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In JoVE (3)
- La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando
- La interacción hidrofóbica automatizada cromatografía en columna de selección para uso en la purificación de proteínas
- La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica
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Articles by Patrick J. M. Murphy in JoVE
JoVE General
La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando
1College of Nursing, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University, 2College of Science and Engineering, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University, 3School of Medicine, University of Washington
Un
JoVE General
La interacción hidrofóbica automatizada cromatografía en columna de selección para uso en la purificación de proteínas
1College of Nursing, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University, 2College of Science and Engineering, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University
Un método automático para la identificación adecuados cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) medios para ser utilizados en el proceso de purificación de proteínas se presenta. El método utiliza un sistema de líquido de presión media, incluyendo cromatografía de buffer blending automatizado, la inyección de la muestra dinámica de bucle, la selección secuencial de columna, el análisis de múltiples longitudes de onda, y la recolección dividida fracción del eluato.
JoVE Bioengineering
La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica
1College of Nursing, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University, 2College of Science and Engineering, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University
A modo de aprovechar microscopio de fuerza atómica (AFM) el método para la visualización de ADN plásmido, proteínas citoplasmáticas, y los complejos ADN-proteína se describe. El método incluye los enfoques alternativos para la preparación de muestras para el AFM imágenes después de la manipulación bioquímica. ADN que contiene regiones específicas que interactúan las proteínas se observan en las condiciones de amortiguación casi fisiológico.
Other articles by Patrick J. M. Murphy on PubMed
Hsp90 Se Requiere Para Enlace De Hemo Y Activación De La Sintasa De óxido Nítrico Apo-neuronal: Generación De Oxidante Mediada Por Geldanamicina Está Relacionado Con Cualquier Acción De Hsp90
Se establece que neuronal que no sintasa (nNOS) se asocia con la chaperona hsp90, aunque no se ha definido el papel funcional de esta interacción. Hemos descubierto que la inhibición de hsp90 por radicicol o geldanamicina casi impide la activación mediada por hemo y montaje de hemo-deficiente apo-nNOS en células de los insectos. Este efecto es dependiente de la concentración con más del 75% inhibición alcanzada en 20 microm radicicol. El complejo ferroso de carbonilo de nNOS no se forma cuando se inhibe la hsp90, indicando que se evita la inserción de hemo funcional. Proponemos que la maquinaria de chaperona hsp90 basadas facilita la entrada de hemo funcional en apo-nNOS por la abertura de la hendidura de hemo-enlace hidrofóbica de la proteína. Previamente, se ha informado que la hsp90 inhibidor geldanamicina desacopla endotelial actividad NOS y aumenta la producción de O(2)() dependiente NOS endotelial. Geldanamicina es una benzoquinona ansamicina y mostramos aquí que causa la producción oxidante de nNOS en células de los insectos, así como con la proteína purificada. En una concentración de 20 microm, geldanamicina causa un aumento de tres veces en la oxidación de NADPH y formación de peróxido de hidrógeno de nNOS purificada, mientras que los no-quinona hsp90 inhibidor radicicol no tuvo ningún efecto. Así, consistente con la propensión conocida de otros Quiñones, geldanamicina directamente redox ciclos con nNOS por un proceso independiente de cualquier acción en hsp90, advirtiendo contra la utilización de la geldanamicina como un inhibidor específico de hsp90 en sistemas redox activos.
