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Articles by Paul C. Letourneau in JoVE
JoVE Neuroscience
Etiquetage F-actine se termine avec des barbelés rhodamine-actine dans les cônes de croissance neuronale perméabilisées
Department of Neuroscience, University of Minnesota
Une méthode de visualiser et de quantifier la F-actine se termine barbelés dans les cônes de croissance neuronale est décrite. Après les neurones en culture sur des lamelles en verre, les cellules sont perméabilisées avec une solution contenant de la saponine. Ensuite, une courte incubation avec le tampon de la saponine contenant rhodamine-actine intègre actine fluorescente sur l'actine se termine sans barbelés.
Other articles by Paul C. Letourneau on PubMed
Régulation Temporelle De Neuropiline-1 Expression Et La Sensibilité Aux Semaphorin 3A NGF Et Les Neurones Chick NT3-sensibles Sensorielles
La molécule extracellulaire sémaphorine 3A (Sema3A) est proposé pour être un repère d'orientation négative qui participe dans la structuration de DRG axones sensoriels de la moelle épinière poussin en développement. Au cours du développement Sema3A est d'abord exprimée à travers la matière grise la moelle épinière, mais l'expression Sema3A disparaît plus tard, à partir de la corne dorsale, où les afférences cutanées de petit calibre fin. Expression Sema3A reste dans la corne ventrale, où les grands muscles afférences proprioceptives fin. Il a été proposé que les changements temporels dans la sensibilité des différentes classes de afférences sensorielles au Sema3A contribuer à le pathfinding différente de ces afférences sensorielles. Cette étude a comparé l'expression de la sous-unité du récepteur sémaphorine 3A, neuropiline-1, et la réponse effondrement des cônes de croissance à la sémaphorine 3A pour le NGF (cutanée) - et NT3 (proprioceptive)-dépendantes axones sensoriels étendus à partir d'embryons de poulet E6-E10. Cônes de croissance prolongée de E6 GHM dans un milieu contenant du NT3 exprimé neuropiline-1 et s'est effondré en réponse à Sema3A. De E7 jusqu'à E10 cônes de croissance NT3-sensibles ont exprimé des niveaux progressivement plus faibles de la neuropiline-1, et sont moins sensibles à Sema3A. D'autre part, les cônes de croissance prolongée de GHM dans un milieu contenant du NGF ont exprimé des niveaux progressivement plus élevés de la neuropiline-1 et des niveaux plus élevés de réponse à l'effondrement Sema3A cours de la période de E6-E10. Ainsi, la structuration du développement de terminaux sensoriels de la moelle épinière de poulet peuvent provenir de changements dans l'expression à la fois dans les changements Sema3A développement moelle épinière et d'accompagnement dans l'expression neuronale de la sous-unité du récepteur Sema3A, neuropiline-1.
Transient Activité De La PKA Est Requis Pour L'initiation, Mais Pas De Maintenance Du BDNF à Médiation Protection De L'oxyde Nitrique Induite Par La Croissance De Cône Réduire
Axones en croissance au cours du développement sont guidés vers leurs cibles par l'activité de leurs cônes de croissance. Cônes de croissance d'intégrer des signaux de guidage positifs et négatifs pour décider de la direction dans laquelle s'étendent. Nous avons démontré précédemment que le traitement des cellules embryonnaires ganglionnaires de la rétine avec le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) protège leurs cônes de croissance de l'effondrement induites par l'oxyde nitrique (NO). BDNF stabilise la croissance des filaments d'actine-cône contre NO induite par la dépolymérisation. Dans la présente étude, nous avons examiné le mécanisme de signalisation impliquées dans la protection médiée par le BDNF. Nous avons trouvé que le BDNF provoque une activation transitoire de la protéine kinase A (PKA) au cours de la première tranche de 5 minutes de traitement. Le traitement par inhibiteurs de la PKA avant ou en conjonction avec un traitement BDNF bloqué les effets protecteurs de BDNF. Les effets du BDNF, cependant, n'ont pas été bloqués lorsque l'addition d'inhibiteurs de la PKA a été retardé aussi peu que 15 minutes après le traitement BDNF. Lorsque les cultures soulevé la nuit dans le BDNF ont été traités avec des inhibiteurs de la PKA, le BDNF protection médiée n'a pas pris fin, ce qui démontre que le maintien des effets protecteurs de BDNF est indépendante de l'activité PKA. L'activation induite par le BDNF de la PKA a été nécessaire pour le BDNF-médiée de stabilisation des filaments d'actine croissance cône contre la dépolymérisation par la cytochalasine D. Enfin, l'initiation et le maintien des effets protecteurs de la synthèse des protéines BDNF requis. Collectivement, ces données démontrent que la PKA de signalisation est requise uniquement pour une phase précoce de BDNF protection médiée par de NO induite par la croissance de cône effondrement.
