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Articles by Patricia Lam in JoVE
JoVE General
Verwendung von Arabidopsis-Mutanten zu eceriferum Kutikula Biosynthese entdecken
1Department of Botany, University of British Columbia - UBC, 2Department of Chemistry, University of British Columbia - UBC
Die Kutikula ist eine wachsartige Außenhaut auf Pflanzen, die eine primäre Rolle in Wasserschutzgebieten hat aber auch eine wichtige Barriere gegen das Eindringen von pathogenen Mikroorganismen. In diesem Video zeigen wir die Analyse der Kutikula-Mutanten durch Forward-und Reverse Genetik Ansätze identifiziert.
Other articles by Patricia Lam on PubMed
CER4 Codiert Ein Alkohol-bildenden Fetthaltige Acyl-Coenzym Cuticular Wachs Produktion in Arabidopsis Eine Reduktase Beteiligt
Eine wachsartige Kutikula, die als schützende Barriere gegen unkontrollierten Wasserverlust und Umweltschäden Mäntel die Antenne Oberflächen der Landpflanzen dient. Es besteht aus einer Polymermatrix Cutin und Wachse. Cuticular Wachse sind komplexe Mischungen von sehr langkettigen Fettsäuren und ihre Derivate. Wir berichten hier die molekulare Klonierung und Charakterisierung von CER4, ein Wachs biosynthetischen gen von Arabidopsis (Arabidopsis Thaliana). Arabidopsis cer4 Mutanten weisen bedeutende Verringerungen der Vorbau primären Alkoholen und Wachsestern und leicht erhöhte Konzentrationen von Aldehyden, Alkane, sekundäre Alkohole und Ketone. Dieser Phänotyp vorgeschlagen, dass CER4 ein Alkohol-bildenden fetthaltige Acyl-Coenzym A-Reduktase (FAR) codiert. Wir identifiziert acht FAR-ähnliche Gene in Arabidopsis, die hoch mit einem Alkohol-bildenden weit ausgedrückt in Samen der Jojoba (Simmondsia Chinensis) zusammenhängen. Molekulare Charakterisierung von CER4 Allele und genomische Ergänzung ergab, dass einer dieser acht Gene, At4g33790, FAR für eine cuticular Wachs Produktion codiert. Ausdruck von CER4 cDNA in der Hefe (Saccharomyces Cerevisiae) führte die Anhäufung von C24:0 und C26:0 primären Alkoholen. Voll funktionsfähiges grünes fluoreszierendes Protein-Tag CER4 Protein wurde auf dem Endoplasmatischen Retikulum in Hefezellen durch konfokale Mikroskopie lokalisiert. Analyse der Genexpression durch reverse Transkription-PCR ergab, dass CER4 in Blättern, Stengeln, Blüten, Schoten und Wurzeln zum Ausdruck kam. Ausdruck eines Beta-Glukuronidase-Reporter-Gens, angetrieben durch den CER4-Projektträger in transgenen Pflanzen wurde in Epidermiszellen der Blätter und Stengel, mit einer dedizierten Rolle für CER4 in cuticular Wachs Biosynthese erkannt. CER4 wurde auch in allen Zelltypen in der Dehnung-Zone der jungen Wurzeln ausgedrückt. Diese Daten zeigen, dass CER4 ein Alkohol-bildenden ist fernen, die Spezifität für sehr langkettigen Fettsäuren und ist verantwortlich für die Synthese von primären Alkoholen in den Epidermiszellen der Antenne Gewebe und Wurzeln.
