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Articles by Olgica Bakajin in JoVE
JoVE Bioengineering
タンパク質の折り畳みを研究するためのマイクロ流体ミキサー
1Department of Physics and Astronomy, Michigan State University, 2Department of Mechanical Engineering, Hong Kong University of Science and Technology, 3Center for Biophotonics, University of California, Davis
この研究では、〜8マイクロ秒で2つの溶液を混合することのできるマイクロミキサーの作製と使用について説明します。また、UV蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて分光検出とこれらのミキサの使用方法を示しています。
Other articles by Olgica Bakajin on PubMed
無電極一本鎖とダブル DNA の誘電泳動。
分子の誘電泳動トラップは、通常、高磁場勾配を提供する金属電極を使用して行った。本稿では水の電気分解により金属閉じ込め構造で実現可能であるよりもはるかに低い周波数で絶縁の狭窄部を用いた誘電泳動トラッピングを示しています。私たち無電極泳 (EDEP) を使用できることを示す濃度と一本鎖と二本鎖 DNA のパターニングのため。DNA 偏極イオン溶液のメカニズムは、周波数、粘度、および観測トラッピング力の磁場依存性に基づいて説明します。
単一分子計測フォールディング速度論。
非平衡系の条件下での単一分子の挙動を調べるため, 微細加工層流ミキサーを共焦点光学系に結合います。この組み合わせにより、蛍光共鳴エネルギー移動の時間分解測定ソリューション条件の急激な変化後。小さなタンパク質の観察の進行を折り畳みとして分子内距離分布の進化を見る。この手法は平衡の実験では見えなくなりますがネイティブ構造、優遇条件下で繰り広げられる蛋白質などのサブポピュレーションを公開できます。
タンパク質の折り畳みのマイクロ秒の速度論的研究のためにフェムトモルミキサー
我々は、タンパク質のフォールディングとフェムトモル8 MUSとサンプル消費量の混合時間と他の反応を研究するためのマイクロミキサーを開発しました。このデバイスは、私たちが遠く平衡から、以前にアクセスできない時間スケールでの条件下でのコンフォメーション変化にアクセスすることができます。本稿では、対流拡散現象と微粒子画像流速、色素消光と、一本鎖DNAのフォルスター共鳴エネルギー移動（FRET）の測定値を使用して、ミキサ性能の特性のモデリングを使用したミキサの設計と最適化について説明します。また、アシルCoA結合タンパク質とFRETを用いた高速タンパク質のフォールディング速度を測定することの可能性を示しています。
によって層静電高分子電解質 Nanoshells 個々 の炭素ナノチューブ テンプレート上の自己組織化。
カーボンナノ チューブ目立つようにしばらくの間、ナノテクノロジーに関する研究を紹介されているまだ共有的化学修飾カーボンナノ チューブ表面のための堅牢な戦略がまだ不足しています。このような戦略は機能デバイスのアーキテクチャを作成するために不可欠です。ここでは、高分子電解質層によって層アセンブリに基づいて炭素ナノチューブの修正のための新しい一般的な手順を提示します。我々 は最初に変更高分子電解質 macroions の層によって層堆積によるカーボンナノ チューブに続いてピレンとカーボンナノ チューブ表面個々 の炭素ナノチューブ橋周辺の多層構造を構築しています。ナノメーター厚みの非晶質ポリマー nanoshells ナノチューブの周りの形成は透過型電子顕微鏡や共焦点蛍光顕微鏡画像のスキャンを確認します。これらの多層高分子電解質のシェル個々 のカーボンナノ チューブ上ほぼ無限の機会を様々 な機能の定款は、順番に、複雑な多成分構造の構築の可能性を開きますカーボンナノ チューブ デバイスに導入します。
