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Articles by Rebecca A. Wingert in JoVE
JoVE General
La disección del riñón adultos de pez cebra
Department of Biological Sciences, University of Notre Dame
El riñón del pez cebra es el hogar de los renales y hematopoyéticas adultas células madre / progenitoras, y representa una oportunidad excepcional para estudiar estos tipos de células y su progenie en un organismo modelo de vertebrados. En este sentido, demostrar un procedimiento de disección detallada que permite al investigador identificar y extirpar el riñón del pez cebra adulto, que puede ser utilizado para aplicaciones tales como el aislamiento de células, los trasplantes, y los estudios de expresión de los riñones y / o poblaciones de células sanguíneas.
JoVE General
La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal
Department of Biological Sciences, University of Notre Dame
La lesión renal aguda (IRA) en los seres humanos es un problema clínico común causada por el daño a las células epiteliales que forman nefronas del riñón, y la lesión renal aguda se asocia con altas tasas de mortalidad del 50-70% 1. Tras la destrucción de las células epiteliales, las nefronas tienen una capacidad limitada de regeneración, aunque los mecanismos y las limitaciones que rigen este fenómeno se conoce bien. En este artículo de vídeo, describimos nuestra técnica de ablación láser dirigida de las células de la nefrona renal en el riñón del embrión de pez cebra, o pronefros. Nuestro nuevo método puede ser utilizado para complementar la nefrotoxicidad inducida por los modelos de IRA y obtener un conocimiento de alta resolución de la célula y las alteraciones moleculares que están asociados con la regeneración del epitelio de la nefrona renal.
Other articles by Rebecca A. Wingert on PubMed
El Pez Cebra Mutante Chianti Ofrece Un Modelo Para Eritroide Específica Alteración De Un Receptor De Transferrina
El hierro es un metal esencial para el desarrollo normal, siendo necesario para la producción de hemo, que se incorpora en los citocromos y hemoglobina. El chianti pez cebra (CIA) mutante se manifiesta una anemia hipocrómica microcítica después del inicio de la circulación embrionaria, indicativo de una perturbación en la producción de hemoglobina de los glóbulos rojos. Se demuestra que la CIA codifica tfr1a, que se expresa específicamente en la sangre y el desarrollo de único requisito para la absorción de hierro en los precursores eritroides. En el proceso de aislar el pez cebra TfR1, descubrimos dos TfR1-como los genes (y tfr1a tfr1b) y una sola ortholog TfR2. Derogación de la función tfr1b con morfolinos antisentido reveló que este paralog era prescindible para la producción de hemoglobina en los glóbulos rojos. morphants tfr1b exhibió retraso en el crecimiento y la necrosis cerebral, similar a los defectos en el sistema nervioso central observadas en el ratón nulo TfR1, indicando que se tfr1b probablemente utilizado por no eritroides tejidos para la adquisición de hierro. La sobreexpresión de ratón TfR1, ratón TfR2 y tfr1b pez cebra parcialmente rescatado hipocromía en los embriones cia, estableciendo que cada uno de estos receptores de transferrina son capaces de soportar la absorción de hierro para la producción de hemoglobina en vivo. En conjunto, estos datos muestran que el pez cebra y la función tfr1a tfr1b cuota de bioquímica, pero tienen dominios restringidos de expresión en el tejido, y establecer un modelo genético para estudiar la función específica de TfR1 en las células eritroides.
La Pérdida De GATA1, Pero No GATA2 Convierte La Eritropoyesis a Mielopoyesis En Embriones De Pez Cebra
La diferenciación de progenitores hematopoyéticos en eritroide o de linajes de células mieloides se cree que depende de los niveles relativos de los factores de transcripción y GATA1 PU.1. Mientras que la pérdida de la función de análisis muestra que GATA1 es necesario para la terminal de diferenciación eritroide, ningún estudio ha demostrado que la pérdida de GATA1 diferenciación mieloide altera durante la ontogenia. Aquí nos proporcionan pruebas in vivo que la pérdida de GATA1, pero no GATA2, transforma precursores primitivos de sangre en las células mieloides, resultando en una expansión masiva de neutrófilos y macrófagos granulocíticos a expensas de los glóbulos rojos. Además de este cambio destino, la expresión de muchos genes eritroides se encontró que era dependiente de diferencialmente GATA1 solo, en tanto GATA1 y GATA2, o independiente de ambos factores Gata, lo que sugiere que las vías múltiples regular la expresión génica eritroides. Nuestros estudios establecen una jerarquía de la transcripción de la dependencia del factor de Gata durante la hematopoyesis y demostrar que GATA1 desempeña un papel integral en la dirección de mielo-eritroides decisiones el destino del linaje durante la embriogénesis.
