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Articles by Nathan J. Sniadecki in JoVE
JoVE General
Microfabricated Post-Array-detectores (mPADs): un enfoque para aislar las fuerzas mecánicas
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2University of Washington
En este vídeo, que muestran cómo fabricar y utilizar microfabricated detectores de POST (mPADs) para evaluar la modulación de la contractilidad celular.
Other articles by Nathan J. Sniadecki on PubMed
Presión Inducida Por Bombeo En Microcanales De Polímero Mediante El Control De Flujo De Efecto De Campo
Control de flujo de efecto de campo de microfluidos (Consejo) modifica el potencial zeta de flujo electroosmótico usando un campo eléctrico transversal se aplicó a través de la pared de microcanal. Demostrado previamente en basadas en silicio y vidrio microsystems, Consejo se presenta aquí como un elegante método para control de flujo en microfluídica con polímeros con un proceso de fabricación simple y de bajo costo. Además de modulación directa del flujo de Consejo, independientes los campos eléctricos transversales en microcanales conectados se han demostrado para producir una tasa de bombeo diferencial entre los microcanales. Las tasas de bombeo de diferentes electroosmótico formadas por control potencial zeta local inducen una presión interna en la intersección de microcanal, dando por resultado la hidrodinámica de bombeo a través de una interconexión microchannel campo libre. Modulación de la tensión aplicada a los electrodos de puerta ajusta la magnitud y dirección del bombeo de presión bidireccional, con velocidades de flujo de volumen de resolución fina de -2 a 2 nL/min en el campo libre con microcanales demostrado.
Patrones Emergentes De Un Crecimiento Controlado Por Forma Multicelular Y Mecánica
Los patrones espaciales de crecimiento celular generan tensiones mecánicas que ayudan a empujar, doblar, se expanden, y los tejidos se deforman en sus formas específicas. Los factores genéticos se piensan para especificar patrones de crecimiento y otras conductas de conducir la morfogénesis. Aquí, mostramos que forman el tejido en sí mismo puede alimentar a volver a regular los patrones de la proliferación. Uso de micro-fabricación para controlar la organización de las capas de células, se demostró la aparición de patrones estables de los focos de proliferación. Las regiones de crecimiento concentrado corresponde a las regiones de tensión traccional de alta generados dentro de la hoja, según lo predicho por un modelo de elementos finitos de la mecánica multicelulares y se mide directamente mediante el uso de una amplia sensor de fuerza micromecánica. La inhibición de la actomiosina basado en la tensión o las conexiones de la cadherina-mediadas entre las células interrumpe el patrón espacial de la proliferación. Estos hallazgos demuestran la existencia de patrones de las fuerzas mecánicas que se originan en la contracción de las células, salir de su organización multicelular, y el resultado en los patrones de crecimiento. Así, la forma del tejido no es sólo una consecuencia, sino también un regulador activo de crecimiento de los tejidos.
Fuerza Cortante En La Interfase Célula-matriz: Análisis Mejorado Para Microfabricated Detectores Mensaje De Matriz
La interacción de las fuerzas mecánicas entre el medio extracelular y el citoesqueleto de las unidades de desarrollo, reparación, y la senescencia en muchos tejidos. Definición cuantitativa de estas fuerzas es un paso vital en la comprensión de mechanosensing celular. Microfabricated detectores de matriz de correos (mPADs) proporcionan mediciones directas de las células generadas por las fuerzas en la adhesión celular a la matriz extracelular. Un nuevo enfoque para el etiquetado MPAD mensaje, la imagen volumétrica, y un análisis de la mecánica de flexión mensaje determinado que las células se aplican las fuerzas cortantes y los momentos no apuntan en la interfase de la matriz. Además, estas fuerzas podrían ser resueltas con precisión a partir de las deflexiones de correos mediante el uso de imágenes de las tapas de correos y bases. Herramientas de análisis de imágenes se desarrollaron a continuación, para aumentar la precisión y el rendimiento de la ubicación centroide mensaje. Estos estudios resultó en un método mejorado de medición de fuerza con una amplia aplicabilidad y ejecución concisa utilizando un sistema de fuerzas análisis totalmente automatizado. El nuevo método mide la célula fuerzas generadas con menos del 5% de error y menos de 90 segundos de tiempo de cálculo. Utilizando este enfoque, hemos demostrado la relación directa y distinta entre la fuerza de tracción celular y el área de propagación de la superficie celular para los fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales y células musculares lisas.