機能 1 次元脂質二重層炭素ナノチューブのテンプレート。
生物機械と環境小説生物無機ナノ構造での使用は、新しいタイプのバイオ センサー、バイオ NEMS デバイスおよび機能材料の開発に重要です。細胞膜を模倣する脂質二重膜はすでにこのようなアプリケーションで重要な役割を果たしています。自発的に連続ナノシェル テンプレート親水性ポリマーのクッションの層でラップされたカーボンナノ チューブのまわりで組み立てる人工脂質膜を提示します。我々 は、このような 1 D 脂質膜は流動的であるし、繰り返し被害回復サイクル以上もの欠陥を癒すことができますを示しています。単純拡散モデルは、これら 1 D nanoshells における脂質分子のモビリティを記述できます。これらの構造は、バイオ センサーおよびバイオ デバイスの新しいクラスの開発につながる可能性が。
高速大量輸送サブ 2 ナノメートル カーボンナノ チューブを介して。
配向したカーボンナノ チューブ直径未満 2 ナノメートルの孔としてサーブ微細加工膜を通してガスと水の流量測定を報告します。測定されたガスの流れ以上の大きさの順でクヌーセン拡散モデルの予測を超えています。測定水の流れは、以上 3 桁による連続体の流体力学モデルから計算される値を超えるし、分子動力学シミュレーションから外挿さ流量と同等です。これらのカーボンナノ チューブを用いた膜のガスと水の浸透率の商業ポリカーボネート膜細孔径は桁違い小さく持っていることにもかかわらず、それらのより高い数桁です。これらの膜では、限られた環境での大量輸送の基礎研究としてより多くのエネルギー効率の良いナノろ過を有効にします。
バイオアッセイ マイクロ チャネルの 1 分子蛍光検出に基づきます。
迅速なバイオアッセイ教育者の蛍光 DNA のプローブ DNA ターゲット平面マイクロ チャネルを流れる圧力駆動型のソリューションにバインドの検出に基づいて説明します。全内部反射蛍光プローブ励起とほぼ全体の流れのチャネルの照明を採用することにより、単一蛍光分子効率的にほぼ全体ソリューションの迅速分析につながるデバイスを介して流れていた検出できます。2 つのスペクトルに明瞭なプローブから得られる画像間の相互相関ターゲット濃度を決定するために使用し、効率的に偽陽性の数を減らします。低 pM レンジで 1 分未満での DNA ターゲットの迅速分析が示されています。
タンパク質の折り畳みの動力学を研究するためのマイクロ流体ミキサーの最適化
我々は、タンパク質のフォールディング研究のために開発されたマイクロ流体ミキサーの混合時間を最小限にするために数値シミュレーションと組み合わせて最適化手法を適用した。最適化手法は、ミキサの形状と流れの条件を変化させることにより、混合時間の大域的最小値を見つけるためにsemideterministicアルゴリズムを使用しています。我々は最小化問題と制約について説明し、最適化アルゴリズムの概要を提供します。我々は最適化されたジオメトリとパラメータの感度を含めて、最適化の結果を提示し、我々は微細加工のミキサーを用いた実験で混合性能の改善を示しています。元と最適化されたミキサ設計の色素消光実験は、7と4 MUS、40％削減のそれぞれの混合時間を示しています。新しいデザインはまた、ミキサーに入力して合理化を越えて、より均一な混合を提供しています。最適化されたミキサーは、タンパク質の折りたたみのための最速報告された連続フローミキサーです。
単一壁カーボンナノ チューブ固定に超高速ガスクロマトグラフィー マイクロ チャンネルにおける相します。
ガス ・ クロマトグラフィーの分急激な温度プログラム版への鍵です高速、低ボリュームの注入と短いメガボアカラム分離カラムと高速抵抗加熱。列ディメンション マイクロ ガスクロマト グラフ用の低減との主要な問題の 1 つは良い分離性能を提供します固定相の可用性です。この報告では, 単一壁カーボンナノ チューブ (Swnt) の最初の統合固定相として 100 の mum x 100 mum 広場と長さ 50 cm のマイクロ チャンネルに本.この列統合抵抗ヒーター付けの小さなサイズと SWNT 相の堅牢性を許可する最大 60 度 C/秒の高速温度プログラミングのため。高速温度プログラミングの組み合わせと狭いピーク幅高速, デュアル弁噴射システムから得ることができる小さなボリュームの注射剤の混合ガスの急速な色分解のことができます。私たち 4 化合物テストの再現性の高い分離を示す未満 1 s を使用してこれらの列に混合高速温度プログラミング。