Rac1 Endocytose Pendant Ephrin-A2 Et Semaphorin 3A-induite Collapsus Des Cônes De Croissance
Molécules de guidage négatifs sont importants pour guider la croissance des axones et, finalement, pour déterminer le schéma de câblage dans le système nerveux en développement. En culture de tissu, des cônes de croissance à l'extrémité des axones effondrement de plus en plus en réponse à des molécules de guidage négatifs, tels que éphrine-A2 et sémaphorine 3A. La petite GTPase Rac1 est impliquée dans l'effondrement du cône de croissance, mais la nature de son rôle n'est pas clair. Rac1 tests d'activité ont montré que Rac1 est transitoirement inactivée après un traitement avec éphrine-A2. Ephrin-induite effondrement du cône de croissance, cependant, en corrélation avec la reprise de l'activité de Rac1. Nous démontrons que Rac1 est requise pour l'endocytose de la membrane plasmique du cône de croissance et de réorganisation de la F-actine, mais pas pour la dépolymérisation de la F-actine pendant l'effondrement du cône de croissance en réponse à l'éphrine-A2 et sémaphorine 3A. Rac1, cependant, ne réglemente pas l'endocytose constitutive dans les cônes de croissance. Ces résultats montrent que, en réponse à des molécules de guidage négatifs, la fonction de Rac1 changements de la promotion de polymérisation de l'actine associée à la croissance des axones à la conduite endocytose de la membrane plasmique, entraînant l'effondrement du cône de croissance. En outre, Rac1 antisens injecté dans l'œil de poulet embryonnaire in vivo causé la projection rétinotectal de se développer sans la topographie normale d'une manière compatible avec Rac1 ayant un rôle dans la médiation obligatoire de signalisation éphrine.
Nerve Growth Factor Et Sémaphorine Pathways 3A Signalisation Interagir Dans La Régulation Sensorielle Motilité Neuronale Cône De Croissance
3A neurotrophines et sémaphorine sont présents le long des sentiers et dans les objectifs de développement des axones du ganglion de la racine dorsale (DRG) des neurones sensoriels. Cônes de croissance des axones sensoriels sont probablement régulé par l'interaction de signalisation cytoplasmiques déclenchées par hasard par les deux types de molécules de guidage. Nous avons étudié les interactions in vitro de la neurotrophines et de sémaphorine 3A (Sema3A) dans la modulation des comportements cône de croissance des axones s'étendaient de DRG d'embryons de poulet par jour embryonnaires 7. Cônes de croissance de DRG soulevées dans les milieux contenant 10 (-9) m NGF ou BDNF étaient plus résistants à Sema3A induite par l'effondrement du cône de croissance que lorsque les DRG ont été soulevées dans 10 (-11) m NGF. Après une nuit de culture sur 10 (-11) m NGF, un traitement de 1 h avec 10 (-9) m NGF ou BDNF était suffisante pour augmenter la résistance du cône de croissance à Sema3A induite par l'effondrement. Cette diminution de la neurotrophine-médiation dans la réponse effondrement des cônes de croissance DRG n'a pas été associée à une expression réduite sur les cônes de croissance de la protéine de liaison Sema3A neuropiline-1. Une série d'études pharmacologiques suivi. L'activité de phosphatidylinositol kinase 3 n'est pas requis pour ces effets de NGF. Les effets des inhibiteurs et d'activateurs de la protéine kinase A indiquer (PKA) que l'activité PKA est impliquée dans la modulation de NGF Sema3A induite par l'effondrement du cône de croissance. Les effets des inhibiteurs et d'activateurs de PKG PKG indiquent que l'activité est impliqué dans Sema3A induite par l'effondrement du cône de croissance. Les effets des inhibiteurs indiquent également que la Rho-kinase est impliquée dans l'activité induite par l'effondrement Sema3A cône de croissance. Ces résultats sont cohérents avec l'idée que les réponses cône de croissance à un repère d'orientation individuelle dépendent de signalisation qui coïncide par d'autres signaux de guidage et par d'autres voies de régulation.
Le Chiffre D'affaires Actine Est Requis Pour Empêcher La Rétraction Axon Poussé Par La Contractilité Actomyosine Endogène
Motilité du cône de croissance et d'orientation dépendra de la réorganisation dynamique de l'actine filamenteuse (F-actine). Dans le cône de croissance, F-actine subit roulement, qui est l'échange de sous-unités de filaments d'actine existants. Cependant, la fonction de F-actine chiffre d'affaires n'est pas clair. Nous avons utilisé jasplakinolide (JASP), un peptide macrocyclique cellule-perméable qui inhibe la F-actine chiffre d'affaires, pour étudier le rôle de la F-actine chiffre d'affaires en extension axone. Le traitement par JASP causé la rétraction des axones, ce qui démontre que l'extension axone nécessite F-actine chiffre d'affaires. La rétraction des axones en réponse à l'inhibition de la F-actine roulement est dépendante de l'activité de la myosine et régulée par RhoA et kinase à chaîne légère de myosine. De manière significative, la myosine endogène basé sur la contractilité était suffisante pour provoquer la rétraction des axones, parce JASP ne modifie pas l'activité myosine. Sur la base de ces observations, nous avons demandé si des signaux de guidage qui causent la rétraction des axones (éphrine-A2) inhibent la F-actine chiffre d'affaires. Rétraction Axon en réponse à l'éphrine-A2 corrélée à une diminution de la F-actine chiffre d'affaires et l'activité requise RhoA. Ces observations démontrent que l'extension axone dépend d'une interaction entre la myosine endogène axée sur la contractilité et la F-actine chiffre d'affaires, et que les signaux de guidage qui causent la rétraction des axones inhiber la F-actine chiffre d'affaires.
