasi, una H (2) O (2)-disintossicante enzima e testato se questo approccio protegge contro lo stress ossidativo vascolare, un processo patologico implicato nell'ischemia-reperfusion e altre condizioni di malattia. Incapsulamento di catalasi (MW 247 kD), perossidasi (42 MW kD) e xantina ossidasi (XO, kD 300 MW) in circa 300 diametro nm PNC composta da copolimeri di polietilene glicole e acido poli-lattico/poli-glicolico (PLGA-PEG) era nella gamma di circa il 10% per tutti gli enzimi. PNC/catalasi e perossidasi/PNC erano protetti da proteolisi esterno ed esercitato l'attività enzimatica su loro substrati diffusibile PNC, H(2)O(2) e ortho-phenylendiamine, considerando che l'attività di incapsulato XO era trascurabile a causa della impermeabilità del polimero al substrato. PNC mirati a piastrine-endotelio cellula (CE) adesione molecola-1 consegnato attivo incapsulato catalasi ECS e protetto l'endotelio contro lo stress ossidativo negli studi di cellula animale e cultura. Vascular targeting di enzimi detossificanti PNC-caricato può trovare applicazioni larghe mediche tra cui la gestione dello stress ossidativo e altre tossicità.

Il Comune Da Inalazione Anestetica Isoflurano Induce L'apoptosi Mediante L'attivazione Di Recettori Di Inositolo 1.4.5-trifosfato

Anesthesiology. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18212570

Isoflurano induce l'apoptosi delle cellule da un meccanismo sconosciuto. Gli autori hanno ipotizzarono che isoflurano attiva inositolo 1.4.5-trifosfato (IP3) recettori sulla membrana del reticolo endoplasmatico (ER), causando il rilascio di calcio eccessivo, innescare il apoptosis.

Caveolae Sono Una Componente Essenziale Del Percorso Per La Segnalazione Delle Cellule Endoteliali Associati Con Brusca Riduzione Della Sollecitazione Di Taglio

Biochimica Et Biophysica Acta. Oct, 2008  |  Pubmed ID: 18573285

Brusca cessazione del flusso che rappresenta la perdita acuta della sollecitazione di taglio (ischemia simulata) a flusso-adattato polmonare microvascolare delle cellule endoteliali (PMVEC) conduce a reattive dell'ossigeno (ROS) specie generazione che segnali per proliferazione di CE. Abbiamo valutato il ruolo della caveolina-1 su questa risposta cellulare con mouse PMVEC che sono stati condizionati per 72 h a flusso laminare a 5 dyn/cm(2) seguita da arresto del flusso ("ischemia"). Precondizionamento ha provocato un 2.7-fold aumento cellulare espressione di canali K(ATP) (K(IR) 6.2), ma nessun cambiamento nel livello di espressione della caveolina-1, gp91(phox) o chinasi della mappa. La risposta iniziale di ischemia in cellule di tipo selvatico era depolarizzazione della membrana cellulare che è stata abolita dal gene targeting di K(IR) 6.2. La risposta successiva è stata aumentata produzione di ROS associata con l'attivazione della NADPH ossidasi (NOX2) e quindi la fosforilazione della chinasi mappa (Erk, JNK). Dopo 24 h di ischemia in cellule di tipo selvatico, l'indice di proliferazione cellulare aumento 2,5 piega e la % di cellule in S + G (2) fasi m 6-fold. Questa cascata di segnalazione (depolarizzazione della membrana cellulare, la produzione di ROS, mappa chinasi delle cellule e attivazione proliferazione) è stata abrogata in caveolina-1 PMVEC null o da un trattamento di cellule di tipo selvatico con filipin. Questi studi indicano che caveolina-1 funziona come un sensore di taglio nel flusso-adattato CE con conseguente segnalazione ROS-mediata delle cellule e la proliferazione delle cellule endoteliali seguendo la brusca riduzione del flusso.

Anestetici Da Inalazione Inducono Danni Cellulari Di Perturbazione Dell'omeostasi Del Calcio Intracellulare Con Potenze Diverse

Anesthesiology. Aug, 2008  |  Pubmed ID: 18648233

Gli autori hanno ipotizzarono che gli anestetici da inalazione indotta da danno cellulare provocando rilascio anormale di calcio dal reticolo endoplasmatico tramite attivazione eccessiva di inositolo 1.4.5-trifosfato (IP3) dei recettori, con isoflurano avendo una maggiore potenza rispetto a sevoflurano o desflurano.

