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Articles by R. Sean Norman in JoVE
JoVE General
La extracción de ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos
Ofrecemos un protocolo mejorado para la extracción de ADN de alto peso molecular de tapetes microbianos hipersalinos. Las células microbianas son separados de la matriz de alfombra antes de la extracción y purificación del ADN. Esto mejora la concentración, calidad y tamaño de la DNA. El protocolo puede ser utilizado para otras muestras de refractario.
Other articles by R. Sean Norman on PubMed
Variabilidad En La Expresión De Pseudomonas Aeruginosa Lipopolisacárido Durante La Degradación De Petróleo Crudo
Utilización bacteriana de los componentes del petróleo crudo, tales como el n-alcanos, requiere una adaptación compleja superficie de la célula para permitir la adherencia al aceite. Para comprender mejor la adaptación microbiana de la superficie celular para el crecimiento en el petróleo crudo, las características de la superficie celular de dos cepas de Pseudomonas aeruginosa, U1 y U3, tanto aislado de la comunidad de petróleo crudo de degradación microbiana misma enriquecido en el petróleo crudo Bonny Light (BLC), se compararon . Análisis de las tasas de crecimiento demostrado un aumento de tiempo de retardo para U1 células en comparación con las células U3. Modificación con EDTA inhibió el crecimiento U1 y U3 y la degradación del componente de n-alcano de BLC, lo que sugiere una relación entre la estructura de la superficie celular y la degradación del aceite crudo. U1 células demostrado una transición suave colonia-a-bruto morfología cuando se cultiva en BLC, mientras U3 células exhiben morfología de las colonias áspero al principio. La combinación de alta resolución microscopía de fuerza atómica de la superficie celular y sodio dodecil sulfato-poliacrilamida electroforesis en gel de lipopolisacáridos (LPS extraídos), demuestran que aísla crecido en BLC han reducido antígeno O-expresión en comparación con la de glucosa en células cultivadas. La pérdida de O-antígeno dado lugar a moléculas más cortas LPS, el aumento de la hidrofobicidad de la superficie celular, y el aumento de n-alcano degradación.
Efecto De La Piocianina De Una Comunidad Microbiana Crudo-que Degrada El Petróleo
Pseudomonas aeruginosa es un degradador de n-alcanos que es frecuentemente aislada de sitios contaminados con petróleo y produce factores que mejoran su competitividad y la supervivencia en muchos entornos. En este estudio, un factor de tal, piocianina, ha sido detectado en un cultivo que degrada el petróleo que contiene P. aeruginosa y es un compuesto redox-activo capaz de inhibir el crecimiento microbiano. Para examinar los efectos de piocianina más, una cultura que degrada el petróleo se cultivó con y sin 9,5 piocianina microM y estructura de la comunidad microbiana y la degradación del aceite fueron controlados durante 50 días. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) análisis de las culturas reveló una disminución en la diversidad de la comunidad microbiana en las culturas piocianina-modificado con respecto a la de las culturas no modificadas. Dos miembros de la comunidad microbiana en cultivos puros mostraron sensibilidad intermedia y alta de piocianina correspondientes a los niveles intermedios y bajos de actividad de las enzimas antioxidantes catalasa y superóxido dismutasa, respectivamente. Otro miembro de la comunidad que se mantuvo constante en los geles de DGGE durante el período de cultivo 50-días de incubación exhibió ninguna sensibilidad a piocianina, correspondiente a un alto nivel de catalasa y superóxido dismutasa cuando se examina en un cultivo puro. Piocianina afectado también a la degradación global del crudo. En 50 días, la cultura sin piocianina habían disminuido los hidrocarburos aromáticos policíclicos en comparación con la cultura piocianina-modificado, con una reducción específica en la degradación de dibenzotiofenos, naftalenos, y C (29) y C (30) hopanos. Este estudio demostró que piocianina influido en la diversidad de la comunidad microbiana y sugiere la importancia de la comprensión de cómo las interacciones entre especies influyen en la capacidad de degradación de una comunidad microbiana.