Intégrer Les Cônes De Croissance De Signalisation à Partir Des Signaux De Guidage Multiples
Facteur de croissance nerveuse (NGF) et semaphorin3A (Sema3A) sont des signaux de guidage trouvés dans les voies et les objectifs de développement de ganglions de la racine dorsale (DRG) neurones. DRG motilité du cône de croissance est réglementé par la signalisation cytoplasmiques déclenchés par ces molécules. Nous avons étudié les interactions de NGF et dans la modulation des comportements Sema3A cône de croissance des axones s'étendaient de E7 DRG d'embryon de poulet. Les axones s'étendent dans des matrices de collagène ont été repoussés par Sema3A libéré de cellules HEK293 transfectées. Toutefois, si un cordon de NGF-enduit a été placé à côté de Sema3A cellules productrices, les axones convergent au niveau du bourrelet NGF. Cônes de croissance de DRG a grandi à 10 (-9) m NGF étaient plus résistants à Sema3A induite par l'effondrement que lorsque les DRG ont été soulevées dans 10 (-11) m NGF. Après une nuit de culture sur 10 (-11) m NGF, le 1-h de traitement avec 10 (-9) m NGF a également augmenté la résistance du cône de croissance à Sema3A. Les études pharmacologiques ont indiqué que les activités de ROCK et PKG participer à des altérations du cytosquelette qui conduisent à Sema3A induite par l'effondrement du cône de croissance, alors que l'activité PKA est nécessaire pour le NGF-médiation réduction de Sema3A induite par l'effondrement du cône de croissance. Ces résultats appuient l'idée que les réponses cône de croissance à un repère d'orientation peut être modulé par des interactions impliquant la signalisation coïncidentes par des signaux de guidage autres.
RhoGTPases Dérèglement Et Cytosquelette D'actine Contribuer à L'anomalie De La Migration Dans LIS1 Déficientes Neurones
Lissencéphalie est une malformation cérébrale grave causée par la migration neuronale avec facultés affaiblies. LIS1, un gène causal, les fonctions dans une voie translocation nucléaire évolutivement conservées régulation dynéine moteur et la dynamique des microtubules. Attendu que les contributions des microtubules à la motilité des neurones sont encore mal compris, le cytosquelette d'actine est essentielle pour l'analyse le mouvement des cellules de tous les types cellulaires étudiés. Haplo-insuffisance LIS1 est montré ici pour également se traduire par l'actine filamenteuse réduite à la fine pointe de la migration des neurones, associée à la régulation positive de RhoA et la régulation négative de Rac1 et Cdc42 activité. Perturbation de la fonction RhoA par l'inhibition pharmacologique de son effecteur kinase, p160ROCK, restaure l'activité normale de Rac1 et Cdc42 et sauve le défaut motilité dans LIS1 + / - neurones. Ces données indiquent un rôle non comptabilisé antérieurement pour LIS1 protéine dans la motilité des neurones par la promotion de polymérisation de l'actine dans la régulation de la Rho GTPase activité. Cet effet de LIS1 sur GTPases ne semble pas se produire par liaison directe LIS1 de Rho, mais pourrait impliquer LIS1 effets sur les protéines Rho modulateurs ou sur la dynamique des microtubules.
Règlement De Filaments D'actine Du Cône De Croissance Par Des Signaux De Guidage
Les comportements mobiles de cônes de croissance au niveau des extrémités des axones s'allongent déterminer les voies de connexions axonales dans le développement du système nerveux. Cônes de croissance expriment des récepteurs pour des signaux de guidage moléculaires dans l'environnement local, et la liaison du récepteur de repère d'orientation initie signalisation cytoplasmique qui régule le cytosquelette de contrôler l'avance du cône de croissance, le tournage, et la ramification des comportements. Les filaments d'actine dynamiques de cônes de croissance sont fréquemment la cible de cette signalisation réglementaire. GTPases Rho sont des médiateurs clés de la signalisation par les signaux de guidage, mais il reste beaucoup à apprendre sur la façon dont les réponses cône de croissance sont orchestrées par des Rho GTPase de signalisation pour changer la dynamique de polymérisation, le transport et le démontage des filaments d'actine. La liaison de neurotrophines à Trk et p75 récepteurs sur les cônes de croissance provoque des changements dans la dynamique de l'actine filaments de réglementer plusieurs aspects des comportements cône de croissance. L'activation de récepteurs Trk médiateur accumulation locale de filaments d'actine, tandis que la neurotrophine se liant à p75 déclencheurs diminution locale de RhoA de signalisation qui favorise l'allongement de filopodes. Semaphorin IIIA et éphrine-A2 sont des indices d'orientation que l'évitement de déclenchement ou la répulsion des cônes de croissance de certains, et les réponses in vitro de ces protéines comprennent l'effondrement du cône de croissance. Les changements dynamiques dans les activités de Rho GTPases semblent médiation des réponses à ces indices, même si on ne sait pas quels sont les changements dans la distribution des filaments d'actine et la réorganisation dynamique qui résulte dans l'effondrement du cône de croissance. Cônes de croissance in vivo simultanément rencontrez des signaux de guidage positifs et négatifs, et donc, les comportements cône de croissance au cours de pathfinding axonale reflètent l'intégration complexe des multiples activités de signalisation.