La Deficiencia De Glutaredoxina 5 Revela Fe-S Agrupaciones Se Requiere Para La Síntesis Del Hemo De Vertebrados
El hierro es necesario para producir hemo y el hierro-azufre (Fe-S) grupos, los procesos de pensamiento que se produzca de forma independiente. Aquí nos muestran que la anemia hipocrómica en Shiraz (sir) pez cebra mutantes es causada por la deficiencia de glutaredoxina 5 (grx5), un gen necesario para el montaje en la levadura grupo Fe-S. Hemos encontrado que grx5 se expresa en las células eritroides de pez cebra y ratones. El pez cebra grx5 rescató a la asamblea de la levadura grx5 Fe-S, que muestra que la función bioquímica de grx5 está conservado evolutivamente. En contraste con la levadura, los vertebrados utilizan la proteína reguladora de hierro 1 (IRP1) para detectar el hierro intracelular y regular la estabilidad del ARNm o la traducción de los genes del metabolismo del hierro. Hemos encontrado que la pérdida de la asamblea del clúster Fe-S en los animales señor activados IRP1 y bloquearon la biosíntesis del hemo catalizada por la sintasa de aminolaevulinate 2 (ALAS2). La sobreexpresión de ALAS2 ARN sin los 5 'elemento de respuesta de hierro que une IRP1 embriones rescatados señor, mientras que la sobreexpresión de ALAS2 incluyendo el elemento de respuesta de hierro no lo hizo. Además, antisentido desmontables de IRP1 síntesis de la hemoglobina restaurado señor embrión. Estos resultados descubren una conexión entre la biosíntesis del grupo hemo y los clusters Fe-S, lo que indica que la producción de hemoglobina en la celda de la diferenciación de color rojo está regulada a través del conjunto del clúster Fe-S.
Mitoferrin Es Esencial Para La Asimilación De Hierro Eritroide
El hierro tiene un papel fundamental en muchos procesos metabólicos, incluyendo el transporte de electrones, la síntesis de desoxirribonucleótidos, el transporte de oxígeno y de muchas reacciones redox que involucran hemoproteínas esenciales y proteínas Fe-S en racimo. Defectuosos resultados homeostasis del hierro en la deficiencia de hierro o de cualquiera de sobrecarga de hierro. Regulación precisa de transporte de hierro en la mitocondria es esencial para la biosíntesis del grupo hemo, la producción de hemoglobina y Fe-S ensamblaje de proteínas durante el desarrollo del clúster de glóbulos rojos. Aquí se describe un pez cebra mutante, Frascati (FRS), que muestra anemia hipocrómica profunda y la maduración eritroide, debido a defectos en el arresto la absorción de hierro mitocondrial. A través de la clonación posicional, nos muestran que el gen mutado en el mutante FRS es un miembro de la familia de vertebrados mitocondrial transportista soluto (SLC25) que llamamos mitoferrin (mfrn). mfrn es altamente expresado en los tejidos hematopoyéticos fetales y adultos de pez cebra y el ratón. Eritroblastos generados a partir de células madre embrionarias murinas nulos para Mfrn (también conocido como Slc25a37) muestra la maduración de detención con la incorporación de 55Fe gravemente deteriorada en hemo. La interrupción de los ortólogos de levadura mfrn, MRS3 y MRS4, causa defectos en el metabolismo del hierro mitocondrial y Fe-S nesis de los clusters. Murino Mfrn rescata los defectos en FRS pez cebra, y pez cebra mfrn complementa el mutante de levadura, lo que indica que la función del gen puede ser altamente conservadas. Nuestros datos muestran que las funciones mfrn como el importador principal de hierro mitocondrial esencial para la biosíntesis del grupo hemo en eritroblastos vertebrados.
