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Articles by Rebecca A. Wingert in JoVE
JoVE General
成年斑马鱼肾脏的解剖
Department of Biological Sciences, University of Notre Dame
斑马鱼的肾脏是成人肾和造血干/祖细胞，并代表一个绝佳的机会，这些细胞类型和他们的后代在脊椎动物模式生物研究。在这里，我们展示了详细的解剖程序，使研究人员识别和手术去除成年斑马鱼的肾，可用于细胞分离，移植，肾和/或血液细胞群表达的研究，如应用。
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激光烧蚀斑马鱼Pronephros研究肾小管上皮再生
Department of Biological Sciences, University of Notre Dame
在人类急性肾损伤（AKI）是临床常见的问题，造成损害的上皮细胞，包括肾肾，AKI的是与高死亡率的50-70％1。上皮细胞破坏，肾有再生能力有限，但指导这一现象的机制和限制，仍然知之甚少。在这个视频文章中，我们描述了我们的技术在斑马鱼胚胎的肾脏，肾肾细胞有针对性的激光烧蚀或pronephros。我们的新方法，可以用来补充AKI的肾毒性引起的模型和肾肾上皮再生的细胞和分子变化，获得高分辨率的认识。
Other articles by Rebecca A. Wingert on PubMed
香醍漫步斑马鱼突变提供系祖特定中断转铁蛋白受体 1 的模型。
铁是一种至关重要的正常发展，正在生产所需的血红素，是纳入细胞色素和血红蛋白的金属。斑马鱼香醍漫步 (cia 的) 突变后的胚胎的流通，表明红细胞血红蛋白生产中的摄动发病表现变色、 小细胞贫血。我们显示中情局将编码 tfr1a，其中特别在发展中国家的血和必要的仅为铁摄取的红细胞前体表示。在隔离斑马鱼 tfr1，我们发现两个类似于 tfr1 的基因 (tfr1a 和 tfr1b) 和单一 tfr2 ortholog。Tfr1b 函数使用反义 morpholinos 废除表明此 paralog 在红细胞中的血红蛋白生产的重要前提。tfr1b morphants 展出生长发育迟缓、 脑坏死，类似于 Tfr1 空鼠标，以指示非系祖组织可能会将该 tfr1b 用于铁收购中观察到的中枢神经系统缺陷。表达的鼠标 Tfr1、 Tfr2、 鼠标和斑马鱼 tfr1b 部分获救中央情报局胚胎，建立这些转铁蛋白受体的每个都能够支持铁吸收体内的血红蛋白生产低。两者合计，这些数据显示斑马鱼 tfr1a 和 tfr1b 分享生化功能，但限制了域的组织表达和建立一个遗传模型研究 Tfr1 系祖细胞的特定功能。
损失的 Gata1，但不是 Gata2 转换在斑马鱼胚胎中轻度红细胞生成。
造血祖细胞分化为红细胞或髓细胞谱系是认为取决于转录因子 gata1 和 pu.1 的相对水平。而损失的函数分析显示，gata1 是终端红细胞分化的必要条件，没有研究证明损失 gata1 改变个体发育期间的髓系分化。这里我们提供的 Gata1，但不是 Gata2，损失将原始血前体转换为髓系细胞体内证据导致粒细胞中性粒细胞和巨噬细胞影响红细胞的大规模扩张。除了这种命运变化，发现许多系祖基因表达的差异取决于 Gata1 单，Gata1 和 Gata2，或独立于这两种神经系统的因素，提出多个通路调节系祖基因表达。我们的研究建立神经系统造血因子依赖的转录层次结构，并证明这 gata1 发挥整体的作用，在胚胎期间指挥骨髓红系沿袭命运决定。
虚谷氧还蛋白 5 揭示了 Fe S 群集所需的脊椎动物因子合成。
