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Articles by Patricia Yotnda in JoVE
JoVE General
세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험
Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine
여기서 우리는 문화의 hypoxic 상태를 평가하는 세포 문화와 간단한 테스트에 hypoxia를 유발하는 간단한 방법을 제안합니다.
JoVE Clinical and Translational Medicine
암의 생산 및 반응 산소 종의 감지 (ROS)
Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine
여기 우리는 세포의 반응 산소 종의 존재를 테스트하고 평가하는 간단한 방법을 제안합니다.
Other articles by Patricia Yotnda on PubMed
Bilamellar 양이온 리 기존 체액 성 면역 반응에서 Adenovectors를 보호 합니다
Adenoviral 벡터 유전자 치료에 널리 사용 되었습니다 하지만 그들은 극적으로 변환 후 reinjection의 수준을 감소 체액 면역 반응의 존재와 콕 사키 아 데 노 바이러스 수용 체 (자동차) 등 적절 한 수용 체를 표현 하는 대상 셀에 대 한 그들의 요구에 의해 제한 됩니다. 두 한계를 극복 하기 위해 우리는 adenovectors bilamellar DOTAP:chol 리를 사용 하 여 캡슐화. 전자 micrography (EM)이이 리 달리 내성 세포의 자동차 독립적인 adenovector 변환 수 있도록 하는 벡터를 캡슐화 효율적으로 보여주었다. DOTAP:chol-캡슐화 된 adenovectors 인코딩 LacZ 또는 알파 (1)-antitrypsin 억제제 (AAT) 되었고 또한 기능적으로 ex vivo 저항 vivo에서 자주 다른 시스템과 달리 인간의 안티 adenoviral 항 체의 중화 효과. 따라서, bilamellar DOTAP:chol 리 adenovectors는 대상 세포 부족 adenoviral 수용 체 또는는 받는 이미가지고 또는 readministered 벡터를 비활성화할 것 그렇지 않으면 중화 항 체 응답을 개발 하 고 사용 하 여 응용 프로그램에 유용할 수 있습니다.
CD40 리간드의 유전자 변형 식 CD40(+) 및 CD40(-) Plasmacytoma 세포에 대 한 in Vivo Antitumor 면역 응답을 생성합니다
종양 관련 항 원 여러 myeloma (MM)에서 확인 한 때문에 immunotherapy 질병에 대 한 추가적인 치료 양식 적임을 제공할 수 있습니다. CD40 리간드 (CD40L) MM 셀 proximate의 식을 그들의 CD40 수용 체를 통해 활성화 하 여 또는 전문 항 원 제시 세포 (Apc) 수 지 고 종양 관련 항 원 제시의 채용에 의해 자기 항 원 제시 그들의 용량을 증가 하 여이 목적에 봉사 수 있습니다. 이러한 가능성을 구분 하 고 인간의 CD40(-) myeloma이 이렇게 응답할 수 있는지 여부를 예측, 우리는 3 murine plasmacytoma 셀 라인, 2 (MPC-11 및 S107) 검사 CD40 분자와 1 (X-24) 같은 표현 부족 한 표현. Syngeneic BALB/CBYJ 마우스 subcutaneously CL7.1 섬유 아 세포, retrovirally는 mCD40L 또는 네오 유전자를 표현 하는 불리고 섞인 종양 세포 주사 했다. 모든 3 plasmacytoma 셀 라인, CL7.1/Mcd40l와 coinjection 로컬 종양 성장 제어에 비해 크게 감소. 이 효과 생쥐 종양 및 CL7.1/mCD40L 접종 종양와 이후의 과제에 내성을 했다 때문에 CD8(+) 또는 CD4(+) 세포 고갈 된 경우 종양 성장 저해 폐지는 조직의 antitumor 면역 반응에 의해 중재 됩니다. 식 cd40l의 준 CD40(+) 하 고 CD40(-) 종양에서 동등한 보호 유전자 변형 CD40L 어느 종양에서 costimulatory 분자를 최대 조절 실패 때문에 cd40l의 보호 효과 아마 plasmacytoma 세포의 CD40 활성화가 아닌 전문 Apcs의 채용/정품 인증에서 확인 되었습니다. 이 개념의 추가 지원으로 CL7.1와 CD40L apoptotic plasmacytoma 셀이이 종양에서 함께 주입 했다 쥐 보호도 잘 했다를 찾았습니다. 따라서, 유전자 변형 CD40L 식 CD40(+) 또는 CD40(-) 종양에 대 한 antimyeloma 면역 반응을 생성 될 수 있습니다 및 인간에서 myeloma의 두 형식에 대 한 치료 적 가치가 있을 수 있습니다.