Male Gli Obiettivi Del Poro Di Transizione Di Permeabilità Indipendente Di Bax O Bak Per Passare Tra Ca2 +-cella Dipendente Sopravvivenza E Morte

Molecular Cell. Feb, 2009  |  Pubmed ID: 19217411

Oscillazioni del calcio esercitano il controllo fisiologico sul metabolismo energetico mitocondriale e possono anche portare a permeabilization membrana mitocondriale e morte cellulare. Il risultato di calcio mitocondriale di segnalazione è alterato da fattori di stress quali ceramide o staurosporine. Tuttavia, il meccanismo di questo interruttore Miselli rimane poco chiaro. Utilizzando approcci genetici, biochimici, farmacologici e funzionali, mostriamo qui che ceramide e staurosporine target PP2A e proteina chinasi A e C, rispettivamente, in un associato di mitocondri segnalazione complessi per indurre la defosforilazione delle proteine BH3-only Bad. Bad defosforilata sensibilizza il poro di transizione di permeabilità mitocondriale (PTP) di Ca2 + attraverso un processo sensibile Bcl-xL e VDAC-mediata. Inoltre, la sensibilizzazione indotta da cattivo di PTP a Ca2 + non necessita di Bax o Bak. Così, meccanismi fosfo-regolamentazione convergono su Bad per passare tra le funzioni di apoptotic di calcio mitocondriale segnalazione attivando un meccanismo per cui una proteina BH3-only bypassa Bax/Bak e si aggancia il PTP e sopravvivenza.

Carcino-embrionario Molecola Di Adesione Cellulare 6 Nel Polmone Umano: Regolata L'espressione Di Un Tipo Multifunzionale Proteina Delle Cellule II

American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19329538

Molecola di adesione delle cellule carcinoembrionario 6 (CEACAM6) è una glicosilata, glicosilfosfatidilinositolo (GPI)-ancorata proteine espresse nelle cellule epiteliali di vari tessuti umani. Si lega batteri Gram-negativi ed è overexpressed in tumori, dove esso è antiapoptotici e promuove la metastasi. Per caratterizzare le CEACAM6 espressione nello sviluppo del polmone, abbiamo coltivato le cellule epiteliali del polmone fetale umano ed esaminato responses to ormoni di differenziazione, adenovirus che esprimono tiroide transcription factor-1 (TTF-1) e silenziamento di TTF-1 con piccolo RNA inibitorio. Glucocorticoidi e cAMP ha avuto effetti stimolatorio additivi sul contenuto di CEACAM6, e trattamento combinato al massimo aumentato tasso di trascrizione mRNA e proteina circa 10 volte. Atterramento di TTF-1 ridotta induzione ormonale di CEACAM6 80%, e l'espressione di TTF-1 ricombinante aumenta CEACAM6 in modo dose-dipendente. CEACAM6 contenuto di tessuto polmonare aumentata durante il terzo trimestre e dopo la nascita. Di immunostaining, CEACAM6 in cellule fetali di tipo II, ma le cellule mesenchimali non era presente e localizzato alla membrana plasmatica e all'interno di corpi lamellari contenenti tensioattivi. CEACAM6 è stato secreto dalle cellule coltivate di tipo II ed era presente in frazioni sia tensioattivo e surnatante del neonato aspirati tracheali. Negli studi funzionali, CEACAM6 ridotta inibizione della superficie proprietà tensioattive di proteine in vitro e apoptosi bloccati electroporated celle coltivate. Concludiamo che CEACAM6 nelle cellule epiteliali del polmone fetale è inerente allo sviluppo e ormonalmente regolata e una proteina bersaglio per TTF-1. Perché CEACAM6 agisce come un fattore antiapoptotici e stabilizza la funzione di tensioattivo, oltre a un ruolo putativo di innata difesa contro i batteri, proponiamo che è una proteina multifunzionale alveolare.