Las Mutaciones En Las Posiciones 547-553 De Receptores De Glucocorticoides Rata Revelan Que Hsp90 Vinculante Requiere La Presencia, Pero No Define La Composición, De Una Secuencia De ácido Amino-siete En El Amino Terminal Del Dominio Ligando
Receptores de glucocorticoides (GRs) deben heterocomplex con hsp90 tener un esteroide abierto vinculante la hendidura que se puede acceder por esteroides. Nos informan que una secuencia de ácido amino-siete (547-553 de rata GR) superpuestas en el extremo amino-terminal del dominio de unión del ligando se requiere unión hsp90 GR. Ahora hemos realizado mutagénesis de saturación de esta secuencia, que parece ser parte de la superficie donde el ligando hendidura se fusiona con la superficie del dominio de unión de ligando. Ninguna mutación de punto única provoca cambios significativos en cualquiera de una variedad de propiedades bioquímicas y biológicas además de hsp90 vinculante. Una mutación triple (P548A/T549A/V551A) aumenta por > cien veces la concentración de esteroide necesaria para inducir la mitad-máximo sin afectar el nivel de respuesta máxima de inducción o coactivator. Curiosamente, este triple mutante muestra atar reducido de esteroide y hsp90 en células enteras, pero posee afinidad de tipo salvaje para hsp90 esteroides y normal vinculante capacidad en condiciones libres de células. Este fenotipo de un cambio dramático en la respuesta a la dosis de transactivación se espera de un aumento en la tasa de desmontaje del triple mutante GR.hsp90 heterocomplex en la célula. Mutación de toda la región siete-amino ácida a CAAAAAC mantiene la presencia de una formación crítica de estructura y heterocomplex alfa-helicoidal con hsp90 pero elimina esteroide vinculante y activación transcripcional, desconectando así hsp90 vinculante de apertura del ligando la hendidura y esteroide vinculante.
Encuadernación De Inmunofilinas Hsp90 Asociada a Dineína Citoplasmática: Directa Evidencia Vinculante E in Vivo Que El Dominio De La Isomerasa De Peptidylprolyl Es Un Dominio De La Interacción De Dineína
FKBP52 es un esteroide Induccin asociado a receptor que une a través de un dominio de (TPR) repetición de tetratricopeptide a hsp90. FKBP52 también se ha demostrado para interactuar ya sea directamente o indirectamente mediante su dominio de la isomerasa (PPIase) del peptidylprolyl con dineína citoplasmática, una proteína motora involucrados en el transporte retrógrado de vesículas hacia el núcleo. El rol funcional para el dominio PPIase en movimiento de receptor fue demostrado mostrando que inhibe la expresión del fragmento PPIase dominio de FKBP52 en células 3T3 translocación nuclear dexametasona dependiente de una quimera de receptor verde fluorescente proteína-glucocorticoide. Aquí, demostramos que dineína citoplasmática es co-immunoadsorbed con dos otros TPR dominio proteínas que se unen hsp90 (la ciclofilina CyP-40 y la proteína fosfatasa PP5). Ambas proteínas poseen dominios homologos de PPIase y co-immunoadsorption de dineína citoplasmática con cada uno está bloqueada por el fragmento de dominio PPIase de FKBP52. Utilizando proteínas purificadas, mostramos que el fragmento de dominio PPIase, FKBP52 y PP5 enlazar directamente a la cadena intermedia de dineína citoplasmática. PP5 colocalizes con dineína citoplasmática y microtúbulos y expresión del fragmento PPIase dominio de FKBP52 en células 3T3 interrumpe su localización citoesqueleto. Concluimos que los dominios PPIase de las inmunofilinas hsp90 vinculante interactuarán directamente con dineína citoplasmática y que esta interacción con la proteína motora es responsable de la localización microtubular de PP5 in vivo.
Visualización Y Mecanismo De Montaje De Un Receptor De Glucocorticoides.Complejo De HSP70 Que Está Preparado Para La Posterior Apertura De Hsp90-dependiente De La Hendidura Del Esteroide Vinculante
Un sistema mínimo de cinco proteínas hsp90, hsp70, Hop, hsp40 y p23, monta de glucocorticoides (GR) del receptor .hsp90 heterocomplejos y provoca la apertura simultánea de la encuadernación esteroide hendidos para acceso por esteroides. El primer paso en la Asamblea es el dependiente de ATP y hsp40 (YDJ-1)-formación dependiente de un complejo GR.hsp70 que prepara el receptor para la posterior activación dependiente de ATP por hsp90, salto y p23. Este estudio se centra en tres aspectos de la reacción de cebado de GR con hsp70. En primer lugar, nos hemos visualizado los complejos GR.hsp70 preparados por microscopía de fuerza atómica, y encontramos la más común estequiometría 1:1, con algunos complejos de un tamaño de aproximadamente 1:2 y unos complejos de mayor tamaño. En segundo lugar, en un estudio reciente de cebado del receptor de progesterona, fue demostrado que hsp40 se une en primer lugar, lleva a la noción que se dirige a hsp70 al receptor. Aquí mostramos que hsp40 no realiza tal función de focalización en cebado el tercer GR., nos centramos en un segmento corto del amino-terminal del dominio de unión de ligando que se requiere para el montaje de heterocomplex de GR.hsp90. Utilizando dos glutatión S-transferasa (GST) / ligando vinculante fusiones de dominio con (GST/520 C) y sin (GST/554 C) hsp90 vinculante y actividad obligatoria esteroide, demostramos que el paso de cebado con hsp70 ocurre con GST/554 C, y es el paso posterior montaje con hsp90 que es defectuoso.