静電カーボンナノ チューブ FET デバイスのゲート制御。
カーボンナノ チューブ トランジスタはオプティカルでないバイオ センサーの次の世代の有望なプラットフォームです。ただし、これらのデバイスでカーボンナノ チューブと生体分子の相互作用の性質を厳密に実用的な使用主要な障害の 1 つを作成不明のまま。これらのデバイスのゲーティングによる荷電分子を模倣する、カーボンナノ チューブ トランジスタの逆高分子電解質交互層を組み立てください。デバイスの多層膜外側のポリマー層の極性に応じてトランジスタのしきい値電圧の再現振動を示した。この現象は、単純な静電モデルの予測と良い一致を示しています。最後に、デバイス基板と周囲の電解質と吸着種の複雑な相互作用のデバイス特性に重要な予期しない影響を作り出すことができることを示します。
単一分子蛍光とキネティック放射光円二色性分光マッピング蛋白質の崩壊。
我々 は折りたたまれた状態の小さい低温ショック蛋白質 CspTm ネイティブに近い条件下でのコンホメーションのアンサンブルをプローブに単一分子蛍光共鳴エネルギー移動とキネティック放射光円二色性実験の組み合わせを使用しています。この政権はアンサンブル実験における平衡信号 2 つ折り分子によって支配されるので生理最も関連性が実験的にアクセスすることは困難です。ここでは、2 つの方法でこの問題を避けるため。1 つは平衡に折り畳まれたと展開されたサブポピュレーションの分離を可能にし長距離分子内距離分布に関する情報を提供します単一分子蛍光共鳴エネルギー移動の使用です。ドナーとアクセプター発色団をチェーン内の異なる位置に配置実験から、我々 繰り広げられた CspTm の距離分布ガウス鎖ポリペプチド鎖が展開されている高濃度変性剤のでだけでなく低ホルマリン濃度とよく驚くべきことに同意する、チェーンが折りたたまれているを見つけます。第二に、補完的なアプローチは、放射光円二色性による一過性急速混合可能マイクロ流体デバイスと移入折りたたまれた繰り広げられた分子です。折りたたまれた状態の折られた蛋白質と比較して約 20% の β 構造内容が示唆されました。これは、崩壊が以前高発泡の繰り広げられた蛋白質のためにのみ発見された長距離距離分布、ランダム コイルの特性と干渉することなくが折りたたまれていない状態に二次構造を誘導できることが示唆しています。
マイクロフルイディクスミキサーで観測されたタンパク質の疎水性の崩壊と早期折りたたみステップ
私たちは "崩壊"と呼ばれるサブミリ秒のタンパク質のフォールディングプロセスは実際には、少なくとも2つの独立したプロセスで構成されていることを示しています。我々は自然に約20三菱UFJ証券のデッドタイムとマイクロミキサーにおける時間の関数として、3よく研究されたタンパク質は、シトクロムc、アポミオグロビンとリゾチームのトリプトファンを発生し、UV蛍光スペクトルを観察します。 、2）、約100〜300マイクロとの間に発生する蛍光減衰1）、スペクトルの混合時間以内に発生しシフト：時間依存スペクトルの単一値分解は2つの独立したプロセスを明らかにした。まず、ネイティブ高等コンタクトの形成に疎水性の崩壊と2番目のプロセスに最初のプロセス属性。
混合時間とフォールディング反応速度論の研究のために設計されたデバイスの均一混合の改善。