Esecuzione Di Morte Cellulare Indotta Da Superossido Di Miselli Correlati a Bcl-2 Proteine Bid E Bak

Molecular and Cellular Biology. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19332555

Intossicazione da etanolo stimola la produzione di citochine proinfiammatorie, aumenta la formazione di specie reattive dell'ossigeno e induce danno mitocondriale. Tuttavia, le informazioni sono limitate per quanto riguarda la sequenza esatta e componenti coinvolti nell'epatotossicità indotta da etanolo. L'esposizione acuta di etanolo aumenta la superossido mitocondriale (O(2)(*-)) produzione e altera la gestione Ca(2+) mitocondriale. A sua volta, facilita la O(2)(*-) versione del citocromo c e la perdita potenziale di membrana mitocondriale, che non è dipendente da H(2)O(2) e cationi divalenti richiede Bak in maniera indipendente Bax. Inoltre, innesco di attività Miselli di Bak richiede la presenza citosolica dell'offerta, una proteina BH3-only che viene elaborata dall'iniziatore caspase-2. Insieme, questi studi identificano un percorso O(2)(*-)-driven, caspase-avviato apoptotic che coinvolge selettivamente le proteine famiglie Bcl-2 offerta e Bak. Questo percorso si manifesta durante il consumo cronico di etanolo negli animali invecchiati e identifica la caspasi-2, offerta e Bak come indispensabili mediatori dell'apoptosi indotta da O(2)(*-) che possono rivelarsi efficaci obiettivi per lo sviluppo di terapie per il trattamento di malattia epatica alcolica.

Melanocita-come Le Cellule Nel Cuore E Vene Polmonari Contribuiscono a Trigger Di Aritmia Atriale

The Journal of Clinical Investigation. Nov, 2009  |  Pubmed ID: 19855129

La fibrillazione atriale è la più comune aritmia cardiaca clinica. È spesso iniziato da battiti ectopici derivanti dalle vene polmonari e l'atrio, ma la fonte e il meccanismo di queste battute rimane poco chiaro. La sintesi di melanina enzima tautomerase dopachrome (DCT) è coinvolto nel calcio intracellulare e regolamento specie reattive in melanociti. Dato che la disregolazione del calcio intracellulare e specie reattive è stata descritta in pazienti con fibrillazione atriale, abbiamo studiato il ruolo del DCT in questo processo. Qui, ci caratterizzano un'unica popolazione cellulare DCT-esprimere all'interno di cuori murine e umane che hanno popolato le vene polmonari, atri e canale atrioventricolare. Delineamento di espressione hanno dimostrato che questa popolazione espressi recettori adrenergici e muscarinici e visualizzato transcriptional profili distinti dai melanociti dermici. Topi adulti privi di DCT visualizzato normale sviluppo cardiaco ma un aumento della suscettibilità alle aritmie atriali. Colture primarie cardiache melanocita-come le cellule sono eccitabili, e quelli mancano DCT visualizzato ripolarizzazione prolungata con early afterdepolarizations. Inoltre, topi con mutazioni nel recettore tirosina chinasi Kit mancavano melanocita-come cellule cardiache e non ha fatto sviluppare aritmie atriali in assenza di DCT. Questi dati suggeriscono che la disfunzione dei melanociti-come le cellule dell'atrio e vene polmonari può contribuire ad aritmie atriali.

Nitrazione Del Complesso Mitocondriale Sono Subunità NDUFB8 Induce Necrosi RIP1 E RIP3-mediata

Free Radical Biology & Medicine. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 19897030

L'ossido nitrico (NO) e altre specie reattive dell'azoto target più siti nei mitocondri di influenzare la sopravvivenza e la bioenergetica cellulare. Studi di imaging cinetici ha rivelato che non da macrofagi attivati o donatore composti rapidamente diffonde ai mitocondri, che causano un aumento progressivo della dose-dipendente in fluorescenza DAF-NO-dipendente, che corrispondeva alla perdita potenziale di membrana mitocondriale e avviato alterazioni in bioenergetica cellulare che portarono alla morte delle cellule necrotiche. Disfunzione cellulare è mediata da una firma di elevata 3-nitrotyrosine del complesso mitocondriale sono subunità NDUFB8, che è vitale per la normale funzione mitocondriale, come evidenziato da atterramento selettiva attraverso siRNA. Sovraespressione di mitocondriale superossido dismutasi sostanzialmente diminuito NDUFB8 nitrazione e ripristinata l'omeostasi mitocondriale. Ulteriormente, il trattamento delle cellule con necrostatin-1 o siRNA atterramento di RIP1 e RIP3 impedito necrosi NO-mediata. Questo lavoro dimostra che l'interazione tra NO e mitochondrially superossido derivato altera bioenergetica mitocondriale e la funzione delle cellule, fornendo così un meccanismo molecolare per reattive dell'ossigeno e dell'azoto mediata specie alterazioni nell'omeostasi mitocondriale.