Nanotecnología Para Las Interacciones Célula-sustrato
En la búsqueda para entender la interacción entre las células y sus sustratos subyacentes, las ciencias de la vida están empezando a incorporar herramientas de micro-y basada en la nanotecnología a las células de la sonda y la medida. El desarrollo de estas herramientas augura un sinfín de posibilidades para nuevas ideas sobre las relaciones fundamentales entre las células y su microambiente que rodea que son la base de la fisiología de los tejidos humanos. Aquí, se revisan las técnicas y herramientas que se han utilizado para estudiar cómo una célula responde a los factores físicos en su entorno. También se discuten las preguntas sin respuesta que podrían ser abordadas por estos métodos para dilucidar mejor los procesos moleculares y las fuerzas mecánicas que dominan las interacciones entre las células y sus andamios físicas.
Microfabricated Silicona Matrices Elastoméricas Mensaje Para La Medición De Fuerzas De Tracción De Las Células Adherentes
Las células no musculares ejercen fuerzas biomecánicas conocidas como fuerzas de tracción en la matriz extracelular (ECM). La coordinación espacial de las fuerzas de tracción en contra de la ECM es en parte responsable de dirigir la migración celular, para la remodelación del tejido circundante andamio, y por los pliegues y reordenamientos visto durante la morfogénesis. Las fuerzas de tracción se aplica a través de un número de adherencias discretos entre una célula y el ECM. Hemos desarrollado un dispositivo que consiste en una serie de mensajes flexibles, capaces de medir microfabricated estas fuerzas en una célula adherente. Funcionalización de la parte superior de cada poste con proteínas ECM permite a las células para fijar y difundir a través de las copas de los puestos de trabajo. La deflexión de las puntas de los mensajes es proporcional a las fuerzas de tracción de células generadas durante la migración celular o la contracción. En este capítulo se describe la microfabricación, la preparación y el uso experimental de este sistema de microfabricated mensaje detector de array (mPADs).
Microposts Magnéticos Como Un Enfoque Para Aplicar Fuerzas a Las Células Vivas
Las células responden a fuerzas mecánicas si se aplican externamente o generada internamente a través del citoesqueleto. Para estudiar la respuesta celular a las fuerzas por separado, se les aplicó fuerzas externas a las células a través de mensajes microfabricated magnéticos que contienen los nanocables de cobalto intercaladas entre una serie de mensajes de elastómero, que actuaban como sensores independientes a las fuerzas de tracción celulares. Un campo magnético inducido par de los nanocables, que desvía los mensajes magnéticos y fuerza impartida a las adhesiones individuales de células conectados a la matriz. Utilizando este sistema, hemos examinado la reacción celular a las fuerzas aplicadas y se encontró que la aplicación de una fuerza de paso condujo a un aumento en el tamaño local de adhesión focal en el sitio de aplicación, pero no en los puestos no magnéticos cercanos. Reclutamiento adhesión focal se mejoró aún más cuando las células fueron sometidas a actuaciones de fuerza múltiples dentro de la mismo intervalo de tiempo. Grabación de las fuerzas de tracción en respuesta a la estimulación de la fuerza como puso de manifiesto dos respuestas: una pérdida repentina de la contractilidad que se produjo en el primer minuto de estimulación o una decadencia gradual de la contractilidad durante varios minutos. Para ambos tipos de respuestas, la distribución subcelular de la pérdida en las fuerzas de tracción no se limita a lugares cercanos a la micropost accionada, ni de manera uniforme en toda la celda, pero en su lugar se produjo en lugares discretos a lo largo de la periferia de la célula. En conjunto, estos datos ponen de manifiesto una importante relación dinámica biológica entre fuerzas externas e internas y demostrar la utilidad de este sistema microfabricated para explorar esta interacción.
Microposts Magnéticas Para La Estimulación Mecánica De Las Células Biológicas: Fabricación, Caracterización Y Análisis
Las células utilizan la fuerza como una señal mecánica para detectar y responder a su microambiente. La comprensión de cómo las fuerzas mecánicas afectan a las células vivas requiere el desarrollo de conjuntos de herramientas que se pueden aplicar fuerzas a escala nanométrica y también medir fuerzas de tracción celulares. Sin embargo, ha habido una falta de técnicas que se integran los componentes de accionamiento y detección para estudiar la fuerza como una señal mecánica. Aquí se describe un sistema que utiliza una matriz de microposts elastoméricos para aplicar fuerzas externas a las células a través de nanocables de cobalto incrustados dentro de los microposts. En primer lugar, el tratamiento de las superficies bioquímicamente para restringir la adhesión celular a los mensajes de los puestos de consejos. Luego mediante la aplicación de un campo magnético uniforme (B <0,3 T), que inducen par magnético sobre los nanocables que se transmiten a un sitio de adherencia celular como una fuerza externa. Hemos alcanzado las fuerzas externas de hasta 45 nN, que está en el intervalo superior de nanoescala actual fuerza de sondeo técnicas. Microposts no magnético, preparados de manera similar pero sin nanocables, rodean los microposts magnéticos y se utilizan para medir las fuerzas de tracción y los cambios en la mecánica de células. Nos registrar la magnitud y dirección de la fuerza externa y las fuerzas de tracción por ópticamente medición de la deformación de los microposts, que desvían linealmente como resortes en voladizo. Con este enfoque, podemos medir las fuerzas de tracción antes y después de la estimulación la fuerza para controlar la respuesta celular a las fuerzas. Se presentan los métodos de fabricación, la caracterización de la fuerza magnética y las técnicas de análisis de imagen utilizados para lograr las mediciones.