蛋白質フォールディング反応速度論の研究のために設計されたマイクロ流体流ミキサーを使用して、1 + 1 の micros サンプル消費 femtomoles 順序で/のミキシング時間を示しています。我々 の提案したデザインの 2 つの制限は認識: (1) のサイズと時間の均一性と （2）、ミキシングを制限高流量でディーン渦の形成を混合、制限、混合領域の形状。我々 は狭いノズルの形状最適化を使用してこれらの制限に対処し、側のベンドを減らすことによってチャネルを合理化します。これらの機能の両方を組み合わせた、最終的なデザインは、最高のパフォーマンスを実現します。私たちのさまざまなデザインの混合性能結合ナビエ-ストークスと移流拡散方程式と蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) を用いた実験の数値シミュレーションによる定量化-DNA というラベルの付いた。
イオン排除サブ 2 Nm カーボンナノ チューブによる毛穴します。
生物毛穴の溶質、多種多様の携帯電話のトラフィックには高い選択性と高速フロー レートでしばしばを調節します。これらの毛穴共有いくつかの共通構造特徴： 細孔の内側の表面は疎水性残基を頻繁に並んでいるし、選択性フィルター領域にしばしば充電機能グループが含まれています。疎水性, 細径のカーボン ・ ナノチューブは簡単より堅牢なプラットフォームでこれらの重要な機能を再現することにより膜チャネルの簡略化モデルを提供できます。以前の研究は炭素ナノチューブ毛穴が自然アクアポリン チャンネルに匹敵する水フラックスをサポートできることを示した。ここでは、サブ 2 nm、配向炭素ナノチューブ膜化学 # 分子プラットフォームを使用してこれらの毛穴を通してのイオン伝導を調査します。選択性領域における荷電グループを模倣するには、負荷電のグループによるカーボンナノ チューブのオープニングでプラズマ処理による紹介します。圧力駆動型濾過実験を透過し、フィードのキャピラリー電気泳動解析、ソリューション イオン強度， pH， およびイオンの価数の関数としてこれらの膜でのイオン排除を定量化するために使用されます。炭素ナノチューブ膜 98% 一定条件下での高できる重要なイオン排除を示すことを示します。我々 の結果は、強く立体と流体力学的効果より少なく重要であると表示されるに対し固定細胞膜電荷と可動イオン間の静電相互作用によって支配、ドナン型拒絶反応メカニズムをサポートします。
シンクロトロン放射光円二色性分光法を用いた反応速度論の急速なフォールディングの調査のためのマイクロ流体ミキサー。
我々 はタンパク質折り畳み放射光円二色性 (SRCD) 分光法を用いた反応速度論の急速な測定用に最適化されてマイクロ ミキサーを開発しました。220 以下の波長で測定により、作製石英と放射の組み合わせ nm、商業インストルメンテーションの典型的な限界。これらの波長でタンパク質の二次構造の異なるタイプ間の差別は急上昇します。デバイスは、デッドの時間が 200 未満のマイクロ、サーペンタイン チャネルの設計を採用してで適度なサンプル消費の急速な混合を最適化されました。ここでは、我々 はデザインと製作、ミキサーの議論と広視野と共焦点 epi 蛍光顕微鏡を用いた混合効率の定量化します。私たちの小さい、折り畳み式の高速タンパク質、シトクロム c の折り畳みキネティクス SRCD 測定におけるデバイスのパフォーマンスを示しています。我々 の結果以前アクセスされている生体高分子の急速な構造変化を調査するための新しい可能性を開きます混合マイクロ流体で SRCD の組み合わせです。
生体機能 Biodetection の周期構造光導波路
生体分子の実時間検出のための多目的な生体機能サブ波長フォトニック デバイス プラットフォームを報告します。我々 のデバイスには高分子流れのチャネルにわたって伸びる金属酸化物ナノワイヤ導波路上に融合した脂質二重膜が含まれます。ターゲット受容体を組み込んだ脂質二重層伝搬光キャビティ エバネッで沈水生のです。脂質二重膜のデバイスで連続で非常に高いモバイル分数が、汚れに耐性があることを示します。また当社のプラットフォーム急速膜交換できることを示します。最後に、ソリューションへの脂質二重膜を固定相補的なプローブ DNA の繊維に特定の DNA ターゲット シーケンスのハイブリダイゼーションを検出するためにこのデバイスを使用します。アーキテクチャの検出このエバネッ セント波ポータブル, 全光検知システムの大きな可能性を保持します。
