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Articles by Neil A. Hukriede in JoVE
JoVE General
ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。
1Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh Drug Discovery Institute, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University of Pittsburgh, 4Department of Chemistry, University of Pittsburgh
我々は、マルチウェルプレートのゼブラフィッシュ遺伝子導入胚の自動化された画像と解析のためのシステムの開発について報告する。これは、線維芽細胞成長因子のレポーター遺伝子の発現に低分子化合物、BCI、の用量依存性の効果を測定し、高スループットのゼブラフィッシュの化学物質の画面を確立するための技術を提供する能力を示しています。
JoVE General
急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 3Department of Medicine and Genetics, Harvard Medical School
我々は2日後fetilization（DPF）急性腎障害（AKI）を誘導するためにゼブラフィッシュの幼虫にアミノグリコシド、ゲンタマイシンを、マイクロインジェクションのテクニックを説明します。我々はまた、AKIの媒介の損傷を可視化するためにゼブラフィッシュ幼生の埋め込みプラスチックと切片全体のマウント免疫組織化学のための方法を、説明します。
Other articles by Neil A. Hukriede on PubMed
SSDPタンパク質は、開発を規制するためにLIMドメイン結合タンパク質LDB1との対話
LIMドメイン結合タンパク質LDB1は、動物の発達を制御するLIM-ホメオドメイン蛋白質と他の転写因子が関与する転写複合体のアセンブリ内の重要な要素です。我々は、HeLa細胞におけるLDB1関連核複合体のコンポーネントとしてSSDPタンパク質を（以前に配列特異的な、一本鎖-DNA結合タンパク質として記述）を同定した。 SSDPタンパク質は追加の哺乳類の細胞型の様々なLDB1に関連付けられています。この協会は固有のものであり、核酸の存在に依存しない、機能的に重要である。 SSDPタンパク質をコードする遺伝子は、よくショウジョウバエからヒトへの進化の過程で保存されている。脊椎動物のSSDP遺伝子ファミリーは、いくつかの密接に関連したメンバを持つのに対し、ショウジョウバエSSDP遺伝子がユニークです。アフリカツメガエルでは、ショウジョウバエやマウスSSDP Ssdp1のmRNAによってコードされるSSDPは、LIM-ホメオボックス遺伝子Xlim1と一緒にLDB1によって軸誘導を強化します。さらに、我々はショウジョウバエの翅の開発にSSDPおよびチップ（LDB1のフライホモログ）との間の相互作用を実証することができました。これらの知見は、無脊椎動物と脊椎動物の間LDB1の補因子としてSSDPの機能保全を示しています。
原腸形成時の細胞運動のためにLIM1機能の保存要件
原腸陥入時にLIM1機能を調べるために、我々はアフリカツメガエルにおける行為のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびマウスの細胞移植を介して転写産物の枯渇を使用していました。アフリカツメガエルの胚は中胚葉細胞のアイデンティティが指定されているにもかかわらず、LIM1欠如前頭部の構造が枯渇し、原腸形成運動の失敗の結果として、適切な軸を形成するために失敗します。 （ - / - ）マウスの中胚葉の細胞の動きの類似した混乱は、LIM1で観察されています。 （ - / - ）近プロト（PAPC）の発現は、LIM1の初期の中胚葉で失われているマウスの胚およびLIM1枯渇アフリカツメガエル胚のオーガナイザーで、後者はPAPC外因性を供給することによってかなりの程度まで救出することができます。我々は、初期胚におけるLIM1の主な機能は、原腸陥入時に適切な細胞の動きを可能にすることであると結論付けている。