Un Pequeño Toque: Activación De Vías Con Nanopartículas Magnéticas De Señalización De La Célula
Nanopartículas magnéticas pueden recubrirse con ligandos específicos que puedan unirse a receptores en la superficie de la célula. Cuando se aplica un campo magnético, tira de las partículas para que entregan las fuerzas de nanoescala en la Unión del ligando-receptor. Se ha observado que el estímulo mecánico de esta manera puede activar vías de señalización celulares que se conocen como vías de mecanotransducción. Receptores de integrina, canales iónicos activados por tramo, adherencias focales y el citoesqueleto son actores clave en la activación de estas vías, pero todavía hay mucho que no sabemos acerca de cómo funcionan estos mechanosensors. La evidencia actual indica que las fuerzas aplicadas en estas estructuras pueden activar CA señalización, fuente familiar proteína quinasa MAPK y RhoGTPase caminos. Las técnicas de torsión magnético y pinzas magnéticas, que utilizan partículas magnéticas para aplicar fuerzas a las células, pagar un buen grado de control sobre cómo las células se estimulan y mucha promesa en la aclaración de los fundamentos de mecanotransducción. Las partículas no suelen ser perjudiciales para la salud celular, y sus dimensiones de nanoescala hacen ventajoso para sondear estructuras sensoriales de escala molecular de la célula. Esta revisión destaca los aspectos básicos de nanopartículas magnéticas, técnicas de partículas magnéticas y las estructuras y vías que intervienen en la mecanotransducción.
Retracción De Plaquetas Dinamometría Utilizando Sensores De Fuerza Poste Flexible
Las plaquetas desempeñan un papel importante en la hemostasia formando un enchufe trombótico que sella la pared del vaso y promueve la curación vascular. Después de que las plaquetas se adhieren y agregan en el sitio de la herida, su próximo paso es generar fuerzas contráctiles a través de la coordinación de las interacciones fisicoquímicas entre receptores de integrina alpha(IIb)beta(3) que retracción tamaño el trombo y fortalecer su adhesión a la matriz expuesta, actina y miosina. Aunque las fuerzas contráctiles de plaquetas (PCF) son una característica definitiva de hemostasia y trombosis, hay algunos enfoques que pueden medir directamente. En este estudio, describimos el desarrollo de un método para medir el PCF en microthrombi utilizando una matriz de sensor de fuerza microscópica poste flexible. Se efectuaron mediciones cuasi y viva imágenes microscópicas de plaquetas activado por trombina en los postes para analizar el desarrollo del PCF a varias condiciones hemostáticos. Se observaron microthrombi producir fuerzas que monótonamente creciente con el tiempo de concentración y la activación de la trombina, pero las fuerzas se desplomaron cuando la trombina se retiró. PCF resultados fueron estadísticamente similares en matrices de mensajes impresos con la fibronectina o fibrinógeno. Mediciones de PCF se combinaron con las mediciones de volumen del coágulo para determinar que la fuerza promedio por plaquetas fue 2.1 +/-0.1 nN después de 60 minutos, que es muy superior a lo que se ha medido con planteamientos previos. En general, las matrices de poste flexible para mediciones de PCF son un enfoque prometedor para evaluar la funcionalidad de la plaqueta, fisiología plaquetaria y patología, los impactos de diferentes matrices o agonistas en respuestas hemostáticas y en el suministro de información crítica sobre la actividad de plaquetas que puede guiar nuevas estrategias hemostáticas o trombóticas.