プロテインLの折りたたみ風景の耐久性
均衡と迅速な運動一連の実験のタンパク質LのB1ドメインの折りたたみ経路を探索することによって、我々はその展開状態は、2つの状態の折りたたみモデルによって提案されたより複雑であることが判明しています。約2〜4マイクロ秒以内に、タンパク質のフォールディングを開始する超高速ミキサーを用いて、内因性トリプトファン蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動によって折りたたみ動態を観察します。我々は、少なくとも2つのプロセスのトリプトファン蛍光を測定するストップトフロー装置のバースト位相の中に隠されるよりも速く100 MUを検出します。遅い分子拡散の以前に報告された測定結果は、2つの観測された高速のフェーズのいずれか遅い方に見合っています。これらの結果は、多次元エネルギー地形は、タンパク質Lの折りたたみを記述する必要があることを示唆している、と展開状態のダイナミクスは、複数の小さなエネルギー障壁によって支配されている。
マイクロ流体ミキサーのラムダリプレッサーのダウンヒル折り畳みの直接観察
タンパク質ラムダ（6から85）は、ナノ秒T-ジャンプの後の運動緩和の観測によってbarrierless折り畳みに関与している。この研究では、はるかに熱中点以下の温度で超高速マイクロミキサーの高変性剤の希釈した後に、このタンパク質の折りたたみを観察した。全強度とトリプトファン蛍光のスペクトルシフトの観測が明らかに異なる反応速度と活性化エネルギーが得られた。これらの結果は、反応座標に沿って異なる感度を有する異なるプローブで、低障壁、一次元、自由エネルギー面上に拡散として説明されることがあります。さらに、我々はT-ジャンプによって観察されなかった混合時間内で非常に高速な位相を観察し、展開状態のアンサンブルは、高変性剤が移入ことを示唆していると、高温でのアクセス可能なものとは異なります。
高速、温度プログラマブルなマイクロ チップに、改良された炭素ナノチューブの固定相を利用したガスクロマトグラフィー。
カーボンナノ チューブ (Cnt) 新しい接合技術とを組み合わせる生産のための新しい成長レシピ微細ガス ・ クロマトグラフィー (マイクロ GC) チップで実装されました。具体的には、micro GC チップ 30 cm (長さ) に含まれている 50 microm x 50 microm 正方形断面を有するマイクロ チャネル。CNT 固定相「マット」分離チャネル チップ接合前の底面に育った。注射、micro GC のチップは、以前に報告した高速ダイヤフラム バルブ技術を使用して行われました。FID 検出高速電位計ボードのために使用されました。すべて一緒に、結果だった、高効率、プログラマブル温度 (低熱質量を介して迅速なオンチップ抵抗加熱) マイクロ GC チップ。一般に、新しく設計されたマイクロ GC チップで有意に低い温度と圧力私たち以前に報告したマイクロ GC チップよりも優れた化学分離を生産しながら操作できます。走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像表示ナノチューブの比較的薄く、均一なマットの厚さ約 800 の nm チャンネルの内側。固定相はラマン分光法によるさらに特徴づけられました。固定相の均一性分離効率の向上とピーク対称性 (私たちの前のレポート) と比較して 5 n アルカン (n-ヘキサン, n-オクタン n ノナン、デカン、n ウンデカン) の混合物の分離の結果。温度を用いたオンチップ抵抗ヒーター 26 度の割合をプログラミング C/s ピーク容量 1.5 の時間ウィンドウ内に 8 つの生産。
機構と速度制御化学気相蒸着成長の多層カーボンナノ チューブ アレイの成長停止。