P75 Signalisation Du Récepteur Neurotrophine Régule Dynamics Cône De Croissance Filopodial Grâce RhoA Modulant L'activité
Les mécanismes par lesquels les neurotrophines régulent la motilité du cône de croissance ne sont pas claires. Nous avons étudié le rôle du récepteur neurotrophique p75 (p75NTR) dans la médiation de la neurotrophine-induites augmentation de la longueur filopodial. Nos données démontrent que la liaison à p75NTR neurotrophine est nécessaire et suffisante pour réguler la dynamique filopodial. En outre, la rétine et dorsale cônes de croissance des racines ganglionnaires de souris mutantes p75 sont insensibles aux neurotrophines, mais afficher l'amélioration longueurs filopodial comparables avec des cônes neurotrophine-traité de type sauvage de croissance. Ceci suggère p75NTR inoccupée régule négativement la longueur filopodes. En outre, p75NTR régule l'activité de RhoA à la médiation dynamique filopodial. Constitutivement active de RhoA blocs neurotrophine-induites augmentation de la longueur, tandis que l'inhibition filopodial de RhoA améliore longueurs filopodial, semblables à un traitement neurotrophine. Le traitement des résultats du BDNF dans les neurones rétiniens RhoA activité réduite. En outre, p75 mutantes neurones afficher des niveaux réduits de RhoA activée par rapport à leurs homologues de type sauvage, en accord avec les longueurs améliorées filopodial observées sur les cônes de croissance de mutants. Ces observations suggèrent que les neurotrophines réguler la dynamique filopodial en appuyant sur la activation de la RhoA qui se produit à travers p75NTR signalisation.
Brain-derived Neurotrophic Factor Règlement De La Rétine De Croissance Dynamique Cône Filopodial Est Médiée Par L'actine Dépolymérisation Facteur / Cofiline
Les mécanismes moléculaires par lesquels neurotrophines régulent la motilité du cône de croissance ne sont pas bien comprises. Cette étude a porté sur la signalisation impliquée dans la transduction du BDNF augmentations induites par la dynamique de filopodial. Nos résultats indiquent que le BDNF régule la longueur et le nombre filopodial à travers une Rho kinase dépendante de mécanisme. En outre, le facteur de dépolymérisation d'actine (ADF) / activité cofiline est nécessaire et suffisante pour la transduction des effets de BDNF. Nos données indiquent que l'activation de l'ADF / cofiline imite les effets du BDNF sur la dynamique filopodial, tandis que les blocs d'inactivité ADF / cofiline les effets du BDNF. En outre, le BDNF favorise l'activation de l'ADF / cofiline en réduisant la phosphorylation de l'ADF / cofiline. Bien que l'inhibition de la myosine II améliore également la longueur filopodial, nos résultats indiquent que le BDNF signalisation est indépendant de la myosine II l'activité et que le résultat deux voies dans des effets additifs sur la longueur filopodial. Ainsi, l'extension filopodial est réglementé par au moins deux mécanismes indépendants. La voie BDNF-dépendante fonctionne via la réglementation de l'ADF / cofiline, indépendamment de la myosine II d'activité.
Modificateur De L'adhérence Cellulaire Régule La N-cadhérine-médiation Adhésion Cellule-cellule Et La Croissance Des Neurites
Modificateur de l'adhérence cellulaire (MOCA) est un membre du dédicant de la cytocinèse 180 famille de protéines et est hautement exprimé dans les neurones du SNC. MOCA est associée à la maladie d'Alzheimer enchevêtrements et régule l'accumulation de la protéine précurseur amyloïde et la bêta-amyloïde. Ici, nous déclarons que MOCA module adhésion cellule-cellule et de la morphologie. MOCA augmente l'accumulation des protéines des jonctions adhérentes, y compris la N-cadhérine et la beta-caténine, considérant que la réduction endogène expression MOCA abaisse cellule-cellule d'agrégation et de la N-cadhérine expression. MOCA co-localise avec la N-cadhérine et l'actine dans les zones de la cellule-cellule et cellule de contact substrat et est exprimé dans les processus neuronaux. MOCA s'accumule au cours de la différenciation neuronale et son expression augmente la croissance des neurites induite par le NGF et de la complexité morphologique. Nous concluons que MOCA réglemente la N-cadhérine-médiation adhésion cellule-cellule et la croissance des neurites.