Eine Kern-Untereinheit Des Die Exosome RNA-Verarbeitung/erniedrigender Beeinflusst Speziell Cuticular Wachs-Biosynthese in Arabidopsis
Die Kutikula ist eine extrazelluläre Matrix, bestehend aus Cutin Polyester und Wachse, die Antenne Organe der Landpflanzen deckt und schützt sie vor Umwelteinflüsse. Der Arabidopsis Thaliana cer7 Mutant Exponate reduzierten cuticular Wachs Anhäufung und enthält erheblich niedrigere Abschrift von ECERIFERUM3/WAX2/YORE-einst (CER3/WAX2/YRE), einem wichtigen Wachs biosynthetischen gen. Hier zeigen wir, dass CER7 Protein ist ein mutmaßliches 3'-5' Exoribonuclease homologe zu Hefe Ribonuclease PH45 (RRP45p), ein Kern-Untereinheit der RNA Verarbeitung und erniedrigende Exosome, die den Ausdruck der CER3/WAX2/YRE steuert. Wir schlagen CER7 wirkt, indem es eine spezifische mRNA-Spezies, die Codierung eines negativen Regulator der Transkription CER3/WAX2/YRE erniedrigend. Eine zweite RRP45p Homolog gefunden in Arabidopsis, bestimmt am RRP45a, ist teilweise funktional redundant mit CER7 und vollständigen Funktionsverlust des RRP45 in Arabidopsis ist tödlich. Unseres Wissens ist die CER7 derzeit das einzige Beispiel für eine Kern-Exosomal-Untereinheit, speziell einen zellulären Prozess zu beeinflussen.
Aktivierung Von Rekombinanten Menschlichen TRPV1-Rezeptoren in SH-SY5Y Menschlichen Neuroblastoma Zellen Ausgedrückt Erhöht [Ca(2+)](i), Initiiert Von Neurotransmitter-Freisetzung Und Verzögerter Zelltod Fördert
Der transienten Rezeptor potenzielle (TRP) Vanilloid-Rezeptor Subtyp unter 1 (TRPV1) ist ein ligandengesteuerte, Ca(2+)-durchlässigen Ionenkanal in der TRP-Superfamilie der Kanäle. Wir berichten die Einrichtung das erste neuronale Modell Ausdrücken rekombinanten menschlichen TRPV1 (SH-SY5Y(hTRPV1)). SH-SY5Y menschlichen Neuroblastoma Zellen waren die mit hTRPV1 stabil transfected mit dem Amaxa Biosystem (hTRPV1 in pIREShyg2 mit Hygromycin-Auswahl). Capsaicin, Olvanil, Resiniferatoxin und das Endocannabinoid Anandamid erhöht [Ca(2+)](i) mit Potenz (EC(50)) Werte 2,9 Nmol/L, 34,7 Nmol/L, 0, 9 Nmol/L und 4.6 Mikromol/L, beziehungsweise. Die vermeintliche Endovanilloid N-Arachidonoyl-Dopamin erhöht [Ca(2+)](i) aber diese Antwort nicht erreicht ein Maximum. Capsaicin, Anandamid, Resiniferatoxin und Olvanil vermittelten Anstieg [Ca(2+)](i) wurden durch die TRPV1-Antagonisten Capsazepine und Iod-Resiniferatoxin mit Potenzen gehemmt (K(B)) von ca. 70 Nmol/L und 2 Nmol/L, beziehungsweise. Capsaicin stimuliert die Freisetzung von pre-labelled [(3) H] Noradrenalin aus Monolayers SH-SY5Y(hTRPV1) Zellen mit einem EC(50) von 0,6 Nmol/L, die Verstärkung zwischen ["Ca(2+)](i)" und "Release". In einem System Perfusion wir gleichzeitig gemessen [(3) H] Noradrenalin-Freisetzung und [Ca(2+)](i) und beobachtet, dass erhöhte [Ca(2+)](i) vorangestellt Sender freizugeben. Capsaicin-Behandlung produzierte auch zytotoxische Reaktion (EC(50) 155 Nmol/L) die Antagonisten-Sensitive und gespiegelt [Ca(2+)](I) Antwort. Dieses Modell zeigt Pharmakologie TRPV1 heterologously ausgedrückt in nicht-neuronale Standardzellen und native neuronale Kulturen entsprechen. Der Vorteil des SH-SY5Y(hTRPV1) ist die Fähigkeit der hTRPV1 paar neuronale biochemischen Maschinen und produzieren große Mengen von Zellen.