Fuerza Mecánica Caido Regula El Tamaño De Las Uniones Célula-célula
Contractilidad actomiosina afecta organización celular dentro de los tejidos, en parte, mediante la generación de fuerzas mecánicas en los sitios de célula-matriz y el contacto célula-célula. Mientras aumento de la carga mecánica en los resultados de la matriz celular en el crecimiento de las adherencias de adhesión focal, si los cambios de las fuerzas de accionamiento en el tamaño de las adherencias célula-célula sigue siendo una cuestión abierta. Para investigar la capacidad de respuesta de las uniones adherentes (AJ) a la fuerza, hemos adaptado un sistema de sensores de fuerza microfabricated de informes cuantitativos célula-célula tirando la fuerza y el tamaño de AJ. Hemos observado que el tamaño de AJ fue modulada por las células endoteliales por células tirando fuerzas: AJS y la fuerza de tirones o con caries creció con la activación o la inhibición de la miosina, respectivamente. La miosina dependiente de la regulación de AJs operados en conjunto con una Rac1, y esta regulación coordinada se puso de manifiesto al demostrar que los efectos de los agentes de la permeabilidad vascular (S1P, la trombina) sobre la estabilidad de la unión fueron revertidos al cambiar la medida en que estos agentes, junto a la RAC y la miosina dependiente de las vías. Además, la aplicación directa de la fuerza mecánica tirando, en lugar de la actividad miosina per se, era suficiente para activar el crecimiento AJ. Estos hallazgos demuestran que la coordinación dinámica de las fuerzas mecánicas y de interacciones célula-célula adhesivas probable es fundamental para el mantenimiento de la integridad multicelular y poner de relieve la necesidad de nuevos enfoques para estudiar las fuerzas tirando.
Desacoplamiento Por Difusión De Control Dimensional De Señalización En La Cultura En 3D Revela Un Papel De La Miosina En Tubulogenesis
Se presenta un novedoso microfabricated plataforma para la cultura dentro de las células matrices de tres dimensiones (3D) de dimensiones micrométricas, andamios de la matriz extracelular (microgeles). Estas culturas microescala eliminar las barreras de difusión que son intrínsecas a los sistemas tradicionales de cultivo en 3D (macrogels) y permitir la estimulación de citoquinas uniforme de la población la cultura toda, así como permitir que los ensayos de inmunomarcación, imágenes y orientada a la población a través de los bioquímicos microgeles relativamente coplanares. Examen de la señalización de los primeros asociados con el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) mediada por la dispersión y tubulogénesis de células MDCK reveló que la cultura 3D modula la respuesta celular tanto a través de la dimensionalidad y las tasas de alteración de la estimulación. Al comparar las respuestas en la cultura 2D, microgeles y macrogels demostrado que el HGF inducido por la señalización de ERK fue impulsado por la dinámica de la estimulación y no por si las células se encontraban en un entorno 2D o 3D, y que esta señalización ERK era igualmente importante para la dispersión de células HGF inducido sobre sustratos en 2D y en 3D tubulogenesis. Por el contrario, nos encontramos con una específica HGF inducida por aumento de la expresión de la miosina que conduce a regulación a la baja sostenida de la actividad de la miosina que se produjo sólo en los contextos en 3D y se requiere para tubulogénesis 3D, pero la dispersión no es 2D. Curiosamente, aunque ausente en las células sobre placas recubiertas de colágeno, downregulation de actividad miosina también producido por las células en geles de colágeno, pero fue transitoria y mediada por una combinación de desfosforilación miosina y expresión miosina mejorada. Por otra parte, la actividad de la miosina a través de regulación al alza de siRNA dirigido a una fosfatasa miosina no atenuó la dispersión en 2D, pero no inhibe tubulogénesis en 3D. En conjunto, estos resultados demuestran que las respuestas celulares a las señales solubles en la cultura en 3D están regulados por las tasas de estimulación y la dimensionalidad de la matriz, y poner de relieve la importancia de la disociación de estos efectos para identificar las primeras señales relevantes para la función celular en los entornos en 3D.
Las Fuerzas Mecánicas En Las Células Endoteliales Durante La Adhesión Firme Y Transmigración Temprana De Los Monocitos Humanos
Transmigración de los leucocitos a través de la barrera endotelial es un proceso estrechamente controlada que implica varios pasos, incluyendo la adhesión de rodadura, la adherencia firme, y luego la penetración de los leucocitos a través de la monocapa endotelial. Mientras que las señales moleculares clave han sido descritos en gran detalle, apenas estamos empezando a conocer las fuerzas mecánicas que intervienen en este proceso. Aquí, utilizando un sistema microfabricated que informa que las fuerzas de tracción generadas por las células, se describen las fuerzas generadas por las células endoteliales durante la firme adhesión de monocitos y la transmigración. Fuerza de tracción media a través de la monocapa endotelial aumentado de manera espectacular cuando los monocitos firmemente adherida y transmigrado. Interesantemente, la célula endotelial que estaba en contacto directo con el monocito exhibió mucho más grandes fuerzas de tracción en relación con sus vecinos, y la dirección de estas fuerzas de tracción alineado centrípetamente con respecto a los monocitos. El aumento de la fuerza de tracción se produjo en la zona local subcelular de la adhesión de los monocitos, y se disipó rápidamente con la distancia. Para comenzar a caracterizar la base de este efecto mecánico, nos muestran que perlas recubiertas con anti-ICAM-1 o VCAM-1 anticuerpos unidos a las monocapas podría reproducir este efecto. En conjunto, este estudio proporciona un nuevo enfoque para examinar el papel de la mecánica celular en la regulación de la transmigración de leucocitos a través del endotelio.