ゼブラフィッシュ犬耳突然変異Eya1、内耳と側線における細胞の生存と分化に必要な遺伝子を破壊する
感覚器官の開発と疾患の分子基盤を理解するために、我々は、クローニングされ、内耳と側線感覚系の形成に欠陥があるゼブラフィッシュ突然変異犬耳（犬）を特徴としています。犬の遺伝子座が不在-1（eya1）遺伝子、単一の点変異は、それぞれが途中でEYAドメイン内で発現したタンパク質を切り捨て、3つの独立した犬の遺伝子で発見された。目をエンコードしますまた、eya1遺伝子機能のモルホリノによるノックダウンは、使い古した変異をphenocopies。ゼブラフィッシュでは、eya1遺伝子が広く胚発生時のプラコード由来の感覚器官で発現がEya1関数は主に発展途上耳と側線neuromastsの感覚有毛細胞の生存に必要であることが表示されます。アポトーシスの増加レベルは、犬の胚と同様に主にクリステの感覚細胞を生じさせることを運命づけられている発展途上耳胞の領域における後方側線原基への移行で発生します。重要なのは、EYA1またはEYA4遺伝子の変異は、ヒトの遺伝性症候性難聴を引き起こします。ゼブラフィッシュの器官形成期EYA遺伝子機能の決定は、人間の前庭と聴覚障害の分子病因を理解することが容易になります。
ゼブラフィッシュKohtalo/trap230遺伝子は、脳、神経堤、と前腎腎臓の開発に必要な
遺伝子の変異は、メディエータ·コンポーネントの甲状腺ホルモン受容体関連タンパク質（TRAP）をコードする230/MED12は、ゼブラフィッシュ胚で複数のシステムの開発に影響を与えます。我々は、このタンパク質をコードする遺伝子で2つのエチルニトロソウレアによって誘発される遺伝子を単離し、ショウジョウバエの相同遺伝子座の後座kohtalo（公社）という。ホモ接合公社変異体ゼブラフィッシュの胚は、脳、神経堤、腎臓の開発の欠陥を示し、約6日postfertilizationで死ぬ。影響を受けた組織では、分化が開始され、多くの細胞型特異的遺伝子が発現されていますが、形態形成と分化を完了するには、失敗の障害があります。これらの結果は、TRAP230機能の重要な目標は、細胞移動、細胞選別、および組織アセンブリのための重要なタンパク質を含むことが示唆された。
ゼブラフィッシュCTCFのクローニングとキャラクタリゼーション：発達発現パターン、プロモーター領域の制御、遺伝子機構の進化的側面
CTCFは、多くの異なるDNA CTCFターゲットサイトへの配列特異的結合のためにその11亜鉛フィンガー（ZF）の異なるサブセットを使用できる核リンタンパク質である。そのようなサイトは、昆虫、鳥類、げっ歯類、霊長類を含むCTCF遺伝子がクローニングされている様々な多細胞生物、ゲノムDNA中に同定された。別の50-bpの長の配列とin vivoで形成されたCTCF / DNA複合体は、正と負のプロモーターの制御、およびすべての既知のエンハンサーブロッキング要素構成と後成的に調節要素を含む（ "クロマチン絶縁体"）の組織として多様な機能を仲介する。特定のCTCFサイトの異常な機能は、癌で、そのようなBWSとX不活性化歪んだようにエピジェネティックな症候群に関与している。ここではゼブラフィッシュ、貴重な脊椎動物のモデル生物からCTCF cDNAとプロモーター領域のクローニングおよび特性について説明します。フルレングスのゼブラフィッシュCTCF cDNAクローンは797アミノ酸をコードする2391 bpのオープンリーディングフレーム（ORF）の長さが4244 bpである。ゼブラフィッシュCTCFのアミノ酸配列はヒトCTCFの高いアイデンティティ（ジンクフィンガー領域内の最大98％）、およびエクソン - イントロン組織の完全な保護を示しています。サザンブロット分析では、ゼブラフィッシュのゲノムはCTCF遺伝子の単一コピーが含まれていることが示された。 in situハイブリダイゼーションで胚発生のすべての初期段階におけるゼブラフィッシュCTCF転写物の存在を明らかにした。ルシフェラーゼレポーターコンストラクトのすぐ上流の高度に保存されYY1/Initiator要素に配置されてゼブラフィッシュCTCFの転写開始部位の146 bpの範囲内のコアプロモーター領域を同定したトランスフェクションアッセイ。