エチレン水素と水とアルゴンの混合ガスの触媒熱分解によって生成される多層カーボン ナノチューブ （チューブ） アレイの増殖動態を調べた。チューブの成長率は全圧依存性非単調展示し、全圧の約 750 Torr で最大値に達する。3000 Ppm を超える水濃度は観測された成長率の低下に します。最適な圧力と水濃度の組み合わせ最大成長率約 30 microm/分の「チューブ アレイ信頼性の高い成長結果。多数プロセスの上の 8 ％ 未満の配列高さ 8 ヶ月の時間にわたって広がる実行されるこれらのチューブの配列典型的な標準偏差 1 mm までの高みに到達することができます。成長急かつ不可逆的な終端に達するまでこの最適成長地域におけるカーボンナノ チューブ成長速度は本質的に一定になります。触媒粒子表面での非晶質炭素の蓄積をどのようにパッチを示す定量的モデルを提案し、この急激な新梢成長カーボンナノ チューブ周囲に炭素拡散を引き起こします。駆動力エチレン分解に及ぼすエチレンと水素分圧トータル プロセス圧力の関数としての成長率の非線形挙動について説明します。
非常にアンフォールドタンパク質Lに分子内拡散を遅くする
タンパク質の折り畳みの多くの理論で重要なパラメータは、エネルギー地形上の拡散速度である。それは折る前に、私たちは、タンパク質Lの展開B1ドメイン内分子の拡散速度を観察したマイクロミキサーを使用します。分子内接触の拡散律速速度は6 M GdnHClの速度よりも約20倍遅くなりますと、これらの条件でタンパク質はまた、よりコンパクトであるため、分子拡散係数は100から500倍に減少します。拡散の劇的な減速は、ミキサーの250マイクロ混合時間内に発生し、フォールディングの遷移状態に到達する前に、このレートのさらなる進化はないようである。我々は、観測された折りたたみ速度が十分に変性剤に依存する拡散係数を持つクラマース·モデルによって予測されていることを示していると、この拡散係数は、折りたたみ式の観測率に重要な貢献であると推測している。
カーボン ・ ナノチューブにおける PH チューナブル イオン選択の毛穴します。
施したにおけるイオン輸送の選択性は、多数の物理・化学・生物学的プロセス流体の分離からイオン チャネル調節細胞プロセスに至るまでの主な重要性です。これらの現象を理解モデル施した明確かつ制御可能な構造のプロパティを持つ必要があります。カーボンナノ チューブは理想的な選択肢は、単純な化学構造、原子スケールの滑らかさと黒鉛の壁の化学不活性とその直径と長さの特性を有するチューナブルのため化学 # 分子研究のためを提供します。ここでは、単一の選択性を調査して、初めて、塩混合系シリコン窒化膜における唯一の毛穴を務める狭いカーボンナノを介して輸送。我々 負荷電のカルボキシル イオン除去性能の炭素を担当カーボンナノ チューブの毛穴や小さな塩のイオン透過にさまざまなソリューションの pH によってチューニングできるを示しています。ソリューションの組成とイオンの原子価圧力駆動流における共通の陽イオンとバイナリの電解質のための効果の調査が明らかに遅くの添加より速く 1 価陰イオン拡散のソリューションへの多価陰イオン拡散 1 価陰イオンの浸透を支持します。大きい分数と追加された多価陰イオンの原子価 1 価陰イオンの拒絶反応を下げます。いくつかのケースでは、低 1 価イオン コンテンツで否定的な拒絶反応を観察します。
ビリンのかぶとサブドメインに対する複数のフォールディング経路の証拠
タンパク質のフォールディングの二状態モデルの定義するプロパティは、測定された緩和率は開始条件とは独立しており、唯一の最終的な条件に依存していることです。この研究では、レーザーT-ジャンプ実験の小さな温度変化後に測定した動力学と超高速マイクロミキサーを用いて、変性剤濃度の大きな変化後に測定し、非常に高速な折りたたみビリンサブドメインの動態を比較し、有意差を見つける折りたたみ速度を観察した。初期条件は非常に異なっていながら、温度や変性剤濃度およびプローブとしてトリプトファン蛍光の使用の最後の条件は、両方の実験でも同じです。遅い混合速度はオンまたはオフ経路の中間体のモデルをサポートするT-ジャンプ実験における速い段階、の証拠を示していない。むしろ我々はトラップですそのうちのいくつか展開状態のアンサンブルの証拠として結合されたミキサーとT-ジャンプの実験を解釈します。高変性剤から希釈した後、アンサンブルはより温度の上昇後のアンサンブルよりも拡大され、平均して、ネイティブの状態に到達するまで時間がかかります。