II Complesso Mitocondriale Impedisce Ipossico Ma Non Calcio - E Miselli Bcl-2 Proteina Indotta Mitocondriale Della Membrana Potenziale Perdita

The Journal of Biological Chemistry. Aug, 2010  |  Pubmed ID: 20566649

Perdita potenziale di membrana mitocondriale ha gravi conseguenze bioenergetiche e contribuisce a molte malattie umane, inclusi infarto del miocardio, ictus, cancro e neurodegenerazione. Tuttavia, nonostante il suo risalto e importanza nella produzione di energia cellulare, il meccanismo di base per cui è stabilito il potenziale di membrana mitocondriale rimane poco chiaro. I nostri studi delucidare che complesso flusso di elettroni II-driven è il mezzo principale con cui la membrana mitocondriale è polarizzata nelle circostanze hypoxic e che la mancanza del complesso succinato substrato II ha provocato perdita potenziale di membrana reversibile che potrebbe essere ripristinata rapidamente dalla supplementazione di succinato. Inibizione del complesso mitocondriale I e F (0) F (1)-ATP sintasi indotta depolarizzazione mitocondriale che è stato indipendente del poro di transizione di permeabilità mitocondriale, famiglie proteine Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) o gonfiore ad alta ampiezza e non potrebbe essere rovesciato da succinato. Importante, metabolismo succinato nelle circostanze hypoxic ripristina il potenziale di membrana e livelli di ATP. Inoltre, un affidamento sul flusso degli elettroni mediata II complesso permette alle cellule da pazienti con malattia mitocondriale privo di un complesso funzionale che per mantenere un potenziale di membrana mitocondriale che trasmette sia una struttura mitocondriale e la capacità di sequestrare agonista-indotta calcio simile a quello delle cellule normali. Questa scoperta è importante come imposta la fase complessa conservazione funzionale II come un attraente terapia per mantenere la funzione mitocondriale durante l'ipossia.

S-glutathionylation Attiva STIM1 E Altera L'omeostasi Mitocondriale

The Journal of Cell Biology. Aug, 2010  |  Pubmed ID: 20679432

Lo stress ossidante influenza molti processi cellulari, tra cui la crescita cellulare, differenziazione e morte cellulare. Un legame riconosciuto tra questi processi e lo stress ossidante è via alterazioni nella segnalazione Ca(2+). Tuttavia, proprio come ossidanti influenzano Ca(2+) segnalazione rimane poco chiari. Lo stress ossidante portò a un cambiamento fenotipico in Ca(2+) mobilitazione un oscillatorio a un modello di elevata sostenuto tramite calcio attivato dal rilascio di calcio (CRAC) - mediata voce Ca(2+) capacitivo e molecola stromale interazione 1 (STIM1) - e Orai1-deficienti cellule resistenti agli stress ossidante. Funzionalmente, indotta da ossidante Ca(2+) voce altera mitocondriale Ca(2+) gestione e bioenergetica e trigger di morte delle cellule. STIM1 è S-glutathionylated a cisteina 56 in risposta allo stress ossidante ed evoca costitutiva Ca(2+) ingresso indipendente dei negozi Ca(2+) intracellulare. Questi esperimenti rivelano che cisteina 56 è un sensore per l'attivazione di ossidante-dipendente di STIM1 e dimostrare un legame molecolare tra lo stress ossidante e Ca(2+) segnalazione tramite il canale CRAC.

Calcio Sensibili Battistoni Acida Memorizza Nell'endotelio: Specifico Agonista Reclutamento E Ruolo Nella Regolazione Della Pressione Sanguigna