ゼブラフィッシュEno2遺伝子由来の新規プロモーター要素を用いたタウオパチーのトランスジェニックゼブラフィッシュモデルの生成
本研究の目的は、神経変性のトランスジェニックゼブラフィッシュモデルを生成するためのシス作用性調節要素を分離することであった。ゼブラフィッシュエノラーゼ-2（eno2）はニューロンの発現が24から72時間後に受精（HPF）に増加し、成人期を通じて永続化した。イントロン1を包含し、エキソン1の上流8キロバイトからエクソン2に延びる12キロバイトeno2ゲノム断片は、同様の時間経過とともに、生体内で神経細胞のレポーター遺伝子の発現を駆動するのに十分であった。安定したTgの五独立した行（eno2：GFP）ゼブラフィッシュは、このようなコリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロンと小脳プルキンエ細胞などの神経変性との関連性を持つ集団を含むニューロンで広くGFPを発現した。我々はコードするcDNAを、ヒト微小管結合タンパク質タウの4反復アイソフォームで2-GFP融合遺伝子エクソンに置き換えられました。 eno2の第1イントロンは、キメラeno2-Tauの転写物から高忠実度と効率性スプライスであった。正常な人間の脳と、軸索、神経と神経原線維変化に類似した異所性神経細胞の蓄積にローカライズされた以上のゼブラフィッシュの脳：タウTgの約8倍高いレベル（タウeno2）で発現していた。 12キロバイトeno2プロモーターは、安定したトランスジェニックゼブラフィッシュの中枢神経系全体に分化した神経細胞で高レベルの導入遺伝子の発現を駆動します。この規制の要素は、神経変性のトランスジェニックゼブラフィッシュモデルを構築するために有用であろう。
ゼブラフィッシュ胚で自動化された画像ベースの表現型解析
現在、ゼブラフィッシュは、創薬の現代的なパラダイムと互換性の唯一の脊椎動物のモデルです。ゼブラフィッシュの胚では、高スループットの化学物質の画面に必要な自動化に適していると、光透過性は、彼らが潜在的に画像ベースのスクリーニングに適しています。しかし、複雑な画像の自動解析のためのツールの欠如は、ハイスループットスクリーニングモデルとしてゼブラフィッシュを用いた障害を示します。我々は、胚の向きのイメージングにかかわらず、マルチウェルプレートにゼブラフィッシュの胚を分析するための、ユーザーの介入なしで自動化されたシステムを開発しました。蛍光灯の胚の画像は、高含量リーダーに取得し、人工知能ベースの画像解析法と呼ばれる認知ネットワーク技術（CNT）を用いて分析した。 （：EGFP）（Y1）のTg（FLI1）96ウェルプレートに配列とanigiogenesisの小分子阻害剤で処理胚において体節間血管の発達を定量化したCNTは、確実にトランスジェニック胚の蛍光が検出されました。結果は、複雑な全体の生物の表現型を測定するためのイメージベースの高含有量スクリーニングの方法論を適応することが可能であることを実証。
ゼブラフィッシュにおけるLhx1aトランスジェニックレポーターの特性評価
LIMドメインを含む転写因子、Lhx1は、初期の原腸陥入の細胞の動き、腎臓の器官形成と脊椎動物のモデル生物の他のプロセスの調節に関与しています。ライブ胚におけるこの遺伝子の発現を追跡するには、我々はlhx1a調節領域の制御下で強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを作成しました。 TG（lhx1a：EGFP）（pt303）反復するだけ少数の例外を除いて開発の72時間を通じて、初期原腸胚段階での内因性lhx1a開始の発現。加えて、リンパ節リガンド、NDR1の過剰発現、遺伝子および内因性lhx1a式の併用拡大の結果。小分子SB-431542、Nodalシグナル阻害剤、遺伝子および内因性lhx1a式の両方の損失の結果（pt303）胚：TG（EGFP lhx1a）の治療。 （pt303）内因性lhx1aと同様に規制されている：これらの実験は、Tg（EGFP lhx1a）が示唆している。したがって、このレポーターはlhx1a式を監視するためだけでなく、化学遺伝学スクリーニングを含む多数のアプリケーションに対してだけでなく、利用することができます。