La Hsp90 Cochaperone P23 Es El Componente Limitante Del Sistema Multiproteínas Chaperona Hsp90/hsp70-basado En Vivo Donde Actúa Para Estabilizar La Proteína Del Cliente: Hsp90 Complejo
Una variedad de proteínas forma heterocomplejos con y son reguladas por el calor choque Proteína chaperona hsp90 de señalización. Estos complejos están formados por una maquinaria multiproteínas, incluyendo hsp90 y hsp70 como componentes esenciales y abundantes y Hop, hsp40 y p23 como cochaperones no esenciales que están presentes en mucho menor abundancia en las células. Sobreexpresión de proteínas de señalización puede desbordar la capacidad de esta maquinaria para montar correctamente heterocomplejos con hsp90. Aquí, demostramos que el componente limitante de esta maquinaria de montaje in vitro en reticulocitos lisado e in vivo en células Sf9 es p23. Sólo una fracción de receptores de glucocorticoides (GR) sobreexpresa en células Sf9 están en heterocomplex con hsp90 y tienen actividad esteroide, con la mayoría de los receptores presentes como agregados GR tanto insolubles y citosólicas. Coexpresión de p23 con el GR aumenta la proporción de receptores citosólicas que se encuentran en heterocomplejos de GR.hsp90 estable con actividad obligatoria esteroide, una actividad estrictamente hsp90-dependiente de la coexpresión de GR. de p23 elimina el insoluble GR agregados y cambia el receptor citosólico de agregados muy grandes sin actividad obligatoria esteroide a aproximadamente 600-kDa heterocomplejos con actividad obligatoria esteroide. Estos datos nos llevan a concluir que P23 actúa en vivo para estabilizar hsp90 Unión a proteínas del cliente.
Pifithrin-alfa Inhibe P53 Señalización Tras La Interacción De La Proteína Supresora De Tumores Con Hsp90 Y Su Translocación Nuclear
Pifithrin-alfa (PFTalpha) fue pensada originalmente para ser un inhibidor específico de la señalización por la proteína p53 supresora de tumor. Sin embargo, el laboratorio que descubrió pifithrin informó recientemente que el compuesto también inhibe el choque térmico y glucocorticoide señalización del receptor (GR), y sugirieron que PFTalpha dirige un factor común a todos tres señal vías de transducción, tales como la maquinaria de chaperona hsp90/hsp70-base de (Komarova, E. A., Neznanov, N., Komarov, P. G., Chernov, M. V., Wang, K. y Goudkov, A. V. (2003) J. Biol. Chem. 27815465-15468). Porque es importante para el estudio mecánico de esta maquinaria para identificar inhibidores únicos de acción de acompañante, hemos examinado el efecto de PFTalpha en la activación transcripcional, hsp90 heterocomplex Asamblea y translocación nuclear dependiente de hsp90 para p53 y el GR. A concentraciones donde PFTalpha bloquea la inducción mediada por p53, p21/Waf-1 en células de riñón embrionario humano, no observamos ninguna inhibición de inducción GR-mediada de reportero en células LMCAT cloranfenicol acetil transferasa. PFTalpha, sin embargo, provocaron un cambio de izquierda en la curva de respuesta de dosis de dexametasona incrementando la concentración intracelular de la dexametasona, aparentemente compitiendo por emanación de dexametasona de la célula. La Asamblea de p53 o GR heterocomplejos con hsp90 e inmunofilinas no fue afectada por PFTalpha in vivo o in vitro y no afectó la translocación nuclear de cualquier factor de transcripción. Así, nos concluir que PFTalpha no inhibe GR-mediada de la inducción o la función de la maquinaria de acompañante y, como se pensaba, que puede inhibir específicamente p53 señalización actuando en un escenario después de p53 translocación al núcleo.
