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Profilage de la méthyltransférase et autres S-Adénosyl- L-Homocystéine protéines liant par spectrométrie de masse de captation composé (CDSM)
1Department of Biochemistry / Analytics, caprotec bioanalytics GmbH, 2Institute of Organic Chemistry, RWTH Aachen University
Composés de capture sont trifonctionnel petites molécules afin de réduire la complexité du protéome par fonctionnels réversibles petite molécule de protéine d'interaction suivie par la photo-réticulation et de purification. Ici, nous utilisons un composé de capture avec des
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Synthèse De La S-adénosyl-L-homocystéine Capturer Composés Pour L'isolement Sélectif Photoinduit Des Méthyltransférases
Comprendre l'interaction entre les protéines cellulaires différentes et leurs substrats est d'un intérêt majeur dans l'ère postgénomique. À cette fin, isolement sélectif et l'identification des protéines à partir d'échantillons biologiques complexes est nécessaire et isolement ciblée des familles d'enzymes est une tâche difficile. Au cours des dernières années, méthodes comme fondé sur l'activité des protéines profilage (ABPP) et spectrométrie de masse composé de capture (CCMS) ont été développés pour réduire la complexité du protéome au moyen de la fonction des protéines à la différence des approches standards, qui utilisent les différences de propriétés physiques pour la séparation des protéines. Pour isoler et identifier le subproteome de la S-adénosyl-L-méthionine (SAM ou AdoMet)-dependent methyltransferases (méthylome), nous avons développé et synthétisé trifonctionnelle capture composés contenant le produit chimiquement stable cofacteur S-adénosyl-L-homocystéine (SAH ou AdoHcy) en fonction de la sélectivité. SAH analogues avec les linkers aminés aux positions N6 ou C8 ont été synthétisés et attachés aux échafaudages contenant psoralen différents groupes pour modification covalente de protéine et la biotine pour l'isolement de l'affinité. L'utilité de ces composés de capture SAH pour l'isolement des protéines sélective photoinduit est démontrée pour divers méthyltransférases (MTases), agissant sur l'ADN, l'ARN et les protéines, ainsi qu'avec la cellule de Escherichia coli lysat. En outre, ils peuvent servir à déterminer les constantes de dissociation des complexes MTase-cofacteur.
Profilage Des Méthyltransférases Et D'autres Protéines De Liaison S-adénosyl-L-homocystéine Par Spectrométrie De Masse Composé De Capture
Il y a une variété d'approches visant à réduire la complexité du protéome sur la base des interactions fonctionnelles petite molécule-protéine. Les auteurs décrivent une approche générique basée sur trifonctionnelle composés de Capture, dans lequel l'interaction initiale axée sur l'équilibre entre les protéines de sonde et cible une petite molécule est irréversiblement fixée sur photo-réticulation entre une fonction indépendante de réactivité photo activable de l'enceinte de Capture et de la surface des cible ou des protéines. Par la suite, composé de Capture - conjugués de protéines sont isolés des mélanges biologiques complexes grâce à la fonction de tri de l'enceinte à capturer. Nous décrivons ici la demande d'un trifonctionnelle capturer composé qui transporte de l'inhibiteur de produit méthyltransférase S-adénosyl-L - homocystéine que la fonction de sélectivité pour l'isolement des méthyltransférases à partir d'un lysat d'Escherichia coli DH5α cellules de complexe. Réticulation photoactivation améliore le rendement et la sensibilité de l'expérience, et la spécificité peut être facilement testée pour dans les expériences de compétition à l'aide d'un excès de S-adénosyl-L - homocystéine libre.