Cônes De Croissance Tourner Et Migrent Vers Un Gradient Immobilisé Du Peptide Laminine IKVAV
Cône de croissance de navigation est guidée par extrinsèques protéines de l'environnement, appelé signaux de guidage. Beaucoup d'études in vitro ont caractérisé cône de croissance tournant de haut en bas des pentes de signaux de guidage solubles. Bien que les études précédentes ont montré que les taux d'élongation axonale peut être régulée par des gradients de surface liés molécules, il n'ya pas de démonstrations convaincantes de cônes de croissance de retournement de migrer jusqu'à un gradient lié à la surface d'un ligand adhésif ou signal de guidage. Afin de tester ce mode de guidage axonal, nous avons utilisé une technique de photo-immobilisation pour créer des grilles et des dégradés d'un peptide laminine adhésif sur les surfaces en polystyrène boîte de culture. Embryon de poulet de la racine dorsale des ganglions (GHM) ont été placés sur un quadrillage peptidiques contenant liée à la surface des pentes de la peptide IKVAV contenant. Cônes de croissance DRG suivie d'un trajet de surface peptide lié à au milieu d'un gradient orienté perpendiculairement à une différence de concentration entre 30 25% micromètre. La majorité des cônes de croissance tourné et a migré en remontant la pente, en tournant jusqu'à ce qu'ils soient orientés directement vers le haut du gradient. Cônes de croissance a ralenti leur migration quand ils ont rencontré le gradient, mais la vitesse du cône de croissance ont repris le rythme précédent après avoir monter ou descendre la pente. Cela ressemble à des situations in vivo où les cônes de croissance lente à un point de choix avant de changer la direction d'extension axonale. Ainsi, ces résultats soutiennent l'hypothèse que les mécanismes de guidage axonal inclure l'orientation des cônes de croissance par des gradients de surface liés molécules adhésives et des signaux de guidage.
Cdc42 Participe à La Régulation De L'ADF / Cofiline Et La Rétine Du Cône De Croissance Filopodes Par Brain Derived Neurotrophic Factor
GTPases de la famille Rho jouent des rôles importants dans la médiation des effets de signaux de guidage et des facteurs de croissance sur la motilité des cônes de croissance neuronaux. Nous avons précédemment montré que le BDNF régule la dynamique neurotrophine filopodial sur les cônes de croissance de la rétine axones des cellules ganglionnaires à travers l'activation de l'ADF protéines d'actine et de la réglementation cofiline en bloquant une voie RhoA-dépendante qui phosphoryle (inactive) ADF / cofiline. Le Cdc42 GTPase a également été impliquée dans la médiation des effets de signaux de guidage positifs. Dans cet article, nous avons examiné si Cdc42 est impliqué dans les effets du BDNF sur la dynamique filopodial. Traitement BDNF augmente Cdc42 activité dans les neurones rétiniens, et l'incorporation de neuronale constitutivement actives Cdc42 imite les augmentations dans le nombre et la longueur filopodial. En outre, constitutivement actives et dominante Cdc42 négatifs diminué et augmenté, respectivement, l'activité de RhoA dans les cônes de croissance rétiniens, ce qui indique la diaphonie entre ces GTPases dans les cônes de croissance de la rétine. Constitutivement active Cdc42 imité l'activation de l'ADF / cofiline qui a résulté de traitement BDNF, tandis que Cdc42 dominante négative a bloqué les effets du BDNF sur les filopodes et de l'ADF / cofiline. L'incapacité de Cdc42 dominant négatif de bloquer l'ADF / cofiline activation et la stimulation de la dynamique filopodial par l'inhibiteur de ROCK Y-27632 indiquent une interaction entre Cdc42 et RhoA intervient en amont de ROCK. Nos résultats démontrent la diaphonie se produit entre les GTPases dans la médiation des effets du BDNF sur la motilité du cône de croissance, et Cdc42 activité peut stimuler la dynamique de l'actine via l'activation de l'ADF / cofiline.
Calcium-dépendante De L'interaction Avec LIS1 IQGAP1 Et Cdc42 Favorise La Motilité Des Neurones
LIS1 anomalies génétiques nuire à la migration neuronale, provoquant la grave malformation du cerveau humain lissencéphalie. Bien que beaucoup est connu au sujet de ses interactions avec les microtubules, les microtubules des protéines liant tels que CLIP-170, et avec le complexe dynéine moteur, la réponse de LIS1 aux signaux neuronaux motilité n'a pas été élucidé. LIS1 déficit est associé à la déréglementation de l'GTPases Rho-famille Cdc42, Rac1 et RhoA, et les défauts qui en découlent d'actine du cytosquelette, mais le lien entre LIS1 et GTPases Rho reste incertaine. Nous rapportons ici que l'influx de calcium améliore la motilité des neurones par le biais LIS1 régulation dépendante des GTPases Rho. LIS1 favorise Cdc42 activation par l'interaction avec le calcium GTPase protéine IQGAP1 sensible échafaudage, le maintien de la localisation de perimembrane IQGAP1 et CLIP170 et microtubules ce attacher extrémités du cytosquelette corticale. LIS1 est donc un élément clé de la transduction du signal neuronal motilité qui régule le cytosquelette par complexation avec IQGAP1, Cdc42 active et CLIP-170 sur l'influx de calcium.