The Journal of Biological Chemistry. Nov, 2010  |  Pubmed ID: 20876534

Accumulando prove implica l'acido nicotinico adenina dinucleotide fosfato (Battistoni) nel controllo delle funzioni Ca(2+)-dipendente. Tuttavia, si sa poco riguardo il suo ruolo nell'endotelio vascolare, un importante regolatore della pressione sanguigna. Qui, ci mostra che Battistoni acetossimetil ester (Battistoni-AM), una cellula-permeant Battistoni analogico, aumenta citosolico Ca(2+) concentrazione nelle cellule endoteliali dell'aorta. Dimostreremo che questi segnali e quelli evocati da acetilcolina sono bloccati da perturbare organelli acidi con bafilomycin A1. Al contrario, Ca(2+) segnali in risposta alla trombina sono solo parzialmente inibiti dal bafilomycin A1 trattamento e quelli di ATP erano insensibili, suggerendo che il reclutamento dei depositi acidi è agonista specifico. Mostriamo ulteriormente che segnali evocati Battistoni Ca(2+) hyperpolarize cellule endoteliali e generano NO. Inoltre, dimostriamo che Battistoni dilata aortico anelli in maniera endotelio - e NO-dipendente. Infine, ci mostra che la somministrazione endovenosa di Battistoni-AM in ratti anestetizzati diminuisce la pressione arteriosa media. I nostri dati estendono le azioni di Battistoni per l'endotelio sia in vitro che in vivo, che punta a un ruolo in precedenza non riconosciuto per questo messaggero nel controllo della pressione sanguigna.

NF-kappaB Protegge Le Cellule Dalla Gamma Interferone Indotta RIP1-dipendente Necroptosis

Molecular and Cellular Biology. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21576359

Gli interferoni (IFN) sono citochine con proprietà antivirali e immunomodulatori ben descritto, ma meno è conosciuto circa i meccanismi che promuovono la morte delle cellule di sopravvivenza o di una cella. Qui, ci mostra che l'IFN-γ induce RIP1 chinasi-dipendente necroptosis in cellule di mammifero carenti nella segnalazione di NF-κB. Induzione di necroptosis di IFN-γ è stato trovato a dipendere dal Jak1 e parzialmente STAT1. Abbiamo anche dimostrare che l'IFN-γ attiva IκB kinase β (IKKβ)-dipendente da NF-κB per regolare un programma trascrizionale che protegge le cellule da necroptosis. Progressivo accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e l'eventuale perdita del potenziale di membrana mitocondriale nelle cellule manca la subunità NF-κB rilassarsi, indotta da IFN-γ. Analisi microarray intero genoma individuato sod2, codifica l'antiossidante enzima manganese superossido dismutasi (MnSOD), un gene di antinecroptotic Real target e potenzialità. Sovraespressione di MnSOD inibito accumulo di ROS mediata da IFN-γ e parzialmente salvato le cellule carenti relazioni da necroptosis, mentre l'interferenza del RNA (RNAi)-silenziamento mediato di sod2 espressione aumentata suscettibilità alla morte cellulare indotta da IFN-γ. Insieme, questi studi dimostrano che NF-κB protegge le cellule dall'IFN-γ-mediated necroptosis transcriptionally attivando una risposta di sopravvivenza che disseta ROS per preservare l'integrità mitocondriale.

Iperomocisteinemia Danneggia L'endotelio-derivato Hyperpolarizing Mediata Dal Fattore Vasorelaxation in Mouse Di Transgenici Cistationina Beta Sintasi-carenti

Blood. Aug, 2011  |  Pubmed ID: 21653942

Iperomocisteinemia (HHcy) è associata a disfunzione endoteliale (de), ma il meccanismo è in gran parte sconosciuto. In questo studio, abbiamo studiato il ruolo e il meccanismo di HHcy-indotta ED in microvasculature nel nostro modello di mouse neonata di grave HHcy (omocisteina totale plasmatica, 169,5 μM). Abbiamo trovato che grave HHcy ha alterato l'ossido nitrico (NO) - e fattore hyperpolarizing endotelio-derivato (EDHF) - mediata, rilassamenti endotelio-dipendente delle piccole arterie mesenteriche (SMAs). Endotelio-indipendente e prostaciclina-mediata rilassamenti endotelio-dipendente non sono stati modificati. Un canale del potassio attivato Ca(2+) non selettivi (inibitore di K(Ca)) completamente bloccato relax EDHF-mediata. Bloccanti selettivi per piccolo-conduttanza K(Ca) (SK) o intermedio-conduttanza K(Ca) (IK) non è riuscito a inibire EDHF-mediata relax nei topi HHcy. HHcy aumentato i livelli di proteina SK3 e IK1, superossido (O(2)(-)) e 3-nitrotyrosine nell'endotelio di SMAs. Preincubazione con antiossidanti e perossinitrito (ONOO(-)) inibitori migliorate endotelio-dipendente ed EDHF-mediata rilassamenti e diminuita produzione O(2)(-) in SMAs da HHcy topi. Relax più ulteriormente, EDHF-mediata è stato inibito da ONOO(-) e impedito dalla catalasi nei topi di controllo. Infine, L-omocisteina ha stimolato la produzione di O(2)(-), che è stata invertita di antiossidanti e aumento dei livelli della proteina SK/IK e nitrazione di tirosina in colture umane microvascolare endothelial cellule cardiache. I nostri risultati suggeriscono che HHcy altera relax EDHF in SMAs inibendo le attività SK/IK tramite meccanismi correlati a nitrazione ossidazione - e tirosina.