Chimeric 아 데 노 바이러스 벡터의 사용 BMP2 생산과 골 형성을 향상 시킵니다
재조합 adenoviral 벡터 다양 한 근 골격 계 결함의 치료에 대 한 가능성으로가지고 있고 이러한 유전자 치료 시스템 정형 외과에서 최근 연구 초점 되었습니다. 연구 보고 여기에서 두 개의 서로 다른 아 데 노 바이러스 벡터 transduce 인간의 골 수 중간 엽 줄기 세포 (MSCs hBM) 그리고 vivo에서 골 형성을 유도 하는 능력에 대 한 비교 되어 있다. 벡터 구성 표준 중 아 데 노 바이러스 입력 5 (Ad5) 벡터 또는 아 데 노 바이러스를 포함 하는 chimeric 아 데 노 바이러스 type 5 벡터 입력 35 섬유 (Ad5F35)는 최근 다른 셀룰러 tropism을 수 여 증명 되었습니다, 한 인코딩 인간의 완전 한 cDNA 뼈 전체적 2 (BMP2). 연구 또한 향상 된 녹색 형광 단백질 (GFP)를 사용 하 여 이러한 벡터의 변환 효율성 비교를 실시 했다. hBM-MSCs Ad5F35 벡터와 불리고 불리고 Ad5 벡터와 그 보다 더 높은 수준의 transgene 식 했다. 결과 또한 hBM MSCs 콕 사키 아 데 노 바이러스 수용 체 (자동차) ad5의 세포 흡착에 대 한 책임이 부족을 보여줍니다. 따라서 데이터 Ad5 바이러스 흡착 hBM Mscs를 비효율적입니다 것이 좋습니다. Ad5BMP2 또는 Ad5F35BMP2 불리고 hBM MSCs 또한 in vivo heterotopic 뼈 형성 분석 결과에 비교 했다. Mineralized 뼈 radiologically Ad5F35BMP2 불리고 hBM Mscs를 받은 근육에만 발견 되었다. 요약 하자면, ad5f35bmp2는 hBM MSCs 향상 된 골 형성 생체 조건에 선도 transduce 효율적으로 수 있습니다.
Traumatically 부상된 쥐 뇌에서 도우미 종속 Adenoviral 벡터의 접종에 염증 반응을 감소
외상 성 뇌 부상 (TBI)는 원칙적으로 치료 유전자와 시의 적절 한 개입에 의해 막힐 수 지연된 신경 적자 발생. 그러나, TBI와 뇌를 유전자 이동에 대 한 적절 한 벡터 개발 유지. 1 세대 adenoviruses (fgAd)는 일반적으로 이러한 조직에 유전자 이동의 그들의 높은 효율에도 불구 하 고 머리 속에 주사 하는 경우 염증 성 및 독성 효과와 연결 합니다. 저자 도우미 종속 adenoviruses (hdAd)를 사용 하 여 traumatically 부상된 쥐 뇌에서 덜 immunogenic 유전자 전송 프로토콜을 설정할 수 있는지 확인 하려고이 연구에서는 소설 adenoviral 바이러스 코딩 시퀀스의 전체 삭제를 생성 합니다. 그들의 결과 보여 transgene 식 intrahippocampally 주사 Hdad에서 fgAd 중재 유전자 발현의 훨씬 짧은 기간 달리 TBI, 후 최소 2 개월 동안 유지 관리 됩니다. 만 Hdad의 접종 후 proinflammatory IL 1beta 및 TNF-알파의 최소한의 분 비는. 또한, hdAd 중재 유전자 발현 microglial 확산, astrocytic 활성화 및 macrophage 침투 fgAd 주사 두뇌에서 관찰 된 것 보다 적은와 연관 되었다. PBS 주입에 비해 hdAd 접종 후 추가 조직 손실이 했다. 안티 adenoviral 및 중화 항 체는 Hdad의 뇌 접종 후 혈 청에서 발견 됐다, 하지만 그들은 transgene 식에 영향을 표시 되지 않았다. 결과 Hdad는 기존의 adenoviral 벡터 보다 적은 immunogenic 벡터 제공 향상 된 차량 traumatically 부상된 두뇌에 장기적인 치료 transgene 전송에 대 한 좋습니다.