Changements Dans Les Neurones Elevage Limiter La Régénération Axonale Dans Le Cordon Spinal En Développement
Oiseaux et les mammifères embryonnaires afficher une remarquable capacité à se régénérer après une lésion médullaire axones, mais perdent ensuite cette capacité au cours d'une transition discrète développement. Pour expliquer cette transition, des recherches antérieures ont souligné l'émergence de la myéline et d'autres facteurs inhibiteurs de l'environnement de la moelle épinière. Cependant, la recherche dans des secteurs de SNC d'autres suggère un rôle important pour neurones intrinsèques des limitations à la régénération des axones. Ici, nous ré-examiner cette question quantitativement dans la projection rhombencéphale-rachidien du poussin embryonnaire. Utilisation de cocultures hétérochroniques nous montrons que la maturation de l'environnement la moelle épinière provoque une réduction de 55% dans la régénération des axones, tandis que la maturation des neurones rhombencéphale entraîne une réduction de 90%. Nous montrons en outre que les neurones transplantés jeunes in vivo dans la moelle épinière peuvent se régénérer plus axones dans la substance blanche myélinisée, tandis que les anciens axones régénèrent mal et ont réduit la motilité du cône de croissance sur une variété de croissance permissives ligands in vitro, y compris la laminine, L1, N et -cadhérine. Enfin, nous utilisons l'analyse vidéo des cônes de croissance de vie à documenter directement une baisse liée à l'âge de la motilité des axones du tronc cérébral. Ces données montrent que les changements développementaux dans l'environnement à la fois la moelle épinière et dans les neurones du tronc cérébral peut réduire la régénération, mais que l'effet de l'environnement n'est que partielle, tandis que les changements dans les neurones par eux-mêmes entraîner une réduction presque complète dans la régénération. Nous concluons que les événements de maturation au sein de neurones sont une cause principale de l'échec de la régénération des axones de la moelle épinière.
L1, Beta1 Intégrine, Et Cadhérines Médiation Régénération Axonale Dans Le Cordon épinière Embryonnaire
Oiseaux et les mammifères embryonnaires sont capables de régénération axonale après lésion de la moelle épinière, mais cette capacité est perdue au cours d'une transition discrète développement. Nous avons récemment montré que les changements dans les neurones à échéance, par opposition aux changements uniquement dans l'environnement la moelle épinière, réduisent sensiblement la régénération des axones au cours du développement. Les changements développementaux dans les neurones qui limitent la régénération des axones restent floues. Une lacune dans la connaissance est l'identité des récepteurs adhésifs que les neurones embryonnaires utiliser pour étendre les axones de la moelle épinière. Ici on teste les rôles des L1/NgCAM, beta1 intégrine, et cadhérines, en utilisant un système de co-culture d'embryons de poulet, dans lequel les neurones du tronc cérébral régénérer axones dans un explant de la moelle épinière embryonnaire. Par in vivo et in vitro, nous avons constaté que les neurones du tronc cérébral réduire l'expression axonale de la L1 à mesure qu'ils vieillissent. Perturber soit L1 ou beta1 intégrine fonction individuellement dans notre système de coculture partiellement inhibé la croissance des axones du tronc cérébral dans la moelle épinière, tout en perturbant la fonction cadhérine seul n'avait aucun effet. Toutefois, lorsque tous les trois récepteurs adhésifs ont été bloqués simultanément, la croissance des axones dans la moelle épinière a été réduite de 90%. Utilisation de l'immunohistochimie et hybridation in situ, nous montrons que pendant la période où les neurones perdent leur capacité de régénération ils réduisent l'expression de l'ARNm de N-cadhérine, et de réduire les protéines L1/NgCAM des axones à travers un mécanisme post-transcriptionnel. Ces données montrent que les neurones embryonnaires utiliser L1/NgCAM, beta1 intégrine, et les récepteurs cadhérine pour la régénération des axones de la moelle épinière embryonnaire, et soulèvent la possibilité qu'une expression réduite de ces récepteurs essentiels peut contribuer à la faible capacité de régénération des vieux-neurones.