Ultra-Performance Liquid Chromatographie Tandem Massenspektrometrie Methode Zur Messung Von Anandamid in Humanem Plasma
Anandamid (N-Arachidonoylethanolamine, AEA) ist ein Endocannabinoid im Blutplasma, die mit mehreren physiologischen Funktionen und Krankheitzuständen ist, vorhanden. Erhebliche Variabilität der AEA-Plasmakonzentrationen wurde zwischen Studien, berichtet, weil die Quantifizierung der AEA mit methodischen Schwierigkeiten behaftet ist. Eine schnelle, hochsensible, robuste, spezifische und hoch reproduzierbare ultra high Performance liquid Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-MS/MS) Methode wird hier für die Analyse von AEA in humanem Plasma beschrieben. Diese vollständig validierten Methode mit Octa-deuterated AEA (AEA-d8) wie ein internes Standards eine Verbesserung gegenüber der vorherigen stellt analysiert im Hinblick auf die Laufzeit (4 min), Nachweisgrenze (0,055 Fmol auf Spalte, 18,75 Fmol/ml Plasma), Genauigkeit (relative Standardabweichungen von 3,7 3,9 und 4,8 % für 1,66, 6,65 und 133 Fmol auf Spalte) und Genauigkeit (97,5-104,5 %). AEA-Analyse wurde linear über Bereich 0,23 bis 19 nM (1,66 bis 133 Fmol Spalte). Um den Nutzen dieser Methode zur Messung der AEA-Ebenen in klinischen Proben zu demonstrieren, Plasmaproben aus weiblichen Freiwilligen in den verschiedenen Phasen des Menstruationszyklus und schwangere Frauen wurden normalisiert. AEA Plasmakonzentrationen waren signifikant (P = 0.0078) in die Luteal-Phase des Menstruationszyklus im Vergleich zu der follikulären Phase niedriger. In der Schwangerschaft waren die Konzentrationen in den ersten und zweiten Trimester mit Ebenen vergleichbar mit denen in der Luteal-Phase des Menstruationszyklus beobachtet und bescheiden stiegen im dritten Trimester am niedrigsten. Die höchste AEA-Plasmaspiegel in aktive Arbeit bei Frauen beobachtet wurden, und diese waren erheblich (P = 0.0147) höher als die bei Frauen am Begriff aber nicht im aktiven Arbeit zu beobachten. Frauen nach der Menopause hatte AEA Konzentrationen vergleichbar der Luteal-Phase der prämenopausalen Frauen beobachtet und waren signifikant (P = 0.0389) niedriger als AEA-Plasmaspiegel erreicht der follikulären Phase. Die Empfindlichkeit und Genauigkeit der hier beschriebenen validierte Methode legt nahe, dass diese Methode eignet sich für die Analyse von AEA in klinischen Proben und für die Untersuchung von Biomatrices mit begrenzte Mengen an AEA genutzt werden kann.
Ermittlung Der Wachs-Ester-Synthase/Acyl-Coenzym A: Diacylglycerol Acyltransferase WSD1 Für Vorbau-Wachs-Ester-Biosynthese in Arabidopsis Erforderlich
Wachsestern sind neutralen Lipiden bestehend aus aliphatischen Alkoholen und Säuren, mit beiden Adsorptionseigenschaften normalerweise langkettige (C(16) und C(18)) oder sehr langkettigen (C(20) und länger) Kohlenstoff-Strukturen. Sie haben vielfältige biologische Funktionen in Bakterien, Insekten, Säugetiere und terrestrische Pflanzen und sind auch wichtige Substrate für eine Vielzahl industrieller Anwendungen. In Pflanzen, Wachsestern findet meist in die Nagelhaut, die Beschichtung der primären Shoot-Oberflächen, aber sie sammeln auch in hohen Konzentrationen in der Samenöle wenige Pflanzenarten, einschließlich Jojoba (Simmondsia Chinensis), eine Wüste Strauch, der die größte kommerzielle Quelle dieser Verbindungen ist. Hier berichten wir über die Identifizierung und Charakterisierung von WSD1, ein Mitglied der bifunktionelle Wachs Ester Synthase/Diacylglycerol Acyltransferase gen Familie, die Wachs-Ester-Synthese in Arabidopsis (Arabidopsis Thaliana) Stängel eine Schlüsselrolle spielt, als erstes stark reduzierten Wachs-Ester-Ebenen der im Vorbau Wachs wsd1 Mutanten belegt. In-vitro-Assays mit Protein Auszüge aus Escherichia coli Ausdrücken WSD1 zeigte, dass dieses Enzym ein hohes Maß an Wachs-Synthase-Aktivität sowie etwa 10fach verbesserter unteren Diacylglycerol Acyltransferase Aktivitätsniveau hat. Ausdruck des WSD1-Gens in Saccharomyces Cerevisiae führte die Anhäufung von Wachsestern, aber nicht Triacylglycerol, darauf hinweist, dass die WSD1 überwiegend als eine Wachs-Synthase fungiert. Analysen des WSD1 Ausdrucks ergab, dass dieses Gen in Blumen, oberen Teile der Stiele, transkribiert ist und verlässt. Voll funktionsfähiges fluoreszierendes Protein-Tag gelbes WSD1 Protein, Endoplasmatisches Reticulum, demonstrieren die Biosynthese von Wachsestern, die Endprodukte des Alkohol-bildenden Signalweges lokalisiert wurde, tritt in dieser subzellulare Fach.