铁是生产因子和铁硫 （铁 S） 群集所需的过程发生独立的思想。在这里我们展示在设拉子 (sir) 斑马鱼突变体变色贫血致虚谷氧还蛋白 (grx5) 5 酵母为 Fe S 群集组件所需的基因。我们发现，grx5 有人在斑马鱼和小鼠的红细胞。斑马鱼 grx5 救出 grx5 酵母铁-S，显示 grx5 的生化功能从进化的角度守恒的大会。与酵母，不同的脊椎动物使用铁调节蛋白 1 (IRP1) 感觉细胞内铁和规管 mRNA 稳定性或铁代谢相关基因的翻译。我们发现丢失的 Fe S 群集大会主席先生动物激活 IRP1 和阻止因子生物合成催化 aminolaevulinate 合酶 2 (ALAS2)。不带 5' 铁响应元素绑定 IRP1 ALAS2 RNA 的表达救出爵士胚胎，而表达的 ALAS2 包括铁响应元素却没有这样做。此外，反义的 IRP1 组合式还原爵士胚胎血红蛋白合成。这些研究结果揭示生物因子的合成和 Fe S 群集，指示区分红细胞中的血红蛋白生产规管通过 Fe S 群集组件之间的连接。
Mitoferrin 是红细胞铁同化的必要条件。
铁具有许多代谢过程，包括电子运输、 核苷酸合成、 氧运输和涉及 haemoproteins 和 Fe S 群集蛋白质的很多重要的氧化还原反应中的基本作用。有缺陷的铁稳态导致缺铁或铁过载。铁运输的线粒体的精确调控因子生物合成、 血红蛋白生产和 Fe S 群集蛋白大会期间红色单元格发展至关重要。这里我们介绍斑马鱼的突变种，弗 (frs) 显示由于缺陷深刻变色贫血和红细胞成熟逮捕中线粒体铁吸收。通过定位克隆，我们表明 frs 突变体的突变的基因是脊椎动物线粒体溶质承运人家庭 (SLC25) 我们称之为 mitoferrin (mfrn) 的成员。mfrn 是高表达在胎儿和成人造血组织的斑马鱼和鼠标。为 Mfrn （也称为 Slc25a37） 生成从小鼠胚胎干细胞的空性红细胞显示成熟逮捕 55Fe 严重受损纳入因子。酵母 mfrn orthologues、 MRS3 和 MRS4，中断导致铁代谢和线粒体 Fe S 群集生物发生学中的缺陷。小鼠 Mfrn 营救 frs 斑马鱼、 缺陷和斑马鱼 mfrn 补充酵母突变，表明可能高度保守的基因功能。我们的数据显示，mfrn 函数作为主要的线粒体铁进口商因子合成的脊椎动物性红细胞的必要条件。
Cdx 基因和维甲酸控制的定位和分割的斑马鱼鳜鱼。
肾功能取决于肾单位，其中包括血液滤过器，肾小管，分为功能不同的部分，并收集管道。这些地区发展过程中出现如何了解甚少。斑马鱼鳜鱼的发展从沿长度的树干的中间中胚层的两个线性 nephrons 由组成。在这里我们显示与当前的教条，这些 nephrons 拥有多个类似于哺乳动物的肾单位的组织的近端和远端肾小管域。我们审查了是否 pronephric 分割介导的视黄酸 (RA) 和骶管 (cdx) 转录因子，在开发过程中已知的节段性身份的监管机构。RA 信号抑制导致损失的近端段和远端路段的扩大而致近端段命运而远端命运外源 RA 治疗。Cdx 功能的丧失造成远端的细分，废除后的鳜鱼，立场转变和改建表达边界的 raldh2 和 cyp26a1，其中对酶的合成和降解 RA，分别进行编码。这些结果表明 cdx 基因的作用是要本地化的活性 RA 沿轴，从而确定在何处鳜鱼形式。与此相一致，pronephric 定位缺陷和远端肾小管命运的损失获救在胚胎双馈缺 cdx 和辉煌地发芽。这些研究结果揭示 RA 和 cdx 通路的新型联系及如何提供一种模型 pronephric nephrons 是分段和沿胚轴放置。
组合新颖系祖基因表达调控的斑马鱼。
规范和血红细胞的造血干细胞的诱导分化需要精确的协调多个转录因子。大多数基因重要的红细胞成熟受神经系统 DNA 结合蛋白的家庭。以前，我们确定了三个新基因 kelch 重复含蛋白 (krcp)、 kiaa0650 和 testhymin/糖皮质激素诱导成绩单 1 (glcci1) 在红细胞中神经系统无关的方式，表示，我们试图进一步了解如何在斑马鱼造血规管这些誊本。
Montalcino，斑马鱼模型高档进口染化卟啉病。
血红素生物合成途径的继承或获得性突变导致削弱类的疾病统称为 porphyrias，可以包括贫血、 皮肤光敏性和 neurovisceral 功能障碍的症状。造血的突变菌株的遗传屏幕，在我们孤立的斑马鱼的突变种，montalcino (mno)，其中显示了变色贫血和卟啉病。这项研究的目标是找出有缺陷的基因和斑马鱼突变表型的特点。
转铁蛋白-a 调节铁在斑马鱼胚胎中的表达。