복제 무능 Polyepitope 아 데 노 바이러스 백신 접종 후 치료 T 세포에 대 한 응답 Subdominant 종양 관련 바이러스 Oncogene 유도
다양 한 EBV 연관 된 악성 종양에서 표현 하는 EBV 인코딩 잠재 막 단백질 (LMP1, LMP2) CTL에 기초를 둔 치료에 대 한 잠재적인 대상으로 제안 되었습니다. 그러나, LMP 특정 CTL의 전조 주파수는 일반적으로 낮은 고 immunotherapy이 항이 원에 따라 종종 가난한 immunogenicity 금하는 그들의 잠재력에서 잠재적인 위협에 의해 훼손. 여기 여러 HLA 클래스 나 제한 CTL epitopes lmp1와는 polyepitope로 LMP2 인코딩합니다 복제 무능 adenoviral 백신을 개발 했습니다. Polyepitope 백신이 예방 접종 일관 HLA A2/K(b) 쥐 비보 전 둘 다에 의해 쉽게 감지 될 수 있는 강한 LMP 특정 CTL 응답을 생성 하 고 vivo에서 T 세포 분석 실험. 또한, LMP 항 원에 대 한 인간의 CTL 응답이 재조합 polyepitope 벡터와 자극 후 급속 하 게 확장 될 수 있다. 이러한 T LMP1 또는 LMP2 CTL epitopes로 감 응 헌 대상 셀의 셀 표시 강한 lysis 확장. 더 중요 한 것은이 adenoviral 백신 HLA A2/K(b) 쥐에서 종양 LMP1 표현 파생물을 반대 하도 성공적으로 사용 되었다. 이러한 연구는 복제 무능 아 데 노 바이러스 polyepitope 백신은 여러 LMP CTL epitopes를 향해 이동 보호 CTL 반응의 유도 위한 훌륭한 도구 제한 일반적인 HLA 클래스를 통해 내가 대립 다른 소수 민족에 널리 EBV 연관 된 악성 종양 발병 하는 보여 줍니다.
조건에 따라 복제 유능한 Adenoviral Plasmids의 Antitumor 활동의 자주 향상
많은 인간의 종양 p53 기능 결핍이 있다. 다 수의 연구는 아 데 노 한 조건에 따라 복제 유능한 바이러스 (Ad dl1520)에서 성장 하 고 살려주는 정상 조직의 종양 세포를 lyse 그를 사용 하 여이 현상의 장점을 촬영 했다. 그러나, 성공 부분적으로 종양 세포의 충분히 높은 비율에 도달에 어려움으로 인해 제한 되었습니다. 기존 또는 면역 반응 개발 접근 방법의 효능을 바이러스 성 단백질 추가 감소 향해 이동 합니다. Liposome 캡슐화 된 조건에 따라 복제 유능한 플라스 dl1520 바이러스를 기반으로 개발 했습니다. 부모 바이러스 처럼이 플라스 미드는 p53-결함 없는 p53 와일드 타입 종양 세포만 transfection에 따라 전염 성 입자를 생성 하지만 부모 바이러스와는 달리 자동차 음수가 종양 세포를 감염 시킬 수 있다. 전염 성이 플라스 미드의 antitumor 효능 있는 그것은 활성 후 피하 종양에 대 한 로컬 및 정 맥 주사 관리 및 퍼뜨리는 악성 종양에 대 한 다음 정 맥 관리 xenografted 인간의 종양 생쥐에서 시연 했다. 활동을 체계적으로, 중화 항 체의 존재도 유지 되었다. 이러한 liposomally 캡슐화 된 조건에 따라 복제 유능한 플라스 미드의 설정에서 특히 기존의 바이러스 성 입자를 사용 하 여 보완 수 adenoviral의 간 글귀는 벡터는 바람직한 또는 체액 성 면역 반응에서 문제가 있는 억제 효과가 있습니다.
세포 독성 T 세포에 의해 Adenoviral 벡터의 대상된 배달
벡터를 여러 다른 조직 사이트에 전이 된 종양 세포의 효과적인 대상으로 유전자 치료에 대 한 주요 도전 남아 있습니다. 종양 관련 cytotoxic T 세포 (Ctl) 표시 되었습니다 인간 및 동물 모델에서 종양 세포를 조직 장벽과 트래픽을 교차 수 있습니다. 그러나 악성 종양을 제거 하는 그들의 용량 종양 면역 회피 전략에 의해 제한 되었습니다. 우리는 지금 스스로 인간의 Ctl 출시 다음과 같은 그들의 특정 항 원 수용 체의 참여와 이러한 벡터 transduce 효과적으로 되며 종양 목표물을 파괴 하는 치료 벡터를 수정할 수 있습니다 보여줄 엡 스타인-바 바이러스 중재 악성 종양의 모델을 사용. 셀 활성화 종속 CD40 리간드 (CD40L) 발기인의 통제 adenoviral E1 유전자에 대 한 유전자 변형 된 EBV 특정 Ctl을 생성 했습니다. E1 불충분 한 adenoviral 벡터와 변환, 다음 이러한 Ctl 생산 HLA 일치 EBV 표현 대상에 있지만 중요 한 조직 적합성 복합물에 노출 (MHC)에 노출 되 면 전염 성 바이러스-일치 하지 않는 또는 그렇지 않으면 없는 셀. 이 방법은 로컬로 액세스할 수 있는 거시적인 종양 뿐만 아니라 제공 oncolytic/치료 벡터의 수단으로 현재는 사건 뿐만 아니라 adenoviral 벡터의 큰 복용량의 체계적 관리와 관련 된 위험을 피하 면 서 전이성 질병 전파를 제공.
