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 JoVE General

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres


JoVE 1902 12/24/2010

Molecular Cell Biology, Weizmann Institute of Science

Microscopie multiphotonique permet de contrôler les photons de basse énergie avec une pénétration profonde et optiques phototoxicité réduite. Nous décrivons l'utilisation de cette technologie pour l'étiquetage de cellules vivantes dans des embryons de poissons zèbres. Ce protocole peut être facilement adapté à la photo-induction de diverses molécules lumière réactive.

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Dopaminergique Taille De Cluster Neuronale Est Déterminé Au Cours De Modélisation Du Cerveau Antérieur Précoce

Nous avons exploré les effets de robustes neuronaux signaux de structuration des plaques, comme voie de signalisation Wnt canonique, sur la différenciation et la configuration des sous-types de neurones dans le diencéphale poisson-zèbre à une seule cellule de résolution. Étonnamment, la perturbation de la signalisation Wnt n'a pas eu d'effet global sur la spécification des destins diencéphaliques, mais de manière sélective le nombre de touchés dopaminergiques (DA) des neurones. Nous avons identifié la zone ancêtre de DA dans l'ébauche diencéphalique de la plaque neurale en utilisant une méthode uncaging à deux photons à base et a montré que le nombre de non-DA neurones dérivés de cette zone géniteur n'est pas altérée par l'atténuation Wnt. En utilisant l'analyse birthdating, nous avons déterminé le calendrier de la division cellulaire des progéniteurs dernière DA et a révélé que le changement du nombre de cellules DA suite à l'inhibition Wnt n'est pas due à des changements dans la cinétique du cycle cellulaire de sortie. L'inhibition conditionnelle de Wnt et de la prolifération cellulaire a démontré que Wnt limite le nombre de progéniteurs DA pendant une fenêtre de la plasticité, qui se produit à la neurogenèse primaire. Enfin, nous avons démontré que Wnt8b est un modulateur du nombre de cellules DA qui agit par l'intermédiaire du Fz8a (Fzd8a) récepteur et son aval LEF1 effecteur, et qui nécessite l'activité du facteur de transcription Fezl (Fezf2) pour ce processus. Nos données montrent que la réponse différentielle des différentes populations neuronales au signal Wnt n'est pas une simple interprétation de leur position antéro-postérieure relative. Cette étude montre également, pour la première fois, que la taille de la population diencéphalique DA est modulé à l'intérieur de la plaque neurale beaucoup plus tôt que prévu, concomitante avec Wnt-médiées par les événements de structuration régionales.

Haute Résolution Plan Destin Du Diencéphale Poisson Zèbre

Le diencéphale agit comme un site interactif entre les systèmes sensoriels, centrale, et le système endocrinien et est l'une des structures les plus élaborées dans le cerveau des vertébrés. Pour mieux comprendre le développement embryonnaire et la morphogenèse du diencéphale, nous avons développé une photoactivation améliorée (uncaging)-basée lignée traçage stratégie. Pour déterminer la position exacte d'un domaine progéniteur diencéphalique donné, nous avons utilisé une lignée transgénique de conduire la protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules exprimant la protéine proneural, Neurogenin1 (Neurog1), qui a été utilisé comme un point de repère visible de la plaque neurale. Cette méthode facilitée étiquetage précise de groupes définis de cellules dans le diencéphale potentiel de la plaque de poisson-zèbre neuronal. De cette manière, nous avons appelé plusieurs zones de chevauchement de la diencéphale, assurant ainsi l'exactitude et la reproductibilité de notre lignée de traçage quelles que soient les changements dynamiques de la plaque neurale en développement. Nous présentons une carte sort du diencéphale le poisson-zèbre à une résolution spatiale plus élevée que précédemment décrit.

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