La Synthèse Des Protéines Dans Les Axones Distaux N'est Pas Nécessaire Pour La Croissance Des Axones Dans Le Cordon épinière Embryonnaire
Il est maintenant bien établi que les protéines nouvelles sont synthétisés dans les segments distaux des axones d'allongement, où ils peuvent jouer un rôle essentiel dans certaines décisions d'orientation. On ne sait pas, cependant, si la synthèse des protéines distale joue également un rôle essentiel dans la croissance axonale en soi. Précédent dans des expériences in vitro ont montré que le blocage de la synthèse des protéines dans les axones distaux n'a aucun effet sur le taux de l'avance axonale. Cependant, parce que ces expériences ont été réalisées in vitro et sur une période de temps relativement court, le rôle de la synthèse protéique distale sur de longues périodes et dans un environnement tissu natif est resté non testé. Ici, nous avons testé si la synthèse des protéines dans les axones distaux joue un rôle essentiel dans l'allongement de descendre les axones de la moelle épinière embryonnaire. Nous avons développé un modèle in situ de la projection du tronc cérébral-spinal du poussin embryonnaire, et développé une méthode split-chambre dans laquelle inhibiteurs de la synthèse des protéines pourraient être appliquées indépendamment de corps cellulaires dans le tronc cérébral ou axones distaux de la moelle épinière. Lorsque la synthèse des protéines a été bloquée dans les axones distaux, la croissance des axones est restée vigoureuse pendant 2 jours, qui est la durée de l'expérience. Toutefois, lorsque la synthèse des protéines n'a été bloquée que dans le tronc cérébral, élongation axonale dans la moelle épinière a cessé dans les 6 h. Ces données ont montré que la synthèse des protéines dans l'axone distal n'est pas indispensable de poursuivre la progression des axones. Plutôt, les protéines essentielles sont synthétisés de manière plus proximale, puis transporté rapidement à l'axone distal.
La Synthèse Des Protéines Dans Les Axones Distaux N'est Pas Requise Pour Les Réponses Cône De Croissance à Des Signaux De Guidage
Des données récentes suggèrent que les réponses cône de croissance à des signaux de guidage exigent la synthèse des protéines locale. Utilisation de neurones chiches, nous avons examiné si la synthèse des protéines est nécessaire pour les cônes de croissance de plusieurs types pour répondre à des signaux de guidage. Tout d'abord, nous avons trouvé que l'inhibition globale de la synthèse protéique s'arrête élongation axonale après 2 h. Lorsque les inhibiteurs de la synthèse des protéines ont été ajoutés 15 min avant d'ajouter des signaux de guidage, nous n'avons trouvé aucun changement dans les réactions typiques des cônes de croissance de la rétine, sensorielle, et sympathique. En présence de cycloheximide ou anisomycine, éphrine-A2, fente-3, et l'effondrement semaphorin3A provoquait encore des cônes de croissance et la perte de filaments d'actine, facteur de croissance nerveuse (NGF) et la neurotrophine-3 saillie provoquait encore des cônes de croissance et a augmenté l'actine filamenteuse, et cônes de croissance sensorielles se tourna vers une source NGF. Dans les chambres compartimentées qui séparaient péricaryon à partir des axones, les axones en croissance pour 24-48 h, en présence de cycloheximide et a répondu aux signaux positifs et négatifs. Nos résultats indiquent que la synthèse des protéines n'est pas strictement nécessaire dans les mécanismes de réponses cône de croissance à des signaux de guidage de nombreux. Les différences entre nos résultats et d'autres études peuvent exister en raison des différents niveaux métaboliques cellulaires dans des conditions in vitro et une différence de quand les fonctions axonales deviennent dépendants de la synthèse des protéines locale.
L'actine Dans Les Axones: échafaudages Stables Et De Filaments Dynamiques
Les filaments d'actine sont des polymères minces de l'actine 42 kD. Dans les axones matures d'un réseau de filaments d'actine subaxolemmal assurer la stabilité de l'intégrité des membranes et un substrat pour le transport à courte distance de cargaisons. Dans l'élaboration de la réglementation neurones dynamique de polymérisation de l'actine et la médiation organisation morphogenèse axonale et pathfinding axonale à des cibles synaptiques. D'autres changements dans la forme axonale, garantie de branchement, la rétraction branche, et la régénération axonale, dépendent également de la dynamique d'actine du filament. L'actine filaments organisation est régie par une diversité de protéines de liaison à l'actine (ABP). ABP sont l'objet de complexes extrinsèques et intrinsèques des voies de signalisation, et de nombreuses pathologies neurologiques et dysfonctionnements proviennent de défauts de régulation de la fonction ABP.