T-세포 치료 유도할 수 있는 Caspase 9 안전 스위치
악성 종양에 대 한 치료로 입양 T-세포 치료의 효능 생긴된 세포의 유전자 조작에 의해 향상 될 수 있습니다. 그러나, 벡터/transgene 통합 때문 금하는 이벤트 및 독성 때문에 생긴된 세포 스스로 열정을 단련 했습니다. Vivo에서 탈 선 세포를 제거 하는 안전 하 고 효율적인 수단 이러한 우려를 개량 것 이다. 우리는 "안전 스위치" 표현할 수 있는 안정적이 고 효율적으로 인간 T 세포에서 표현 형, 함수, 또는 항 원 특이성을 방해 하지 않고 기술. 이 시 약은 수정된 된 인간의 caspase 9 인간의 FK506 의무적인 단백질 (FKBP) 작은 분자 약 제를 사용 하 여 조건부 dimerization 수 있도록 융합을 기반으로 합니다. 합성 dimerizer 약물의 단일 10 nM 복용량 높은 transgene 식 생체 외 및 생체 조건에 대 한 선택 된 transduced 셀의 99%에 apoptosis를 유도 합니다. 이 시스템에 현재 사용 가능한 자살 유전자 몇 가지 이점이 있다. 첫째, 그것은 낮은 잠재 immunogenicity 인간의 유전자 제품의 구성. 둘째, dimerizer 약물 관리 transduced T 세포의 선택적 제거 이외의 아무 효과가 있다. 셋째, 유도할 수 있는 caspase 9 antiapoptotic 분자 overexpressing T 세포의 기능을 유지 합니다. 이러한 특성 인간 T-세포 치료의 안전 기능으로 유도할 수 있는 caspase 9의 설립을 선호.
카파 PreB 수용 체의 조립 번째 대 본에 의해 인코딩된 V 카파 같은 단백질을 요구 한다
유전자 재배열에 내재 된 메커니즘의 부산물로 번째 전사 confining에 의해 각각 mRNAs 그리고 그들의 생물 학적 관련성의 번역 된 간과 수 있습니다. 여기 우리 식별, 복제 및 번째 대 본에 의해 인코딩된 인간의 Vkappa 같은 단백질의 생화학 적인 특성을 보고 합니다. 이 대리 단백질 B 셀 progenitors와 선구자 카파 같은 항 원 수용 체를 표면에 면역 글로불린 뮤 무거운 체인 조립. 이러한 연구 결과 번째 전사 무의미 하다는 개념을 지원 하 고 진 핵 유전자 사용법과 식에 유연성을 강조 합니다. 또한, 현재의 연구는 B 림프 구 성숙 홍보 콘서트에서 작동 하도록 제안 하는 대리 람다와 카파 수용의 공존을 확인 합니다.
인간의 종양 관련 세포 독성 T 세포 Hypoxic 환경에서 작동 하도록 설계 하 고
Hypoxia 많은 종양에서 발생 하 고 라디오 및 화학 요법의 효과 감소 시킨다. 또한 hypoxia 등 interleukin-2 (일리노이-2)와 인터페론 감마는 생존 cytokines의 T 림프 구 생산 및 이들이 세포의 증식, 종양 면역 응답을 방해 한다. 우리는 양방향 hypoxia을 유도할 수 있는 반응 (HRE)에서 파생 된 요소 인간의 혈관 내 피 성장 인자, hIL 2 유전자 마커 유전자를 드라이브 하는 인코딩 lentiviral 벡터 생성. 보여 종양 관련 T 세포 산소 긴장은 체 외에서 낮은 때 벡터 upregulate hIL 2 식을이 수정 그리고 vivo에서 인간 B 세포 림프 종 모델을 사용 했습니다. 이 효과의 결과 O(2) 농도 낮은 1%에도 이펙터 기능을 유지 하는 동안 T-세포 생존 및 증식을 증가 하는 것. Transduced 세포의 표현 형 종양으로 마이그레이션할 자신의 능력으로 변경, 되지 않습니다. HRE IL 2 수정 cytotoxic T 세포 (Ctl)을 빠르게 생산 하 고 더 부모의 Ctl 보다 종양 회귀를 완료 하 고 전반적인 생존을 향상. Hypoxia 내 T 세포 따라서 가치 hypoxia의 어떤 영역에이 치료 전략에 대 한 저항에 대 한 그렇지 않으면 계정 수 인간 종양의 치료에 있을 수 있습니다.