Los Genes Cdx Y Control De ácido Retinoico El Posicionamiento Y La Segmentación De La Pronephros Pez Cebra
La función renal depende de la nefrona, que comprende un filtro de sangre, un túbulo que se subdivide en funcionalmente segmentos distintos, y un conducto colector. ¿Cómo surgen estas regiones durante el desarrollo es poco conocido. El pez cebra pronefros consta de dos nefronas lineales que se desarrollan a partir del mesodermo intermedio a lo largo de la longitud del tronco. Aquí nos muestran que, contrariamente al dogma actual, estas nefronas posee varios dominios de los túbulos proximales y distales que se asemejan a la organización de la nefrona de mamífero. Hemos examinado si la segmentación pronephric está mediada por el ácido retinoico (RA) y los caudales (CDX) factores de transcripción, que son conocidos los reguladores de la identidad segmental durante el desarrollo. La inhibición de la señalización de RA resultó en una pérdida de los segmentos proximales y una expansión de los segmentos distales, mientras exógeno tratamiento de la AR inducida destinos del segmento proximal a expensas de los destinos distantes. La pérdida de función causada CDX derogación de los segmentos distales, un cambio posterior en la posición de los pronefros, y alteraciones en los límites de expresión de RALDH2 y cyp26a1, que codifican enzimas que sintetizan y degradan la AR, respectivamente. Estos resultados sugieren que los genes cdx actuar para localizar la actividad de la AR a lo largo del eje, con lo que la determinación de donde se forma el pronephros. Consistente con esto, el defecto pronephric-posicionamiento y la pérdida del destino túbulo distal fueron rescatados en los embriones doblemente deficientes para cdx y RA. Estos hallazgos revelan un vínculo entre la novela de RA y las vías de cdx y proporcionar un modelo de cómo nefronas pronephric están segmentados y se coloca a lo largo del eje embrionario.
Reglamento Combinatoria De Expresión Nuevo Gen Eritroide En El Pez Cebra
La especificación y diferenciación de células madre hematopoyéticas en células rojas de la sangre requiere una coordinación precisa de múltiples factores de transcripción. La mayoría de los genes importantes para la maduración eritroide son regulados por la familia de Gata de ADN-proteínas de unión. Anteriormente, hemos identificado tres nuevos genes Kelch de repetición que contiene proteína (krcp), kiaa0650 y testhymin / transcripción inducible por glucocorticoides 1 (glcci1) que se expresa en las células eritroides de manera independiente de Gata, y tratamos de entender mejor cómo estas transcripciones están regulados durante la hematopoyesis pez cebra.
Montalcino, Un Modelo De Pez Cebra Para La Porfiria Variegata
Las mutaciones heredadas o adquiridas en la ruta de biosíntesis del grupo hemo conduce a una clase de enfermedades debilitantes conocidas colectivamente como porfirias, con síntomas que pueden incluir anemia, fotosensibilidad cutánea y disfunción neurovisceral. En un rastreo genético de mutantes hematopoyéticas, hemos aislado un pez cebra mutante, Montalcino (MNO), que muestra anemia hipocrómica y la porfiria. El objetivo de este estudio fue identificar el gen defectuoso y caracterizar el fenotipo de los mutantes de pez cebra.
La Transferrina, Una Modula La Expresión De Hepcidina En Embriones De Pez Cebra
La hepcidina hierro hormona reguladora es transcriptionally hasta reguladas en respuesta a la carga de hierro, pero los mecanismos por los cuales los niveles de hierro son percibidos no son bien entendidos. Las grandes pantallas de genética en el pez cebra se han traducido en la identificación de los mutantes de anemia hipocrómica con una serie de mutaciones que afectan a las vías conservadas en el metabolismo del hierro y la síntesis del grupo hemo. La hipótesis de que la transferrina desempeña un papel fundamental tanto en el transporte de hierro y en la regulación de la expresión de hepcidina en embriones de pez cebra. Aquí se presenta la identificación y caracterización del pez cebra mutante anemia hipocrómica, la Alianza GAVI, que presenta deficiencia de transferrina debido a mutaciones en la transferrina-a. Morpholino caída de la transferrina, una de tipo salvaje embriones reproduce el fenotipo y la disminución de la anemia y la tinción de somite terminal de estómago de hierro, mientras coinyección de la transferrina, una cRNA restaurado parcialmente estos defectos. Embriones con la transferrina o un receptor de transferrina 2 (TfR2) mostraron la deficiencia de los bajos niveles de expresión de la hepcidina, sin embargo, la anemia, en ausencia de un defecto en la vía de la transferrina, no poner en peligro la expresión de hepcidina. Estos datos indican que la transferrina un transporta hierro y que la expresión de hepcidina está regulada por una vía de transferrina-un-dependiente en el embrión de pez cebra.