Población Microbiana Gene Dioxigenasa Se Mueve Durante La Biodegradación Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos
La degradación de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) por las bacterias ha sido ampliamente estudiada. Mientras que muchos cultivos puros se han aislado y caracterizado por su capacidad para crecer en HAP, la información limitada está disponible en la diversidad de microbios implicadas en la degradación de HAP en el medio ambiente. Hemos diseñado genéricos PCR primers dirigidos al fragmento de gen que codifica el centro de hierro Rieske de azufre común a todas las enzimas dioxigenasa HAP. Estos cebadores Rieske fueron empleados para realizar un seguimiento de los cambios de población dioxigenasa de genes en cultivos de enriquecimiento del suelo después de la exposición a la naftalina, fenantreno, o pireno. La degradación de los HAP se siguió por cromatografía de gases con detección de ionización de llama. Se extrajo el ADN de los cultivos de enriquecimiento después de la degradación de los HAP. 16S rRNA y fragmentos de genes Rieske fueron PCR amplificado a partir de ADN extraído de cada uno de enriquecimiento de la cultura y un tratamiento sin modificaciones. Los productos de PCR fueron clonados y secuenciados. El control molecular de los cultivos de enriquecimiento antes y después de la degradación de los HAP mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante y el 16S rRNA bibliotecas de genes sugiere que filotipos específicos de bacterias se asociaron con la degradación de cada uno de los HAP. La secuenciación de los fragmentos de genes clonados Rieske mostró que las suites de diferentes genes estaban presentes en las poblaciones microbianas del suelo en cada condición de cultivo de enriquecimiento. Muchas de las secuencias de fragmentos de genes Rieske cayó en clados que son diferentes de las secuencias de genes de referencia dioxigenasa utilizados para diseñar los cebadores de PCR. La capacidad de un perfil no sólo de la comunidad bacteriana, sino también los dioxigenasas que codifican proporciona una poderosa herramienta para evaluar tanto el potencial de biorremediación en el ambiente y para el descubrimiento de genes nuevos dioxigenasa.
Lisis Objetivo Fototérmica De Las Bacterias Patógenas, Pseudomonas Aeruginosa, Con Nanorods Oro
Los aumentos en la prevalencia de bacterias resistentes a antibióticos requieren nuevos enfoques para el tratamiento de los patógenos bacterianos infecciosos. Ahora está claro que un enfoque de la nanotecnología basada en el uso de nanopartículas para atacar selectivamente y destruir las bacterias patógenas pueden aplicarse con éxito. Se han explorado este enfoque mediante nanorods oro que han sido unidos covalentemente a anticuerpos primarios para destruir selectivamente el patógeno bacteria Gram-negativa, Pseudomonas aeruginosa. Se encuentra que, tras la unión nanorod a la superficie celular bacteriana, la exposición a los resultados de la radiación del infrarrojo cercano en una reducción significativa de la viabilidad celular bacteriana.
La Detección Rápida De Detección De Quórum De Señales De N-acil Homoserina Lactonas Por Una in Vitro Libre De Células De Ensayo
Un sencillo, sensible, rápido y libre de células sistema de ensayo fue desarrollado para la detección de N-acil homoserina lactona (AHL) autoinductores implicados en la detección de quórum bacterianas (QS). El presente enfoque mejora sobre anteriores de células enteras biosensor enfoques basados en su utilización de un enfoque de ensayo libre de células para realizar bioensayos. El ensayo libre de células se derivan de la AHL biosensor bacteria Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pCF218) (pCF372), lo que permite la expresión de la beta-galactosidasa con la adición de AHL exógenos. Hemos demostrado que el beta-galactosidasa expresión es posible en la celda sin solución [lisado de Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pCF218) (pCF372) la cultura]. Límites de detección del ensayo con el uso de sustrato cromogénico X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido) varió desde aproximadamente 100 nm a 300 nm en función de la AHL específico. Sustitución (de X-Gal) con el sustrato luminiscente beta-Glo aumento de la sensibilidad a AHL por 10-pliegue. Una ventaja importante del sistema de ensayo libre de células es la eliminación de pasos que consumen tiempo para el acondicionamiento biosensor cultivo celular, que son necesarios antes de su conjunto de células bioensayos. Esto reduce significativamente los tiempos de ensayo de más de 24 h a menos de 3 horas, mientras se mantiene una alta sensibilidad. Ensayo de lisado se pueden preparar a granel y se almacena (-80 grados C) durante 6 meses para uso futuro. Por último, el presente Protocolo podrá ser adaptado para su uso con otras cepas de biosensores y ser usado en la selección de alto rendimiento AHL de las bacterias o las bibliotecas de metagenómica.