인코딩 C 형 간염 바이러스 단백질 재조합의 Adenoviral 구조를 섬유 수정 강력한 HCV 관련 T의 세포 응답을 유도
C 형 간염 바이러스 (HCV)-특정 cytotoxic T 세포 (Ctl) HCV 클리어런스에 중요 한 역할을 합니다. HCV에 감염 된 기증자의 말 초 혈액에서 HCV 관련 T(CD8)의 주파수가 매우 낮은 HCV 항 원 제시 세포의 감염에 대 한 재배 수 없습니다, 그리고 광범위 한 HCV T(CD8)를 감지 하 고 어려운 주변에서 특이성 혈액 단 셀 (PBMCs). 우리는 효율적으로 다시 활성화 하 고, Pbmcs의 HCV에 감염 된 기증자 로부터 HCV 특정 Ctl 확장 재조합 adenoviral 시스템을 개발 했습니다. 복제 무능 adenoviruses 개별 HCV 단백질 (코어 및 n s 3) 표현 제작 및 HCV에 감염 된 기증자 로부터 PBMCs HCV 특정 CTL 인구 자극 이러한 재조합 adeno HCV 구문으로 불리고 있었다. T 세포 adeno HCV 문화 HCV 관련 IFN-감마 및 TNF-알파의 적 정량 생산 되었고, HCV 펩 티 드와 함께 효율적으로 lysed 대상 셀 펄스 자극된에서 확장. 이러한 구문은 T(CD8) 결정 계층 구조를 유지 하면서 여러 HCV 펩 티 드에 대 한 감독을 자극 수 있습니다. 이 이렇게 따라서 일부 펩타이드 기반 백신 전략 Ctl의 선택적 확장의 단점을 극복 했다. 이러한 연구 결과 Pbmcs의 HCV에 감염 된 환자에서 HCV 특정 Ctl의 확장에 대 한 효과적인 접근 방식을 제공 하 고 immunotherapeutic/백신 개발을 위한 잠재력을가지고.
Hypoxic 종양과 면역 세포 및 암 치료에 미치는 영향
비정상적인 감소 또는 세포와 조직에 산소 공급의 부족 hypoxia를 라고 합니다. 이 조건은 일반적으로 류 마티스 관절염과 단단한 암에도 동맥 경화 증 등 각종 질병에서 볼 수 있다. 조사 및 임상 연구 hypoxic 암은 매우 공격적, 표준 요법 (화학 요법과 방사선 치료)를 방지 하 고 따라서 근절 하기 위해 매우 어려운. Hypoxia 종양 및 다양 한 경로 통해 면역 세포에 영향을 줍니다. 이 검토는 안티 종양 반응, 현재 치료법의 한계 및 hypoxic 악성 종양에 대 한 개발 된 잠재적인 솔루션에서 핵심적인 역할을 하는 면역 세포에 저 산소 증의 가장 일반적인 효과 요약 합니다.
KCa1.1 칼륨 채널 키 Proinflammatory과 류 마티스 관절염에서 Fibroblast와 같은 Synoviocytes의 침략 적 속성을 조절
섬유 아 세포와 같은 synoviocytes (FLS) 류 마티스 관절염 (RA)의 병 인에 중요 한 역할을 한다. 칼륨 채널 많은 셀 함수에서 규제 역할을 있다. 우리 FLS RA (RA FLS)을 가진 환자에서 분리 된 원형질 막에 표현 된 주요 칼륨 채널으로 칼슘 및 전압 개폐 KCa1.1 채널 (BK, 맥시-K, Slo1, KCNMA1)를 발견 했다. 우리 더 쇼는이 채널을 차단 세포의 칼슘 항상성 perturbs과 확산, VEGF, IL-8, 그리고 프로 MMP 2 및 마이그레이션의 생산과 RA FLS의 침략을 억제. 우리의 연구 결과 RA FLS 함수에 KCa1.1 채널의 규제 역할을 표시 하 고 라스의 치료에 대 한 잠재적인 대상으로이 채널을 제안