Identificación De Los Progenitores Nefrona Adultos Capaces De La Regeneración Del Riñón En El Pez Cebra
La pérdida de la función renal subyace en muchas enfermedades renales. Los mamíferos, en parte puede reparar sus nefronas (las unidades funcionales del riñón), pero no pueden formar otras nuevas. Por el contrario, el pescado agregar nefronas durante toda su vida y regenerar las nefronas de novo después de la lesión, proporcionando un modelo para entender cómo la regeneración renal, los mamíferos pueden ser terapéuticamente activa. Aquí se puede rastrear la fuente de nuevas nefronas en el pez cebra adultos a los pequeños agregados celulares que contienen células progenitoras nefrona. El trasplante de agregados individuales que comprenden 10-30 células es suficiente para adultos se injertan y generar nefronas múltiples. Serial Experiments trasplante para poner a prueba la auto-renovación reveló que los progenitores nefrona son de larga vida y poseen potencial de replicación significativa, en consonancia con la actividad de las células madre. Trasplante de progenitores nefrona mixtos etiquetados, ya sea con proteínas fluorescentes verdes o rojos producido algunos nefronas mosaico, lo que indica que varios progenitores nefrona contribuir a una sola nefrona. Consistente con esto, la imagen viva de la formación de nefronas en larvas transparentes mostraron que los agregados nefrogénica se forman por la fusión de varias celdas y luego se diferencian en las nefronas. En conjunto, estos datos demuestran que el riñón del pez cebra contiene probablemente la auto-renovación de tallo nefrona / células progenitoras. La identificación de estas células allana el camino para el aislamiento o la ingeniería de las células equivalentes en los mamíferos y el desarrollo de nuevas terapias regenerativas renales.
El Pez Cebra Nefrogénesis Implica Cambios En La Expresión Dinámica Espacio-temporal En Progenitores Renales Y Señales Esenciales De ácido Retinoico Y Irx3b
Nefronas renales están compuestos de segmentos del túbulo proximal y distal, que desempeñan funciones únicas en la excreción. Las vías de desarrollo que establecen la identidad de los segmentos de la nefrona progenitores renales son poco conocidos. En este caso, hemos utilizado los pronefros pez cebra para el estudio de segmentación de nefronas. Se encontró que los progenitores de pez cebra nefrona someterse a complicados cambios en la expresión de muchos genes espacio-temporales antes de adoptar una suerte segmento. Inicialmente, los dos dominios de progenitores nefrona se establecen, a continuación, se subdivide y delimitar los distintos segmentos del nefrón. El uso de modelos genéticos genéticas y químicas del ácido retinoico (RA), la deficiencia, descubrimos que la AR modula la formación de células progenitoras rostral. Para delinear las vías descendentes, que derribó el factor de transcripción irx3b y me pareció que regula el tamaño del segmento proximal del túbulo y la diferenciación del segmento distal. Nuestros resultados sugieren un modelo en el que los patrones del campo con AR temprana de los progenitores de la nefrona, con elementos posteriores, como irx3b que actúan para refinar subdominios posteriores progenitoras y asegurar la activación de genes específicos de los programas del segmento.
Wt1a, Foxc1a, Y El Mediador Notch Rbpj Interactuar Físicamente Y Regular La Formación De Los Podocitos En El Pez Cebra
Los podocitos ayudar a formar la sangre barrera de filtración glomerular en el riñón y la lesión o pérdida conduce a la enfermedad renal. Supresor-1 del tumor de Wilms (WT1) y los factores de transcripción Foxc1 / 2, así como la señalización de Notch, han sido implicados como reguladores importantes de destino de los podocitos. No se sabe si estos factores trabajan en paralelo o de forma secuencial en los objetivos de genes diferentes, o en forma de complejos de orden superior de la transcripción de genes comunes. Aquí, nosotros usamos el pez cebra para demostrar que los embriones tratados con morfolinos contra wt1a, foxc1a, o el mediador de la transcripción Notch rbpj desarrollar un menor número de podocitos, según lo determine wt1b, Hey1 nefrina y de expresión, mientras que los embriones deficientes en cualquiera de estos dos factores carecen por completo de los podocitos . De GST-pull-downs y los experimentos de co-inmunoprecipitación se muestra que Wt1a, Foxc1a y Rbpj pueden interactuar físicamente con los demás, mientras que sólo Rbpj se une al dominio intracelular de Notch (INET). En ensayos de transactivación, combinaciones de WT1, Foxc1 / 2, y NiCd sinérgicamente inducir el promotor Hey1, y tienen efectos aditivos o represivos sobre el promotor Podocalyxin, dependiendo de la dosis. En conjunto, estos datos sugieren que WT1, Foxc1 / 2, y la señalización de Notch convergen en los genes diana comunes en los que interactúan físicamente para regular un programa de podocitos gen específico. Estos resultados aún más nuestra comprensión de los circuitos de la transcripción responsable de la formación de podocitos y la diferenciación durante el desarrollo del riñón.