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害は、腎前駆細胞集団を拡大
腎臓再生の最初の特徴の一つは、通常、器官形成期に必要な遺伝子の再活性化である。この再活性化を強化する可能性のある化学物質の同定は、治療的に腎臓の再生を促進することができます。 （フェニルチオ）ブタン酸（PTBA）ゼブラフィッシュの腎臓器官形成の分子マーカーの発現領域を拡大 - ここでは、4があることがわかった。 PTBAは、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤4-フェニルブタン酸とトリコスタチンAに構造的および機能的類似性を示し、これらのHDAC阻害剤による治療はまた、腎前駆細胞集団を拡大しました。 in vitroおよびin vivoでの解析は、HDAC活性の阻害剤としてPTBA機能であることを確認した。さらに、PTBA媒介腎前駆細胞の拡大はレチノイン酸シグナル伝達を必要としました。要約すると、これらの結果は、腎前駆細胞、HDAC、およびレチノイド経路間の機械的なリンクをサポートしています。腎臓の再生を促進するための治療剤は、さらなる研究を必要とするPTBAは約束を保持しているかどうか。
ゼブラフィッシュにおける腎再生の可能アダルトネフロン前駆細胞の同定
多くの腎疾患、腎機能の根底の喪失。哺乳類は部分的に（腎臓の機能ユニット）はネフロンを修復することができますが、新しいものを形成することはできません。対照的に、魚は、その寿命を通じてネフロンを追加して、損傷後のネフロンのde novoを再生成し、哺乳類の腎臓の再生が治療的に活性化することができる方法を理解するためのモデルを提供しています。ここでは、ネフロン前駆細胞を含む小さな細胞の集合体に大人のゼブラフィッシュの新しいネフロンのソースをトレースします。 10月30日細胞を含む単一の凝集体の移植が生着から大人まで十分であり、複数のネフロンを生成します。自己再生をテストするためのシリアル移植実験では、ネフロン前駆細胞は、幹細胞活性と一致し、長寿命であり、大幅な複製の可能性を持っていることを明らかにした。緑色または赤色蛍光タンパク質でタグ付け混合ネフロン前駆細胞の移植は、複数のネフロン前駆細胞は、単一ネフロンに寄与することを示す、いくつかのモザイクのネフロンが得られた。これで、一貫性のある透明な幼虫におけるネフロン形成のライブイメージングは、腎性凝集体は、複数のセルの合体によって形成し、ネフロンへの分化を示した。一緒に、これらのデータは、ゼブラフィッシュの腎臓は、おそらく自己複製ネフロン幹細胞/前駆細胞が含まれていることを示しています。これらの細胞の同定は、分離やエンジニアリング同等の細胞を哺乳類では、小説腎再生治療法の開発への道が開けます。
ゼブラフィッシュ胚におけるエポチロンB耐性細胞と抗血管形成活性に対するin Vitro活性を有する新規Dictyostatin類縁体の合成の簡略化