Simulaciones Del Ciclo Contráctil En La Migración Celular Mediante Un Modelo Bio-químico-mecánico
Migración celular depende de las fuerzas de tracción para propulsar una célula. Se han desarrollado varios modelos computacionales que ayudan a explicar la trayectoria que toman las células durante la migración, pero poca atención se ha colocado a las fuerzas de tracción durante este proceso. Aquí, hemos investigado la dinámica espacio-temporal de migración celular utilizando un modelo biomecánico-química contractilidad que incorpora los primeros pasos de la migración celular en una serie de mensajes. En el modelo, la formación de una nueva adhesión causa una reactivación de la Asamblea de fibra de estrés dentro de una célula. El modelo fue capaz de predecir la distribución espacial de las fuerzas de tracción con experimentos anteriores. Por otra parte, el modelo encontró que la energía de tensión ejercida por las fuerzas de tracción de una migración celular experimentó una relación cíclica que se levantó con la formación de una nueva adhesión y cayó con el lanzamiento de una adhesión en su parte trasera.
Rigidez Del Substrato Aumenta La Potencia De La Contracción De Cardiomiocitos Neonatales En Correlación Con Los Cambios En La Estructura De Miofibrillas Y Calcio Intracelular
Durante el desarrollo neonatal, hay un aumento en la rigidez miocárdica que coincide con un aumento en la contractilidad del corazón. Estudios in vitro han demostrado que la rigidez del sustrato desempeña un papel en la regulación de las fuerzas de contracción producidas por los cardiomiocitos inmaduros. Sin embargo, su efecto sobre el poder de contracción es confuso debido a las dificultades en la medición de la velocidad de contracción de cardiomiocitos. Aquí, presentamos lo que consideramos un nuevo enfoque para cuantificar la potencia de contracción combinando la resolución temporal de línea óptica de exploración con la resolución de fuerza subcelular de micropost matrices. Desde este enfoque, potencia de contracción fue encontrado para ser mayor de células cultivadas en posts más rígidos, a pesar de tener menores velocidades de contracción. El aumento del poder fue atribuido en parte a miofibrilla mejorada estructura (sarcómero mayor longitud y anchura de banda Z) y los niveles de calcio intracelular. Tinción inmunofluorescente de la α-actina reveló que los cardiomiocitos tenían mayor longitud del sarcómero y anchura de banda Z cuando cultivadas en arreglos de discos más rígidos. Por otra parte, la concentración de calcio intracelular y su ascenso con cada contracción de contracción fue mayor en las células en los postes más rígidos. En conjunto, estos resultados indican que los cardiomiocitos responden a rigidez de sustrato con cambios biomecánicos y bioquímicos que conducen a un aumento en la contractilidad cardiaca.
Mecanobiología De Plaquetas: Técnicas Para Estudiar El Papel De Retracción De Flujo Y De La Plaqueta Líquido Las Fuerzas En La Micro - Y Nano-escala
Coagulación implica una compleja serie de eventos que son importantes para mantener la hemostasia. Clásicamente se conocen interacciones bioquímicas para regular el proceso hemostático, pero la evidencia reciente ha revelado que las interacciones mecánicas entre las plaquetas y su entorno también pueden desempeñar un papel substancial. Las investigaciones sobre plaquetas mecanobiología han estado desafiando sin embargo, debido a las pequeñas dimensiones de las plaquetas y sus receptores de glicoproteína. Recientemente, investigadores de plaquetas han recurrido a dispositivos microfabricated para controlar estas interacciones físicas, de escala nanométrica con un mayor grado de precisión. Estos enfoques han permitido emocionantes, nuevas ideas sobre los factores moleculares y biomecánicos que afectan a las plaquetas en la formación de coágulos. En esta revisión, se destacan las nuevas herramientas utilizadas para entender mecanobiología de plaquetas y los papeles de adherencia, esquileo de flujo y las fuerzas de retracción en la formación de coágulos.