El Papel De Hsp90 En Activación De Hemo-dependiente De La Sintasa De óxido Nítrico Apo-neuronal
Como otra sintasa de óxido nítrico enzimas (CNC), la facturación de enmiendas (nNOS) neuronal y la actividad están regulados por la proteína ubicua chaperona hsp90. Hemos demostrado previamente que nNOS expresados en células Sf9 donde comienzan los niveles endógenos de hemo se activa desde el apo - a la holo-enzima por la adición de hemo exógeno al medio de cultivo, y esta activación es inhibida por el radicicol, un inhibidor específico de hsp90 (Billecke, S. S., Bender, A. T., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Lowe, E. R.Kamada, Y., Pratt, w. B. y Osawa, Y. (2002) J. Biol Chem 278, 15465-15468). En este trabajo, examinamos vinculante heme por apo-nNOS para formar la enzima activa en un sistema sin células. Mostramos que citosol de Sf9 células facilita la activación dependiente de hemo apo-nNOS promoviendo la inserción de hemo funcional en la enzima. SF9 citosol también convierte el receptor de glucocorticoides (GR) en un estado donde la hendidura ligando hidrofóbico está abierta al acceso por esteroides. Tanto heme acelulares activación de nNOS purificada y activación de actividad esteroide de la immunopurified GR son inhibidas por el tratamiento de la radicicol de células Sf9 antes de la preparación del citosol y adición de hsp90 purificada al citosol supera parcialmente esta inhibición. Aunque existe un mecanismo dependiente de hsp90 en Sf9 citosol que favorece la fijación de heme por apo-nNOS, es claramente diferente de la maquinaria que favorece la fijación esteroide por la hsp90 GR. regulación de la activación de apo-nNOS hemo es muy dinámico y requiere mayores concentraciones de radicicol para su inhibición, mientras que Unión esteroide GR es determinada por la Asamblea de heterocomplejos de GR.hsp90 estable que se forman por un mecanismo de cinco-acompañante purificado que no activa el apo-nNOS.
Papel De Chaperonas Moleculares En La Acción De Los Receptores De Esteroides
Unliganded receptores de esteroides son ensamblados en heterocomplejos con proteína de choque térmico (hsp) 90 por una maquinaria de multiproteínas chaperone. Además de enlazar los receptores en el lugar del acompañante, hsp90 se une cofactores en otros sitios que forman parte de la maquinaria de la Asamblea, así como inmunofilinas que conectan el heterocomplejos receptor-hsp90 montado a una vía de tráfico de proteínas. La hsp90- / maquinaria de chaperone basadas en hsp70 interactúa con el receptor de glucocorticoide unliganded para abrir la hendidura del esteroide vinculante para acceder a un esteroide, y la maquinaria interactúa en forma muy dinámica con el receptor liganded, transformado para facilitar su desplazamiento a lo largo de las carreteras microtubular al núcleo. En el núcleo, la maquinaria de chaperone interactúa con el receptor en complejos de regulación transcripcionales después de disociación de la hormona para liberar el receptor y terminar la activación transcripcional. Mediante la formación de heterocomplejos con hsp90, la maquinaria del acompañante estabiliza el receptor a la degradación por la vía de la ubiquitina-proteasoma de proteólisis.
Pruebas Para El Transporte De Receptor De Glucocorticoides En Microtúbulos Por Dineína
Hsp90 depende del movimiento rápido, dependiente de ligando de receptores de glucocorticoides (GR) de citoplasma al núcleo, y gran parte del sistema del movimiento ha sido definida. GR.hsp90 heterocomplejos aislados de las células contienen uno de varios inmunofilinas hsp90 vinculante que vinculan el complejo a dineína citoplasmática, un motor molecular que procesa a lo largo de pistas microtubular al núcleo. Las inmunofilinas vinculan a dynein indirectamente mediante el componente dynamitin de la dineína asociada complejo dinactina (Galigniana, M. D., Harrell, J. M., O'Hagen, H. M., divida, M. y Pratt, J. W. B. (2004) Biol Chem. 279, 22483-22489). Aunque se sabe que la hsp90 y dependiente, rápido movimiento GR requiere microtúbulos intactos, no se ha demostrado que el movimiento es dependiente de dineína. Aquí, demostramos que la sobreexpresión de dynamitin, que bloquea el movimiento saldándose el dineína motor de su carga, inhibe el movimiento dependiente de ligando de la GR al núcleo. Mostramos que nativo GR.hsp90.immnunophilin complejos contienen dynamitin, así como la dineína y que GR heterocomplejos aislaron de citosol con paclitaxel y GTP para estabilizar los microtúbulos también contienen tubulina. El sistema de movimiento completo, incluyendo el motor de la dineína complejo y tubulina, puede ser montado en condiciones libres de células por incubación pelotillas inmunes GR con paclitaxel/GTP-estabilizado citosol preparado a partir de células de GR(-) L. Se trata de la primera evidencia de que el movimiento de un esteroide receptor depende de la dineína, y es el primer aislamiento de un receptor de esteroide a todo el sistema que determina su movimiento retrógrado.