Requisito Di FADD, NEMO E BAX/BAK Per Aberrante Funzione Mitocondriale in Necrosi Fattore Di Necrosi Tumorale Alfa-indotta

Molecular and Cellular Biology. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21746883

Necroptosis rappresenta una forma di morte cellulare programmata alternativi che dipende la chinasi RIP1. RIP1-dipendente necroptotic morte si manifesta come produzione di specie (ROS) aumentato reattive dell'ossigeno nei mitocondri ed è accompagnata da perdita di biogenesi ATP ed eventuale dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale. Qui, ci mostra che il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α)-indotto necroptosis richiede proteine adattatore FADD e NEMO. FADD è stato trovato a mediare la formazione del complesso della chinasi indotta da TNF-α pronecrotic RIP1-RIP3, mentre la subunità IκB Kinase (IKK) NEMO sembra funzionare a valle del RIP1-RIP3. È interessante notare, perdita di relazioni potenziate TNF-α-dipendente necroptosis, che indica che NEMO regola necroptosis indipendentemente da NF-κB. Utilizzando approcci farmacologici e genetici, dimostriamo che la sovraespressione di antiossidanti allevia necroptosis ed elevazione di ROS. Infine, eliminazione di BAX e BAK o sovraespressione di Bcl-x(L) protegge le cellule da necroptosis in un passo successivo. Questi risultati forniscono la prova che i mitocondri svolgono un ruolo di amplificazione in infiammazione indotta da necroptosis.

Rilevazione Stress Cellulare Attraverso Le Proteine STIM

Nature Chemical Biology. Aug, 2011  |  Pubmed ID: 21769090

In risposta alla diminuzione dei livelli di Ca2 + nel reticolo endoplasmatico, coppia proteine STIM con Orai canali nella membrana del plasma, che conduce all'afflusso di Ca2 + nella cellula. Oltre al Ca2 +-related stress del reticolo endoplasmatico, proteine STIM stanno emergendo come sensori di stress generale che reagiscono ai segnali di stress multipli per orchestrare la segnalazione di Ca2 + e omeostasi.

Acidosi Indotta Da Ipossia Disaccoppia Il STIM-Orai Calcio Complesso Di Segnalazione

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22084246

Le proteine Ca(2+)-sensing STIM reticolo endoplasmatico mediano segnali voce Ca(2+) di accoppiamento per attivare canali di membrana plasmatica Orai. Vi sveliamo che STIM-Orai giunto rapidamente è bloccato da ipossia e la conseguente diminuzione del pH citosolico. Nelle cellule muscolari lisce o cellule HEK293 coexpressing STIM1 e Orai1, condizioni ipossiche acute rapidamente bloccati operati dal negozio Ca(2+) voce e la Ca(2+) Orai1-mediato rilascio-attivato Ca(2+) corrente (I(CRAC)). Blocco ipossia-indotto della voce Ca(2+) e I(CRAC) è stato invertito da NH(4) (+)-indotta citosolico alcalinizzazione. L'ipossia e l'acidificazione sia bloccato I(CRAC) indotta dalla breve regione STIM1 Orai-attivazione. Sebbene l'ipossia indotta STIM1 traslocazione in giunzioni, esso non ha fatto dissociare il complesso STIM1-Orai1. Tuttavia, sia ipossia e acidosi citosolico rapidamente diminuita Förster resonance energy transfer (FRET) tra STIM1-YFP e Orai1-CFP. Così, anche se l'ipossia promuove accumulo giunzionale STIM1, la conseguente acidificazione spariglia funzionalmente il complesso STIM1-Orai1 fornendo un importante meccanismo che protegge le cellule da sovraccarico Ca(2+) in condizioni di stress ipossico.