Eine Festphasen-Methode Für Die Extraktion Und Die Messung Von Anandamid Aus Mehreren Menschlichen Biomatrices
N-Arachidonoylethanolamine (AEA, Anandamid) war die erste Endocannabinoid identifiziert werden und mittlerweile hat die Vermittlung verschiedener Körperfunktionen und Krankheitzuständen zugeordnet. AEA wurde von zahlreichen Geweben und hinter, im Bereich von niedrigen Nanomolar, isoliert mit Techniken der Lipid-Extraktion mit organischen Lösungsmitteln. Diese Techniken erfordern die Trocknung nach unten relativ großer Mengen an Lösungsmitteln, macht sie ungeeignet für Hochdurchsatz-Analyse. Hier beschreiben wir eine Festphasen-(SPE)-Extraktionsmethode zur Untersuchung der AEA-Konzentrationen im Blutplasma, Serum, Milch, Urin, Fruchtwasser, peritonealen Flüssigkeit, Speichel, follikuläre Flüssigkeit und Flüssigkeit aus einer Ovarialzyste. AEA wurde in Serum und Plasma aus Blut isoliert von 20 erwachsenen Frauen erkannt (+/-Standardabweichung bedeutet: 0.68+/-0.29 und 0.64+/-0.28 nM bzw.), von Schwangeren am Begriff (1.37 +/-0,42 nM), und von Nabel-Vene (1.26 +/-0,33 nM) und Nabelgegend Arterie (1.14 +/-0 .35nM), in der Milch (0.12 +/-0,05 nM) und aus Amnionflüssigkeit (0,03 +/-0,02 nM), Peritonealdialyse (0.93 +/-0.27 nM), follikuläre (1.17 +/-0.51 nM), und Ovarialzyste (0,32 +/-0,01 nM) Flüssigkeiten. AEA wurde im Speichel und im Urin nachweisbar. Die 60 %-AEA-Absaugleistung mit SPE aus Plasma erreicht war die 19 % Effizienz erreicht, mit der vorhandene organische Lösungsmittel-Extraktion-Methode überlegen. Grenzen der Quantifizierung und Erkennung von AEA wurden auch verbessert drastisch mit SPE (8 und 4 Fmol/ml) im Vergleich mit organische Extraktion (25 und 18.75 Fmol/ml Plasma). Diese Verbesserungen ermöglichen die Verwendung von kleineren Plasmaproben mit SPE. Intra- und interday Variabilität waren vergleichbar, und die mittlere AEA-Konzentration der gepoolten Plasmaproben (1,18 nM, n = 15) war identisch mit der beiden Techniken. Ebenso Wenn 56 Plasmaproben aus arbeitend und nonlaboring Frauen mit beiden Techniken analysiert wurden, wurden keine Extraktion-Methode-abhängige Unterschiede beobachtet. Daher bieten wir Beweise für eine robuste SPE-Technik zur Gewinnung von AEA von Biomatrices die vorhandenen Flüssigkeit Extraktionsmethoden, mit der SPE-Technik überlegen hinsichtlich Geschwindigkeit, Absaugleistung und erforderliche Stichprobenumfang zu ersetzen.