天然物（ - ） - dictyostatinは強力パクリタキセル耐性クローンを含むヒト癌細胞の増殖を抑制する微小管安定化剤である。大規模な構造活性相関の研究では、活性の損失なしに変更することができる分子のいくつかの領域を明らかにした。これまでに説明し、最も強力な合成dictyostatinアナログ、6 - エピdictyostatinは、パクリタキセルと比べて、ヒト乳癌異種移植片に対するin vivo抗腫瘍活性に優れています。前臨床試験での励みに活動にもかかわらず、dictyostatinsの複雑な化学構造は、新規の抗腫瘍治療へのそれらの開発のための主要な障害を示します。我々は最近、6 - エピdictyostatinと比較して、16-デスメチル-25 ,26-dihydrodictyostatins見つかったいくつかの薬剤の合理的合成を報告して携帯電話微小管バンドルアッセイでナノモル活性を保持しなくてパクリタキセル耐性細胞に対して活性を失っていたβ-チューブリンの変異。これらの研究を拡張し、我々は25,26-dihydrodictyostatinおよび6 - エピ-25 ,26-dihydrodictyostatinを生成するための新しい、非常に収束合成を適用した。両化合物は、強力な微小管摂動in vitroおよびインタクトな細胞における誘導有糸分裂停止と微小管アセンブリそのエージェントであった。 （ - ） - dictyostatinとdiscodermolide in vitroでの放射性リガンドに結合研究は25,26-dihydrodictyostatinとC6-エピマーは、[3H]パクリタキセルと[14C]エポチロンBに匹敵する効力を持つ微小管からの変位が可能であることを示した。両化合物は、パクリタキセルと低ナノモル濃度でエポチロンB耐性細胞株の増殖を阻害し、MDA-MB-231ヒト乳癌細胞におけるパクリタキセルと相乗作用、およびトランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫で血管新生阻害活性を有していた。これらのデータは、スケールアップ合成し、さらに前臨床開発候補として25,26-dihydrodictyostatinおよび6 - エピ-25 ,26-dihydrodictyostatinを識別します。
Lhx1は、腎臓前駆細胞のフィールドの仕様が必要です
脊椎動物の胚では、腎臓は中間中胚葉に由来しています。 LIM-クラスホメオボックス転写因子lhx1は、初期、中間中胚葉で発現し、腎臓の間充織で表現された最初の遺伝子の一つであるされています。本研究では、過剰発現またはアフリカツメガエル胚の破壊lhx1または植培養系でlhx1を枯渇させるのいずれかの方法で腎臓のフィールドの仕様でLhx1の役割を調べた。過剰発現Lhx1の構成的に活性な形態では、我々は、腎臓の器官形成の仕様段階で腎臓フィールドを展開する能力を確立した。さらに、腎臓のフィールドを展開するLhx1の能力は、形態形成の段階に腎臓の器官形成の遷移として減少します。実験の無料のセットでは、我々はlhx1枯渇胚は、腎臓のフィールドのほぼ完全な消失を示すことが判明しました。腎組織を誘導する外植培養系を用いて、我々は両方の近位および遠位腎構造から遺伝子の発現がlhx1の有無によって影響されることを確認した。一緒に我々の結果は、中間中胚葉から全体の腎臓フィールドの仕様を推進する上でLhx1のために重要な役割を示しています。
ゼブラフィッシュ腎臓の開発：トランスレーショナルリサーチへの基礎科学
ゼブラフィッシュ胚のための腎臓の構造と機能のシンプルさ、腎器官形成と疾患を研究するためだけでなく、新しい治療法の探求のために重要なモデル系となっています。腎臓関連のciliopathiesと急性腎臓損傷（AKI）の性質や病気の状態に進出はゼブラフィッシュの研究によって進められてきた。このモデル生物は、ciliopathiesに関して、ヒトの疾患の変異遺伝子の機能解析に尽力してきました。さらに、AKIの分野では、ゼブラフィッシュの最近の作品は、通常の寿命中および腎障害への応答の両方で、ネオ·nephrogenesisために必要とされる善意の大人のゼブラフィッシュ腎臓前駆細胞（幹）細胞を同定した。一緒に、これらの研究は、ゼブラフィッシュの創薬の非常に有望な将来への幅広い世界的な人間の何百万に影響を与えるciliopathiesとAKIのスペクトル、およびポイントを研究するための成功モデルシステムとしてゼブラフィッシュを固める。このレビューの重点はヒト腎臓に関連するciliopathiesとAKIのモデルとしてゼブラフィッシュの役割になり、これらの複雑な病態の理解は、この小さな硬骨魚によって助長されている方法。