HDAC6 Regula La Acetilación De Hsp90 Y Activación De Acompañante Dependiente Del Receptor De Glucocorticoides
La proteína de choque de calor molecular chaperone 90 (Hsp90) y su accesorio cochaperones función facilitando la maduración estructural y complejo conjunto de proteínas del cliente, incluyendo receptores de hormonas esteroides y las quinasas. Mediante la promoción de la actividad y estabilidad de estas proteínas de señalización, Hsp90 ha surgido como un modulador importante en la señalización celular. Aquí, presentamos evidencia que Hsp90 acompañante actividad es regulada por acetilación reversible y controlado por la deacetilasa HDAC6. Mostramos que HDAC6 funciona como una deacetilasa Hsp90. Inactivación de HDAC6 conduce a Hsp90 hyperacetylation, su disociación de un cochaperone esencial, p23 y una pérdida de actividad de acompañante. En células de HDAC6-deficientes, maduración Hsp90 dependiente de los receptores de glucocorticoides (GR) está comprometida, dando por resultado defectuoso GR ligando, translocación nuclear y activación transcripcional. Nuestros resultados Hsp90 identifican como un objetivo de HDAC6 y sugieren la acetilación reversible como único mecanismo que regula la actividad compleja de chaperona Hsp90.
Regulación De La Dinámica De Hsp90 De Acción Sobre El Receptor De Glucocorticoides Por Acetilación/desacetilación De the Chaperone
Se sabe que la inhibición de Histona Desacetilasas (HDAC) conduce a la acetilación de la abundante Proteína chaperona hsp90. En un estudio reciente, hemos demostrado que caída de HDAC6 por una específica ARN interferente pequeño conduce a hyperacetylation de hsp90 y que el receptor de glucocorticoides (GR), una proteína hsp90 establecido de "cliente", es defectuoso en la activación de genes en células HDAC6-deficientes, ligando y translocación nuclear (Kovacs, J. J., Murphy, P. J. M., Gaillard, S., Zhao, x., Wu, J-T., Nicchitta, C. V.Toft Yoshida, M., O. D., Pratt, W. B. y Yao, T-P. (2005) PM célula 18, 601-607). Usando riñón embrionario humano salvaje-tipo y caída HDAC6 (pequeños RNA de interferencia) células expresando transitoriamente el ratón GR, mostramos aquí que las propiedades intrínsecas de la proteína del receptor sí mismo no son afectadas por la caída de HDAC6, pero el precipitación citosol tiene un marcado disminución de la capacidad para montar estable GR.hsp90 heterocomplejos y generar actividad esteroide estable en condiciones libres de células. HDAC6 precipitación citosol tiene la misma capacidad para llevar a cabo el ensamblado dinámico de heterocomplex de GR.hsp90 como salvaje-tipo citosol. Adición de hsp90 purificada al citosol precipitación HDAC6 restaura Asamblea de heterocomplex de GR.hsp90 estable al nivel del citosol de tipo salvaje. Hsp90 de citosol precipitación HDAC6 ha disminuido la afinidad de unión a ATP, y no arme estable GR.hsp90 heterocomplejos cuando es un componente de un sistema de montaje de cinco-proteína purificada. Incubación de hsp90 de precipitación de la célula con HDAC6 purificada convierte la hsp90 al comportamiento de tipo salvaje. Así, acetilación de hsp90 resultado dinámico GR.hsp90 heterocomplex montaje/desmontaje, y esto es manifiesto en la célula como un centesimal aproximadamente cambio a la derecha en la respuesta de la dosis de esteroides para la activación del gene.