Autoinductores Extraído De Tapetes Microbianos Revelan Una Sorprendente Diversidad De La N-acylhomoserine Lactonas AHL) Y Los Cambios De Abundancia Que Puedan Relacionarse Con Diel PH
Los tapetes microbianos son comunidades muy estructuradas y diverso, y uno de los conjuntos de vida más antiguo conocido. Mat bacterias interactúan dentro de un entorno marcado por fuertes gradientes geoquímicos y las fluctuaciones. Se examinaron los sistemas naturales estera para detectar la presencia de autoinductores implicados en la detección de quórum, una forma de comunicación célula-célula. Nuestros resultados revelaron que una gran variedad de N-acylhomoserine lactonas (AHL), incluyendo C (4) - a C (14)-AHL, se identificaron a partir de extractos mate utilizando la espectrometría de masas (MS), con la confirmación por parte de MS / MS-colisión inducida por la disociación (CID), y las adiciones de estándares externos. Mediciones microelectrodos mostró que esteras exhibió las fluctuaciones diarias: pH, que van desde alcalina (pH 9,4) durante el día (fotosíntesis neta) a ácido (pH 6,8) durante la oscuridad (respiración neto / fermentación). En condiciones de laboratorio, AHL tienen más cortos acil-cadenas fueron degradados en el marco de tiempo que el pH alcalino diaria (> 8,2) condiciones se dan en las esteras. El muestreo intensivo de alfombras después de incubaciones de todo el día o la noche-reveló que las acumulaciones de extraíbles de cadena más corta AHL (por ejemplo, C (8) - y C (10) AHL) fueron significativamente (P <0,001) disminuyó durante el día. Nuestro estudio ofrece evidencia de que las estabilidades de AHL en condiciones naturales puede estar influenciada por el medio extracelular proximal. Asimismo, proponemos que la periodicidad antigua de la fotosíntesis / respiración en esteras puede potencialmente conducir un mecanismo para que las diferencias en las actividades diarias: de autoinductores ciertas, y por lo tanto, las actividades de bacterias mediada a través de la detección de quórum.
La Detección De Quórum En Ambientes Naturales: Vistas Emergentes De Los Tapetes Microbianos
Mucha información basada en el laboratorio existente en la detección de quórum, un tipo de célula bacteriana a la comunicación celular que depende de los intercambios de señales moleculares entre células vecinas. Sin embargo, poco se sabe acerca de cómo este y otros sistemas de detección de microorganismos operan en la naturaleza. Modificaciones geoquímicas y biológicas de las señales probablemente ocurren en ambientes extracelulares, y éstos podrían interrumpir la comunicación está previsto si las señales ya no son reconocidos. Sin embargo, como veremos aquí, alteraciones de la señal podría dar lugar a otras medidas de resultado: si una señal modificada es capaz de interactuar con un receptor diferente a continuación, más información del medio ambiente puede ser adquirida por las células receptoras. También postulan que la detección de quórum se produce dentro de los grupos celulares, donde la dispersión de la señal podría verse significativamente influido por los polímeros extracelulares. Como un sistema modelo para discutir estos puntos que usamos tapetes microbianos - altamente estructuradas las comunidades que viven bajo la biopelícula muy definidos, gradientes geoquímicos fluctuantes.