Anandamid-Spiegel Im Menschlichen Weiblichen Reproduktiven Geweben: Festphasen-Extraktion Und Messung Von Ultraperformance Flüssigchromatographie Tandem-Massenspektrometrie
Anandamid (N-Arachidonoylethanolamide), eine bioaktive Lipide, wird berichtet, dass eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Schwangerschaft und Geburt. Unsere Ziele waren auswerten (1) AEA-Level bei menschlichen Müttern: Validieren fetalen Schnittstelle und (2) die Verwendung von Festphasen-Extraktion von AEA aus Gewebe. AEA im Netzkabel und mütterlichen Blut, Fruchtwasser, Plazenta analysiert wurde, und die fetale Membranen während gesammelt Kaiserschnitt (n = 14). Extraktion Wirkungsgrade lagen 42 bzw. 36 % für die Plazenta und die fetalen Membranen. Gewebe AEA wurde mit Hilfe einer Isotop-Dilution-Methode und UPLC-ESI-MS/MS, Intra - und inter - Tag Variabilität für Gewebe gespickt mit 0,2 und 1 5pmol/g AEA von weniger als 12 % quantifiziert. Genauigkeit für diese Spike Beispiele war zwischen 95 und 103 % für fetalen Membranen und 99 bis 114 % für Plazenta. Meine AEA-Konzentrationen waren 2,72 + oder - 1,04 Pmol/g für Plazenta und 1.19 + oder - 0,68 Pmol/g für fetalen Membranen und 0,93 + oder - 0,28, 0,88 + oder - 0,33, 0,77 + oder – 0.30 und 0,06 + oder - 0,04 für mütterliche, Nabel-Vene, und Nabelgegend Arterie Plasma und Fruchtwasser. Höhere Konzentrationen von AEA fanden sich in der Plazenta, die im Vergleich zu fetalen Membranen (P < 0,0001), in Nabel-Vene gegenüber Nabelgegend Arterie (P = 0,0015), und im Plasma aus dem mütterlichen Verkehr gegenüber Nabelgegend Arterie (P = 0.0152). Die Relevanz dieser Änderungen in AEA-Konzentrationen bei der mütterlichen: fetale Schnittstelle erfordert weitere Untersuchungen.
Endocannabinoide Und Schwangerschaft
Acylethanolamides z. B. Anandamid (AEA) und Kohlenhydrate wie 2-Arachidonylglycerol sind Endocannabinoide, die Cannabinoid, Vanilloid und Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptoren binden. Dieser Verbindungen, ihre verschiedenen Rezeptoren, die angeblichen Membran Transporter(s) und verwandte Enzyme, die synthetisieren und erniedrigen sie werden kollektiv als die "Endocannabinoid-System (ECS)" bezeichnet. Unzureichend definierte zelluläre und Molekulare Mechanismen steuern die biologischen Wirkungen des ECS. In den letzten hat Jahrzehnt Beweise Schwellenländern wurde verlangt, dass ECS spielt eine bedeutende Rolle in den verschiedenen Aspekten der menschlichen Reproduktion. In diesem Bericht fassen wir unser gegenwärtige Verständnis dieser Rolle vor allem die Beteiligung der AEA und verwandte ECS-Elemente bei der Regulierung der Oogenese, Embryo oviductal Transport, Einnistung der Blastozyste, Plazenta-Entwicklung und Schwangerschaft und Spermien überleben, Motilität, Rechtsfähigkeit und Akrosom Reaktion. Darüber hinaus wird die Möglichkeit, dass Plasma und Gewebe AEA und andere Cannabinoide zuverlässige diagnostische Marker der natürlichen und assistierten Reproduktion and Pregnancy Outcomes bei Frauen darstellen kann diskutiert werden.