Activation De L'ADF / Cofiline Cône Médiateur De Croissance Attrayant Tournant Vers Nerve Growth Factor Et La Nétrine-1
Une bonne circuits neuronaux nécessite que les cônes de croissance, des conseils mobiles d'axones qui s'étendent, répondent aux signaux de guidage moléculaires exprimées dans l'organisme en développement. Cependant, il est difficile de savoir comment des signaux de guidage modifier le cytosquelette pour guider pathfinding cône de croissance. Ici, nous montrons le traitement aigu avec deux signaux de guidage attractifs, facteur de croissance nerveuse (NGF) et la nétrine-1, pour ganglion de la racine dorsale embryonnaire et temporelles des neurones rétiniens, respectivement, les résultats en saillie de croissance accrue membrane cône, polymérisation de l'actine, et l'actine filamenteuse ( actine F). Protéines ADF / cofiline famille (AC) de faciliter la F-actine dynamique, et nous avons trouvé la forme inactive phosphorylée de l'AC est diminuée dans les cônes de croissance NGF ou la nétrine-1-traités. Directement augmentation de l'activité AC imite plus de NGF ou la nétrine-1 pour augmenter saillie du cône de croissance et de F-actine niveaux. Gradients extracellulaires de NGF, nétrine-1, et un courant alternatif cellule perméable obtenir cône de croissance attractif tournant et l'augmentation de F-actine extrémités barbelées, F-actine accumulation, et dans les régions actives AC de croissance de cône proximale à la source de gradient. Réduction de l'activité AC émousse retournant des réponses au NGF et la nétrine. Nos résultats suggèrent que les gradients de NGF et la nétrine-1 localement activer AC afin de promouvoir et de polymérisation de l'actine du cône de croissance ultérieure en se tournant vers le côté contenant une plus grande activité AC.
L'activation De Ezrin / Radixine / Moésine Médiateur Croissance Orientation Cône Attrayant Grâce Règlement D'actine Du Cône De Croissance Et Récepteurs D'adhésion
Le développement d'un réseau neuronal fonctionnement repose sur les réponses des cônes de croissance axonaux à des signaux de guidage moléculaires que l'on rencontre en route vers leur tissu cible. Facteur de croissance nerveuse (NGF) et la neurotrophine-3 servira de repères intéressants pour les cônes de croissance d'embryons de poulet sensorielles in vitro et in vivo, mais peu est connu sur les protéines liant l'actine nécessaires à la médiation de cette réponse. Le évolutivement conservées ezrine / radixine / moésine (ERM) de la famille des protéines peut filaments d'actine d'attache à la membrane cellulaire où phosphorylée à un résidu thréonine conservé. Ici, nous montrons que la stimulation aiguë augmente rapidement neurotrophine actifs phospho-ERM niveaux poussin sensorielle neurone du cône de croissance filopodes, coïncidant avec une augmentation de la L1 et de β-filopodial intégrine. Perturber la fonction MCE avec une dominante-négatives construire (DN-ERM) des résultats dans les cônes de croissance plus petites et moins mobiles avec les filaments d'actine désorganisés. Auparavant, nous avons constaté que le traitement NGF augmente l'actine-dépolymérisation facteur (ADF) / activité cofiline et du cône de croissance F-actine (Marsick et al., 2010). Ici, nous montrons cette augmentation F-actine, ainsi que de braquage attrayant pour les NGF, est bloqué lorsque la fonction de GRE est perturbé, malgré l'activation normale de l'ADF / cofiline. Nous montrons en outre que le DN-MCE expression perturbe la localisation fine pointe de la connexion ADF / cofiline et libres F-actine extrémités barbelées. En outre, filopodial phospho-ERM niveaux sont augmentés par l'incorporation de connexion ADF / cofiline et réduit par effet de choc de L1CAM.Together, ces données suggèrent que les protéines ERM organiser filaments d'actine dans les cônes de croissance des neurones sensoriels et sont cruciales pour la neurotrophine-induite remodelage de la F- actine et la redistribution des récepteurs d'adhésion.
Répulsives Des Signaux De Guidage Axon Ephrin-A2 Et Slit3 Saillie D'arrêt Du Cône De Croissance Leading Marge Parallèlement à L'inhibition De L'ADF / Cofiline Et Protéines ERM
Cônes de croissance axonaux se détourner de signaux de guidage répulsives. Cela peut commencer par la motilité propulsion réduite dans la région de la marge du cône de croissance de premier plan qui est plus proche de la source de repère répulsive. En utilisant des explants de rétine E7 poussin temporelle, nous examinons les effets de deux signaux de guidage répulsives, éphrine-A2 et slit3, sur l'activité des cellules ganglionnaires de la rétine du cône de croissance en propulsion, le total des F-actine, libres F-actine se termine barbelés, et des activités (phosphorylation états) de protéines régulatrices d'actine, ADF / cofiline et les protéines ERM. Ephrin-A2 arrête rapidement l'activité propulsion simultanément à la réduction de la F-actine, les extrémités libres de barbelés et les activités de l'ADF / cofiline et les protéines ERM. Slit3 s'arrête aussi saillie et réduit les activités de l'ADF / cofiline et les protéines ERM. Nous interprétons ces résultats comme indiquant que les signaux de guidage répulsives inhiber la polymérisation d'actine et de l'actine-membrane de liaison pour arrêter l'activité de propulsion. Rétrograde F-actine débit retire actine à l'extrémité C-domaine, où F-actine faisceaux d'interagir avec la myosine II de générer des forces contractiles qui peut s'effondrer et se rétracter le cône de croissance. Nos résultats suggèrent que des mécanismes communs sont utilisés par signal de guidage répulsives pour désactiver la motilité du cône de croissance et de terminaux remodeler axone en croissance. © 2012 Wiley Periodicals, Inc