La Extracción De ADN De Alto Peso Molecular a Partir De Los Tapetes Microbianos
Debido a la presencia de inhibidores, tales como sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y las sales, los estudios más estera microbianas se han basado en métodos ásperos de extracción directa de ADN que dan lugar a fragmentos de ADN demasiado pequeño para vector de clonación a gran inserción. De alto peso molecular (HMW) de ADN es crucial en estudios metagenomic funcionales, porque los fragmentos grandes presentan mayor acceso a los genes de interés. Aquí mostramos metodologías mejoradas para la extracción de ADN de alto peso molecular de la EPS-ricos tapetes microbianos hipersalinos. El protocolo utiliza una combinación de separación de células microbianas con métodos mecánicos y químicos para la extracción y purificación del ADN, seguido de precipitación con polietilenglicol (PEG). Los rendimientos de protocolo> 2 g de ADN HMW (> 48 kb) por gramo de muestra estera, con A260: 280 coeficientes> 1,7. Además, el análisis del gen 16S ARNr mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante y pirosecuenciación puso de manifiesto que este protocolo extrae ADN representante de las comunidades de esteras microbianas y los resultados más altos en los índices globales de diversidad calculados en comparación con los otros tres métodos estándar de extracción de ADN. Nuestros resultados muestran la importancia de validar los métodos de extracción de ADN utilizados en estudios de metagenómica para asegurar una recuperación óptima de la riqueza microbiana.
Caracterización Y Cuantificación De Una Novela De β-lactamasa De Genes Encontrados En Una Planta De Tratamiento De Aguas Residuales Y El Ecosistema De La Región Costera
Plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) son estructuras de ingeniería que se acumulan, se concentran y tratan los desechos humanos, en última instancia, la liberación de las aguas residuales tratadas en los entornos locales. Mientras EDAR eficientemente eliminar la mayoría de los biosólidos, se ha demostrado que muchos antibióticos y bacterias resistentes a los antibióticos pueden sobrevivir al proceso de tratamiento. Para determinar cómo EDAR influyen en la concentración y la difusión de los genes resistentes a los antibióticos en el medio ambiente, un enfoque metagenómica funcional se utiliza para identificar un nuevo gen de resistencia antibiótica dentro de una planta depuradora, y la PCR cuantitativa (qPCR) se utilizó para determinar el número de copias del gen dentro del las instalaciones y el ecosistema costero local. Desde la biblioteca metagenómica EDAR, la inserción fosmid contenida en un clon de alta resistencia (MIC, ≈ 416 mg ml (-1) a la ampicilina) fue secuenciado y anotado, dejando al descubierto 33 genes putativos, incluyendo un gen de 927 pb que es 42% idéntica a la uno caracterizado funcionalmente β-lactamasa de PC1 Staphylococcus aureus. El aislamiento y la subclonación de este gen, denominado bla (M-1), confiere resistencia a la ampicilina a su huésped de Escherichia coli. Cuando se normaliza el volumen, qPCR mostraron mayores concentraciones de bla (M-1) durante las etapas iniciales del tratamiento, sino dos veces-disminución de las concentraciones durante la etapa de tratamiento final. La concentración de ng (-1) ADN aumentó durante todo el proceso de la EDAR del afluente de aguas residuales, lo que sugiere que bla (M-1) constituye una parte importante del material genético total que se liberan en el ecosistema costero. Descarga promedio se estimó en 3.9 × 10 (14) copias de la bla (M-1) de genes publicadas diariamente en este ecosistema costero. Además, el gen se observa en todas muestras de agua costera y muestras de sedimentos en torno a la instalación. Nuestros resultados sugieren que las EDAR puede ser una vía para la difusión de nuevos genes de resistencia a antibióticos en el medio ambiente.