Gleichzeitige Messung Von Drei N-Acylethanolamides in Menschlichen Bio-Matrizen Mit Ultra-Performance Liquid Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie
Endocannabinoide inklusive N-Acylethanolamides (NAEs) eine Familie der Lipid-bezogene signalisierende Moleküle verwickelt in vielen physiologischen sind und Krankheit-Staaten, die ihre Aktivitäten über die Cannabinoidrezeptoren zu entlocken. Anandamid (N-Arachidonoylethanolamine, AEA) ist am meisten gekennzeichnet Endocannabinoid und in vielen Geweben und Bio-Flüssigkeiten einschließlich Blutplasma und des zentralen Nervensystems erkannt wurde. Die NAEs Endocannabinoid-wie Oleoylethanolamide (OEA) und Palmitoylethanolamide (PEA) werden beschrieben, wie Entourage Verbindungen, weil sie illegale ähnliche physiologische Effekte, AEA aber wenig oder gar keine Affinität für Cannabinoidrezeptoren haben. Wie Entourage Verbindungen, können Ebenen diese NAEs erheblich die Wirksamkeit der AEA beeinflussen, dennoch gibt es einige Studien, die diese Verbindungen in Bio-Flüssigkeiten zu messen. Hier beschreiben wir eine schnelle, hoch sensible, spezifische und hoch reproduzierbare ultra-high-Performance liquid Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-MS/MS) Methode für die Analyse von AEA, OEA und PEA im menschlichen Bio-Flüssigkeiten einschließlich Plasma, Serum, Muttermilch und amniotische Flüssigkeit. Diese validierte Methode mit deuterated (AEA-d(8), OEA-d(2) und PEA-d(4)) interne Standards, stellt eine Verbesserung gegenüber der vorherigen Analysen hinsichtlich der Laufzeit (4 min), Begrenzung der Erkennung (0,9 Fmol auf Spalte für AEA und PHENYLETHYLAMIN) und 4,4 Fmol auf Spalte für OEA, Präzision (relativen Standardabweichungen der Peakflächen: 3,1 % (AEA), 2,9 % (OEA) und 5,4 % (PEA) für 133 Fmol auf Spalte) und Genauigkeit (95,1-104,9 %). Die Empfindlichkeit und Genauigkeit der hier beschriebenen validierte Methode legt nahe, dass diese Methode eignet sich für die Analyse der AEA, OEA und PEA in klinischen Proben und für die Untersuchung von Bio-Matrizen mit begrenzte Mengen an NAEs genutzt werden kann.
Zuordnungen Zwischen Funktionelle Polymorphismen in Antioxidans Verteidigung Genen Und Harnwege Oxidativen Betonen Biomarker in Gesunde Und Prämenopausalen Frauen
Funktionelle Polymorphismen in endogenen antioxidativen Abwehr Genen Mangan-Superoxiddismutase (MnSOD), Katalase (CAT) und Glutathion-Peroxidase (GPX-1) wurden mit Krebsrisiko an mehreren Standorten verbunden. Obwohl angenommen wird, dass diese Varianten Germline Krankheitsrisikos auswirken, durch die Veränderung des Wirtes Fähigkeit, erbgutverändernd reaktive Sauerstoffspezies zu entgiften, haben nur sehr wenige Studien direkt diese Hypothese untersucht. Konzentrationen von 8-Isoprostane-F2α (8-Iso-PGF2α) und 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-OxoxdG)-sensible Indikatoren für Lipidperoxidation und DNA-Oxidation, bzw.-im 24-h-Urinproben von gesunden, 93 prämenopausalen Frauen eine diätetische Intervention Studie gemessen wurden. Darüber hinaus wurde DNA aus dem Blut für die Genotypisierung von MnSOD Val16Ala, CAT-262 C extrahiert > T, und GPX1 Pro198Leu Genotypen mit Taqman Assay. Obwohl geometrisches Mittel Konzentrationen von 8-iso-PGF2(α) und 8-OxoxdG über mehrere Studie Merkmale wie Rasse, Bildungsstand, Body-mass-Index und Antioxidans-Serumspiegel variiert, gab es kaum Anzeichen, dass diese Biomarker in jeder der untersuchten Genotypen unterschieden. Zusammenfassend lässt sich sagen werden funktionelle Polymorphismen in endogenen antioxidativen Abwehr Genen nicht stark verbunden mit systemischen oxidativen Stress in junge, gesunde Frauen werden angezeigt.