铁规管激素铁介导上调回应铁负荷，但铁水平都感觉到其中的机制还不太清楚。大型斑马鱼的遗传屏幕造成一系列突变影响铁代谢与血红素合成的守恒的通路与变色贫血突变体的鉴定。我们假设: 转铁蛋白发挥了重要作用中铁运输, 和中铁在斑马鱼胚胎中的表达调控。在这里我们报告的识别与表征斑马鱼变色贫血突变体免疫联盟，其中展品转铁蛋白缺乏症由于转铁蛋白-a 的突变。Morpholino 组合式的转铁蛋白-a 在野生型胚中转载的贫血表型和减少体节和终端肠道铁染色，而共的转铁蛋白-a 题为 cRNA 注射部分恢复这些缺陷。转铁蛋白-a 与胚胎或转铁蛋白受体 (TfR2) 2 缺展出铁表达水平低，但是贫血、 没有缺陷的转铁蛋白通路，未能损害铁表达。这些数据表明转铁蛋白-a 运输铁和铁表达式受在斑马鱼胚胎中的转铁蛋白 a 依赖通路。
成人肾单位祖细胞能够肾再生的斑马鱼的标识。
肾功能的丧失是许多肾脏疾病的基础。哺乳动物可以部分弥补其 nephrons （肾脏的功能单位），但不能形成新的。相比之下，鱼损伤，提供可能产生耐药性激活模型对于理解如何哺乳动物肾再生后添加 nephrons 在其使用寿命和再生的 nephrons de novo 各地。在这里我们将跟踪新 nephrons 包含肾单位祖细胞的小细胞聚合到成年斑马鱼的来源。10-30 单元组成的单个聚合的移植是足以嫁接成人和生成多个 nephrons。串行移植实验来测试自我更新显示肾单位祖细胞寿命较长，和拥有巨大的繁殖潜力，与干细胞活性相一致。混合肾单位祖细胞移植标记与任一绿色或红色荧光蛋白产生了一些马赛克 nephrons，指示祖细胞肾单位多个贡献单肾单位。与此，实时成像显示肾性聚合形成由多个单元格的融合性和再分化为 nephrons 的透明幼虫在肾单位形成的相一致。两者合计，这些数据表明斑马鱼肾脏可能包含自我更新的肾单位干/祖细胞。这些细胞的识别铺平了道路隔离或工程中哺乳动物的等效单元格和发展新型肾再生疗法。
斑马鱼 Nephrogenesis 涉及动态时空表达变化在肾祖细胞和视黄酸和 Irx3b 的重要信号。
肾 nephrons 的执行中排泄的独特角色的近端和远端肾小管部分组成。建立肾单位部分身份从肾祖细胞的发展路径却不甚了解。在这里，我们利用斑马鱼鳜鱼研究肾单位分割。我们发现斑马鱼肾单位祖细胞通过部分命运之前进行精心的时空表达许多基因的变化。最初，肾单位前体细胞的两个域的建立，然后细分和划定个别肾单位线段。我们利用遗传和化学遗传模型的视黄酸 (RA) 虚，发现 RA 调节延髓前体细胞形成。来描绘下游通路，我们撞倒 irx3b 转录因子，并发现它规管近端小管段大小和末节分化。我们的研究结果表明模型即 RA 模式早期领域的肾单位祖细胞，随后因素与喜欢 irx3b 采取行动，改进以后的祖子域，确保部分特定基因程序激活。
Wt1a、 Foxc1a 和 Rbpj 的槽口调解员物理交互，并规管在斑马鱼中足细胞的形成。
足细胞帮助肾小球血液滤过屏障在肾和其损伤或损失会导致肾脏疾病的窗体。肾母细胞的肿瘤抑制因子-1 (Wt1） 和 FoxC1/2 转录因子，以及 Notch 信号，有牵连作为足细胞命运的重要监管机构。它不知道这些因素是否工作并行或按顺序上的不同基因目标，或高阶转录复合物作为共同的基因。在这里，我们使用斑马鱼胚胎治疗对 wt1a、 foxc1a、 morpholinos 或槽口转录调解员 rbpj 开发较少足细胞，由 wt1b、 hey1 和研究的表达，而在这些因素的任何两个有缺陷的胚胎完全缺乏足细胞演示。从 GST 下拉和 co 沉淀实验我们表明 Wt1a，Foxc1a 和 Rbpj 可以物理上彼此进行交互，而只有 Rbpj 将绑定到槽口胞内域 (NICD)。在反式激活基因检测 Wt1、 FoxC1/2 和国立传染病研究所的组合协同诱使 Hey1 启动子，，有 Podocalyxin 启动子，根据剂量添加剂或压制性的影响。两者合计，这些数据表明 Wt1、 FoxC1/2 和 Notch 信号集中在他们身体交流以规管足细胞特异性基因程序的共同目标基因。这些研究结果进一步我们负责足细胞形成和肾发育分化的转录电路的理解。