Consegna PECAM Mirati Di SOD Inibisce La Risposta Infiammatoria Endoteliale

FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. Jan, 2011  |  Pubmed ID: 20876216

Elevata generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da enzimi endoteliali, tra cui la NADPH-ossidasi, è implicato in stress ossidativo vascolare e proinfiammatorio endoteliali attivazione che coinvolgono l'esposizione di adesione delle cellule vascolari molecola-1 (VCAM-1). Catalasi e superossido dismutasi (SOD) coniugato con anticorpi anti-molecola di adesione delle piastrine/endothelial cellule 1 (PECAM-1) legano specificamente all'endotelio e inibire gli effetti del corrispondente anione superossido ROS e H(2)O(2). In questo studio, anti-PECAM/SOD, ma non anti-PECAM/catalasi o immaturi enzimi, tra cui il polietilenglicole (PEG)-SOD, inibito 2 a 3 volte VCAM espressione causato dal fattore di necrosi tumorale (TNF), interleuchina-1 β e lipopolisaccaride. Anti - PECAM/SOD, ma omologhi non immaturi, accumulati nell'endotelio vascolare dopo un'iniezione endovenosa, localizzato in endosomes endoteliale e inibiscono da 70% causato da lipopolisaccaride VCAM-1 espressione nei topi. Anti-PECAM/SOD colocalized con vescicole endoteliali See-1 positivi e temprato ROS prodotte in risposta a TNF. Inibitori della NADPH ossidasi e anione canale ClC3 bloccato espressione VCAM indotta da TNF, affermando che superossido prodotto e trasportato da queste proteine, rispettivamente, da intermediario segnali infiammatori. Anti-PECAM/SOD abolito espressione VCAM causata da poly(I:C) indotta da attivazione del recettore toll-like 3 localizzate in vescicole intracellulari. Questi risultati direttamente coinvolgono endosomal afflusso di superossido in risposta infiammatoria endoteliale e suggeriscono che site specific intercettazione di questo segnale raggiunto dalla consegna mirata di anti-PECAM/SOD in endosomes endoteliali possa avere effetti anti-infiammatori.

Membrana-Tethered Mucina MUC1 è Fosforilata Da Epidermal Growth Factor Receptor in Cellule Epiteliali Respiratorie E Soci Con TLR5 Per Inibire L'assunzione Di MyD88

Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950). Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22250084

MUC1 è una glicoproteina di membrana-tethered mucina espressa sulla superficie apicale delle cellule epiteliali della mucosa. Precedenti studi in vivo e in vitro stabilito che MUC1 counterregulates infiammazione delle vie aeree sopprimendo TLR segnalazione. In questo articolo, abbiamo delucidare il meccanismo mediante il quale MUC1 inibisce la segnalazione TLR5. Sovraespressione di MUC1 nelle cellule HEK293 drasticamente ridotta espressione di IL-8 Pseudomonas aeruginosa-stimolato e diminuito l'attivazione di NF-κB e MAPK confrontato con le cellule che non esprimono MUC1. Tuttavia, la sovraespressione di MUC1 nelle cellule HEK293 non ha influito NF-κB o MAPK attivazione in risposta al TNF-α. Sovraespressione di MyD88 abolita la capacità di inibire l'attivazione di NF-κB MUC1 e iperespressione di MUC1 inibito associazione flagellina-indotta del TLR5/MyD88 rispetto ai controlli. La coda citoplasmatica di MUC1 associato TLR5 in tutte le cellule testate, tra cui HEK293T cellule, cellule di adenocarcinoma del polmone umano linea cellule A549 e umano e nelle cellule epiteliali delle vie aeree primario il mouse. Attivazione del fattore di crescita epidermico del recettore tirosina chinasi con TGF-α induce fosforilazione della coda citoplasmatica MUC1 presso la sequenza Y46EKV e la maggiore associazione di MUC1/TLR5. Infine, gli esperimenti in vivo hanno dimostrato immunofluorescenza aumentata presenza di Muc1/TLR5 e Muc1/phosphotyrosine colorazione modelli nell'epitelio delle vie aeree del mouse e aumentata fosforilazione della tirosina Muc1 in omogeneati del polmone del mouse dopo infezione da p. aeruginosa. In conclusione, la tirosina del ricevitore di fattore di crescita epidermico tirosine MUC1, portando ad un aumento della sua associazione con TLR5, quindi competitivo e reversibile inibendo l'assunzione di MyD88 a TLR5 e a valle di segnalazione eventi. Questa capacità unica di MUC1 per controllare TLR5 segnalazione suggerisce il potenziale ruolo nella patogenesi delle malattie polmonari croniche infiammatorie.

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