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Articles by Reeder Robinson in JoVE
JoVE Bioengineering
Monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di Flavin-Dependent monoossigenasi con Stopped-Flow Spettrofotometria
Department of Biochemistry, Virginia Polytechnic Institute and State University
Si descrivono l'uso di un stopped-flow strumento per studiare sia riduttive e ossidativo semireazioni di
Other articles by Reeder Robinson on PubMed
Associazione Substrato Modula L'attività Del Mycobacterium Smegmatis G, Un Monoossigenasi Flavina-dipendenti Coinvolti Nella Biosintesi Di Siderofori Hydroxamate-contenenti
Mycobacterium smegmatis G (MbsG) è un dipendente dalla flavina monoossigenasi che catalizza la seguente l'idrossilazione di H - e ossigeno-dipendente di NAD (P) del gruppo amminico terminale sulla catena laterale di l-lisina nel pathway biosintetico del mycobactin di sideroforo. Mycobactins sono essenziali per la crescita di mycobacterium sotto ferro-limitando le condizioni incontrate durante l'infezione nei mammiferi. Così, gli enzimi coinvolti nella biosintesi di mycobactin rappresentano potenziali bersagli di droga. MbsG è stato espresso in Escherichia coli e purificato utilizzando metallo affinità e cromatografie di scambio ionico. MbsG ricombinante rappresenta il primo membro di questa classe di enzimi isolato in forma attiva, con un cofattore FAD strettamente legato. Il valore di k(cat) per la formazione di l-lisina idrossilato in condizioni di steady-state era min(-1) 5.0, e sono stati calcolati i valori di K(m) di 0,21 mM per l-lisina, 1,1 mM per NADH e 2,4 mM per NADPH. L'enzima ha funzionato come un'ossidasi quando l'attività di MbsG è stata misurata mediante monitoraggio consumo di ossigeno in assenza di l-lisina, ossidanti NADH e NADPH con valori di k(cat) di min(-1) 59 e 49, rispettivamente. In queste condizioni, MbsG prodotto sia idrogeno perossido e superossido. Al contrario, quando l-lisina è stato presente, la reazione è diventato più accoppiata, producendo idrossilato l-lisina e diminuendo l'attività ossidasi. Questi risultati suggeriscono che associazione substrato modula la funzione di MbsG da un'ossidasi a un monoossigenasi.
Un Dosaggio Di Associazione Polarizzazione Di Fluorescenza Per Identificare Inibitori Delle Ossigenasi Flavina-dipendenti
N-hydroxylating ossigenasi (NMOs) sono essenziali per la patogenesi in funghi e micobatteri. NMOs catalizzano l'idrossilazione di lisina e ornitina nella biosintesi di siderofori hydroxamate-contenenti. Inibizione di chinurenina monoossigenasi (KMO), che catalizza la conversione di L-chinurenina 3-idrossichinurenina, allevia i disturbi neurodegenerativi come la Corea di Huntington e morbo di Alzheimer malattie e infezioni cerebrali causate dal parassita Trypanosoma brucei. Questi enzimi sono esempi di ossigenasi flavina-dipendenti, che sono obiettivi farmacologici validati. Qui, descriviamo lo sviluppo e l'ottimizzazione di un dosaggio di polarizzazione di fluorescenza per identificare potenziali inibitori di flavina ossigenasi. Molecole di ADP con etichetta fluorescente sono stati sintetizzati e testati. Un cromoforo ADP-TAMRA associato a KMO con un valore di K(d) di 0,60 ± 0,05 μM e di NMOs da Aspergillus fumigatus e Mycobacterium smegmatis con valori K(d) di 2,1 ± 0,2 μM e 4,0 ± 0,2 μM, rispettivamente. Il dosaggio è stato testato in esperimenti di legame competitivo con substrati e prodotti KMO e un NMO. Inoltre, abbiamo dimostrato che questo test può essere utilizzato per identificare inibitori della NMOs. Un Z'-è stato calcolato il fattore di 0.77 e ci mostrano che il saggio esibisce buona tolleranza a temperatura, tempo di incubazione e concentrazione di DMSO.
